Bu çalışmalarda, biz rejeneratif çalışmalarda kullanılmak üzere yeni, yenidoğan murin kardiyak iskeleleri için bir yöntem sağlamak.
The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.
Kalp yetmezliği yaygın ve ölümcül olduğunu. Bu organlara kan akışını bozar ve vücut karşılanmamış metabolik taleplerini bırakır kalp, azalmış kontraktilite ile sonuçlanan ilerleyici bir hastalıktır. 5,7 milyon Amerikalı kalp yetmezliği olduğu tahmin ve Amerika Birleşik Devletleri'nde 9 hastanede birincil nedenidir edilir. Amerika Birleşik Devletleri'nde kalp yetersizliğinde hastaların tedavisinde kolektif maliyet yıllık 9-10 başına 300 $ milyar doları aşmaktadır. son dönem kalp yetmezliği için tek kesin tedavi ortotopik kalp naklidir. Her yıl, 100.000'den fazla verici kalplerinde Birleşik Devletler 1-2'de kalp nakli işlemleri için gerekli olduğu tahmin edilmektedir. Nedeniyle donörlerin sınırlı sayıda için, sadece yaklaşık 2.400 nakli ABD 2 her yıl yapılmaktadır. Açıkçası, bu organ yetersizliği diğer stratejiler nakline için ek organları üretmek için gerekli olarak ele alınması gerekenreddi ve kullanım süresi bağışıklık bastırılması ile ilişkilidir komplikasyonları önlemek için yon ve ideal olarak, bu organlar otolog olabilir.
Memeli yetişkin kardiyomiyositlerde yaralanması üzerine sınırlı bir rejeneratif kapasitesini göstermek ama son kanıtlar memeli yenidoğan kalpleri yaralanma 5-8 aşağıdaki olağanüstü rejeneratif kapasitesini korumak olduğunu göstermektedir. Özellikle, kısmi cerrahi rezeksiyon sonrasında bir rejeneratif pencere doğum ve doğum sonrası gün arasında bulunmuştur 7. Bu rejeneratif dönemi fibrotik skar eksikliği, neovaskülarizasyon oluşumu, epicardium gelen anjiyogenik faktörlerin salınımı, kardiyomyosit çoğalması 5-8 ile karakterizedir 11. Bu zaman reaktif pencere biyoyapay kalbin gelişiminde malzemenin yeni bir kaynak olarak yenidoğan kalp kullanarak potansiyel sağlar.
hücre dışı matris cardiomyocyt teşvik etmek için önemli ipuçları sağlamak için bilinene çoğalması ve büyümesi. Yenidoğan ve yetişkin matrisler 12 ve yenilenmesini teşvik etme yeteneği moleküllerin durumu belirgin farklılıklar 13 araştırılmıştır. Hücresizleştirilmiş yetişkin matrisler hücre yeniden popüle bir ECM iskele ve biyosentetik bir kalp üretimi temin etmek üzere çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. kök hücre teknolojileri bu çalışmalar ve yeni keşifler, hızla ilerleyen ederken, birkaç engeller yerine getirilmesi için henüz. Örneğin, matris duvara matrisin doğal yapısını, hücre entegrasyon korunmasında sınırlamalar ve yeteneği bu yaklaşımın başarısı çoğalmasına ve büyüme tüm sınır desteklemek. Üstün rejeneratif özellikler yenidoğan kalp atfedilen olsa da, böyle bir doku kullanarak pratik yönleri onun keşif sınırlıdır.
Yenidoğan kalp gösterdi rejeneratif kapasitesi dayanarak, bir geliştirerek yeni matris geliştirdikP3 fare kalp için Decellularization tekniği. Daha önce 6 belirlenir, ancak kalp hasat, decellularize ve recellularize için yeterince büyük olduğu gibi kardiyak rejenerasyon pencere içinde olduğu gibi P3 kalp bu çalışmalar için seçildi. Bu çalışmanın amacı, bir yenidoğan fare kalp bir matris oluşturmak fizibilite göstermektir. Çalışmalarımız ECM yapısal ve proteinli bütünlüğünü koruyarak bir dakika, yenidoğan kalp decellularizing fizibilitesi için kanıt. Biz de MCherry ifade eden kardiyomiyositlerinin bu kalp ECM recellularize yeteneğini göstermek ve recellularization aşağıdaki çeşitli kardiyak belirteçlerin ifadesi için bu kardiyomiyositlerde inceledik. Bu teknoloji, bir biyosentetik kalbin gelişiminde neonatal matrisin üstünlük denemeden geçirilmesine izin verecektir.
Kalbin tekrarlanan perfüzyonları bu tekniğin bağımlılığı bir emboli kaçınma başarılı bir sonuç önemli bir bileşeni yapar. Adımlar 2,8-2,14 arasında çözümün değişikliklere Adımlar 2,2-2,6 kalbin ilk kateterizasyon itibaren, hangi taviz miyokard içine perfüzat akışını hava kabarcıklarının giriş izin verebilir manipülasyonlar vardır. Nedeniyle yenidoğan kalp küçücük boyutuna, damarsal bile dakikalık kabarcıklar böylece eksik decellularization render, bir teknik infarkt neden ol…
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.
1. Materials For Mouse Heart Isolation | |||
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
#5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
2. Materials For Decellularization | |||
Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
22g x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
22 x 1 g needle | BD | 305155 | or equivalent |
PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended |
1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
1X Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
3. Materials For DNA Quantitation | |||
Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30U/mg activity |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
MgCl*6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
4. Method for fixation and sectioning of tissue. | |||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
5. Method for tissue histology | |||
Cryomolds 10 x 10 x 5mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating. | |||
HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
HEPES (1M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
50 mL tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |