Introduction
生物活性小分子は、基本的に、細胞内で相互作用し、1つ以上の「標的」分子は、最も一般的にタンパク質の機能を変化させることにより動作します。活性化合物は、表現型スクリーニングによって発見されたときに薬物の発見では、その化合物の分子標的（複数可）の同定は作用機序および化合物の潜在的な副作用を理解するためだけでなく、潜在的に発見するためだけではなく、非常に重要です新しい生物学疾患モデルの基礎となると治療1の新たな機構的なクラスの開発のための道を開きます。標的の同定は、治療に使用する薬剤のために必要とされていないが、近年では、検証対象が既知であれば、新規薬剤候補は、臨床試験に成功し、そのための投資でより良いリターンをもたらす可能性がより高いことを増加の認識がありました2。したがって、小さな同定するための方法に関心がありました分子標的タンパク質。
古典的な標的の同定実験は、典型的には、対象の小分子は、樹脂上に固定化され、非結合タンパク質が洗い流され、残りのタンパク質が溶出し、3を識別された後、全細胞溶解物とともにインキュベートされるアフィニティー精製に依存しています。この技術は、多くの小分子4の標的を同定するために使用されているが、それはいくつかの理由のためにユニバーサルターゲットID方式としては不向きです。まず、標的タンパク質は、小分子に結合する能力を保持するために、細胞溶解の際に、その天然のコンフォメーションを保持しなければなりません。これは、多くの場合、それらの天然の環境から取り出された後、コンフォメーション変化を受ける、または単に凝集し、溶液から沈殿する膜タンパク質のために特に問題となり得ます。第二に、小分子は、化学的に維持しながら、樹脂に固定化することができるように修正されなければなりません標的タンパク質に結合する能力。それを樹脂に固定された後ディープ結合ポケットは、したがって、小分子にアクセスできなくなる可能性があります。第三に、結合親和性は、相互作用が低い親和性相互作用の識別が困難に、洗浄工程の間に維持されていることを十分に高くなければなりません。第四に、例えば、pH、イオン濃度、または他の内因性分子の存在などの環境条件は、細胞内で空間的に変化させることができ、そして時には薬物 - 標的相互作用のための前提条件です。したがって、許可および細胞外の結合を維持するための正しい条件を見つけることは試行錯誤のかなりの量を必要とすることができます。
光親和性標識は、小分子と細胞の天然コンテキスト内でその目標の共有結合を可能にすることにより、これらの問題を回避します。むしろ大きなかさばる樹脂への小分子を固定化するよりも、分子ではなく、化学的に二つの小さな機能グラムをインストールするように修正されますroups：特定の波長の光を照射すると、標的タンパク質に共有結合架橋を可能にする光活性成分、および標的タンパク質が検出され、続いて単離することができ、レポーター基。生細胞は、プローブが結合し、共有結合標的タンパク質に架橋し、プローブ - タンパク質複合体を単離し、無傷で、光親和性プローブで処理されます。標的に結合するプローブの特異性は、親化合物の過剰が、標的タンパク質に対するプローブの結合離れて競合するために使用される並列で競合実験を行うことにより実証されます。
光親和性プローブの設計と合成は1、小分子から別のものに大きく変化し、このプロトコルではカバーされません。しかし、件名にいくつかの優れた議論が5-9を公開されています。主な考慮事項はpresumab従って、プローブは、親化合物の生物活性を保持することですLY同じ対象（複数可）に結合します。構造活性相関（SAR）研究は、分子の部分は生物活性の損失なしに変更することができるかを決定するために実行されなければなりません。別の化学基の種々は、それぞれ長所と短所10を有しているジアジリン、ベンゾフェノンおよびアリールアジドを含む光活性架橋剤として使用されてきました。同様に、プローブの結合タンパク質を単離するために使用されている複数のレポータータグがあります。レポーター基は、一般的に使用されるビオチンまたは蛍光タグのように、自分で機能的であってもよいし、小さく、生物活性11を危うくすることがにくいという利点を有する光架橋工程の後にさらなる官能化を必要とする前駆体であってもよいです。
このプロトコルでは、我々は、Cu（I）-catalyz介しジアジリンの光架橋基を含有する光親和性プローブ、およびレポーター基の結合のための末端アルキンを使用していますEDアジド-アルキンシャープレス-ヒュイゲンの環（またはクリック）反応12-15。 SAR研究、プローブ設計と合成、およびこれらの研究の結果は、他の場所で16-18を発表されています。
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Protocol
注：このプロトコルは、生細胞での使用のためにマッキノンとトーントン10から適応されました。
培養細胞の調製
- （下記参照）を所望のサンプル数のための無菌6 cmの細胞培養皿を準備します。
注：細胞の一皿は、処理条件ごとに使用され、より多くのタンパク質が必要な場合は2または3皿を条件ごとに調製し、UV照射後に組み合わせることができます。- 細胞の少なくとも3皿を準備し; DMSOのみ（D）、プローブ処理のみ（P）、およびプローブ+競合物（C）と陰性対照。
- 必要に応じて、プローブで処理されたが、UV光にさらされないべきなしUVコントロールとして4 番目の皿を、準備します。
注：複数の競合分子は、このような関心の小分子の異なる類似体として、試験する場合は、必要に応じて追加の競合プレートを準備します。
- 4mlの培地で培養皿にHEK293T細胞を加えます。 350万Cを使用しますプレート当たりells。
注：細胞は、実験の開始時に、ほぼ100％コンフルエントになるように細胞数が最大タンパク質収量を達成するために、各細胞型のために決定されるべきです。 HUVECは、プレート0.3万個の細胞を使用しています。良い近似がコンフルエント15cmの皿に細胞の1/10です。 HEK293T細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地で培養する必要があり、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。 - 一晩培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）に細胞を戻します。
細胞および光架橋の2治療
- 翌日、前アリコート1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに以下の薬剤：
- 最初の治療のために、1管に2チューブおよび10mMの競争相手（ すなわち、変更されていない親化合物）の4μlにDMSOの4μlを添加します。
- 二回目の治療のために、1チューブにDMSOの16μlを添加し、50＆の16μlの＃181; 2チューブにMの光親和性プローブ。
注：最適濃度は（議論を参照）異なるプローブごとに異なるかもしれないが、200から500の間nMでは（ここでは200 nMのを使用します）良い出発点です。競合相手の濃度は、プローブの少なくとも20倍（ここでは10μMを使用）のものを超えている必要があります。 DMSOの最終濃度は、全てのプレートで同じであるべきで、0.5％（20μl容量）を超えてはなりません。
- 細胞培養フード内に細胞プレートを持参し、次のようにステップ2.1.1から事前等分し薬を追加：培養培地の吸引除去1ミリリットル、メディアで事前に小分け薬を再懸濁し、穏やかにプレート降下に戻ってそれを追加します賢いです。 DMSO（D）プレートとプローブ（P）プレートにDMSOを追加し、競争（C）プレートに競技者を追加します。 30分間培養インキュベーターにプレートを返します。
- 淡色培養フード内のライトで、プローブするステップ2.1.2から事前に小分けプローブを追加（P）との競争（C）プレートと追加上記のようにDMSO（D）プレートにDMSO、。 1時間培養インキュベーターにプレートを返します。
- インキュベーションの間、以下の項目を準備し;プレートのすべてに適合することができます氷の皿;氷冷溶解緩衝液（PBS [pHを8.5] + [水の中に作られた50倍ストック溶液から希釈した完全無EDTA、] 1×プロテアーゼ阻害剤カクテル、200μL/プレート）。マイクロ遠心チューブを氷上で、異なる処理条件ごとにD、P、またはC標識。
- 1時間のインキュベーションの終了前15分は、低温室でUVランプ（365 nm）を設定し、電球をウォームアップするためにそれをオンにします。
- プローブと1時間インキュベートした後、氷の上に皿を置きます。過剰のプローブを除去するために穏やかに5mlの氷冷PBS（pH7.4）で細胞を洗浄します。 4ミリリットルの氷冷PBSで細胞を再カバーしています。
- ランプからの加熱を最小限に抑えるために氷パックの上にUVランプの下で3センチメートルを中心とした細胞の皿を置きます。 3分間照射します。氷のトレーに皿を削除し、すべてのサンプルについて繰り返します。
- AFTER照射、細胞からPBSを吸引し、各プレートにプロテアーゼ阻害剤との氷冷PBS（pHは8.5）の200μlを添加します。氷上で予め標識マイクロ遠心チューブにゴムスクレーパーと転送を使用して、細胞をプレートから外します。
- （サンプル250μlの中に10％SDS10μlの）0.4％の最終濃度までSDSを追加します。
注意：SDS粉末は危険です。鼻と口の上にマスクを身に着けていることによってSDS粉末を吸入しないでください。 - 細胞を溶解し10パルス（出力1、デューティ・サイクル30％）のためのサスペンションを超音波処理することにより、10パルスの第二ラウンドの前に1分間氷上でインキュベートします。
- 必要に応じて、サスペンションの2μLを削除し、完全な細胞溶解を確実にするために、光学顕微鏡下で確認してください。
- 細胞溶解を完了し、すべてのタンパク質を変性させ、5分間95℃に設定したホットプレート上のサンプルを沸騰させます。
- 例えば番目として、分光光度洗剤互換タンパク質アッセイを用いて、各試料中のタンパク質濃度を測定750 nmでの吸光度を測定するように設定され分光光度計を用いて、製造業者の指示に従って、E DCタンパク質アッセイ19、。
- 必要に応じてPBS pHを8.5 + 0.4％SDSを添加することによって2.5 mg / mlとし、タンパク質濃度を標準化（または濃度である場合よりも低いの2.5mg / mlの、最も低いタンパク質濃度を有するサンプルを正規化する）（例えば、サンプルが5である場合に250μlの中mg / mlでは、）を2.5mg / mlの最終濃度を得るために、PBSのpHは8.5 + 0.4％SDS250μlのを追加します。
標識タンパク質の可視化のためのクリックケミストリーにより蛍光タグの3別紙
- 細胞溶解物の40μlのを削除し、新しいマイクロチューブに移します。ビオチンアジド（ステップ4）との反応のための残りの溶解物を保管してください。
- 順番に以下の試薬を追加します：0.2μlのフッ素 - アジド（DMSO中の1mMストック溶液）、0.58μlのTCEP（100 mMストックを水にNaOHを加え、4当量で、新たに調製）、および3.38μlのTBTA（1。DMSOにt-ブタノールの1の比率）：4で7 mMストック。ミックスする渦。
- 反応を開始するために、1.14μlののCuSO 4・5H 2 O（水中50mMの）を追加します。簡単にボルテックスし、暗所で30分間室温でインキュベートします。
- 反応をクエンチするために2×SDSサンプル緩衝液50μlを加えます。この時点で、一晩必要に応じて-20℃で最良の結果、またはストアのSDS-PAGEゲル20上で直接サンプルを実行します。
- サンプルを凍結した場合、ゲルにロードする前に95℃で5分間再加熱。
注：標的タンパク質の分子量は、典型的には、この段階では知られていないので、それは別のアクリルアミド濃度の2ゲルを実行することが推奨される（ すなわち 、8％および15％）、または広い分子量範囲の勾配ゲル（ すなわち、 4〜15％）は、完全な分子量範囲を確保します。 - 色素の先端がゲルの末端に到達したときに、過剰unreacteのすべてを確実にするために、さらに5分間ゲルを実行し続けますDフッ素アジドは、ゲルを完全に終了しました。
- ddH 2 Oで容器にゲルを削除し、すべての過剰フルオロ-アジドを洗い流すために、穏やかに攪拌しながら10分間インキュベートします。
- ガラス板上にゲルを置き、製造元の指示に従って台風蛍光ゲルスキャナーを用いてゲルをスキャンします。
標識されたタンパク質のアフィニティー精製のためにクリックケミストリーによって、ビオチンタグの4別紙
- ステップ3.1からの残りの溶解物の、2.5に正規化した後、mg / mlで得られた試料の体積は500を使用し、500、550、および600μlのであれば全てのサンプルは、例えば、同じボリューム（あるように、タンパク質の正規化後最大量を使用します各μlの）。
- PBS（pH7.4）で50μlに高容量ストレプトアビジンアガロースビーズ、プレ洗浄2回追加することにより、溶解物をプレクリア。回転させながら4℃で1時間インキュベートします。
- 3分間千×gでの遠心分離によってビーズをペレット。トンを削除します彼は氷の上で新しいマイクロチューブに上清およびビーズを捨てます。
- 「入力」と表示された新しいチューブにDMSOサンプルの百分の1から2を削除してください。 -20℃での2×SDSサンプルバッファーとストアの同等のボリュームを追加します。
- 溶解液500μlのあたり、以下の試薬を追加します。1.38μlのビオチン - アジド（DMSO中の10mMストック）を、5.5μlのTCEP、および32.5μlのTBTA。ミックスする渦。
- 11μlの簡単溶解液と渦500μlのあたり・5H 2 OのCuSO 4を追加します。室温で30分間インキュベートします。
- -20℃に冷却し、アセトンの4サンプル容量を追加します。ボルテックスのサンプルと完全にタンパク質を沈殿させ、未反応のビオチンアジドを除去するために、-80℃で一晩インキュベートします。
- 遠心分離機は、4℃で15分間、17000×gでサンプルが沈殿したタンパク質をペレット化します。
- 完全に上清を吸引除去し、150μlのPBS（pH7.4）で+ 1％SDS中での超音波処理によりタンパク質を溶化。
- 30μlの予め洗浄した高容量ストレプトアビジンアガロースビーズにサンプルを追加し、回転させながら4℃で1時間インキュベートします。
- 3分間千×gでの遠心分離によってビーズをペレット。非結合タンパク質を含む上清を吸引し、廃棄します。
- ビーズに洗浄緩衝液（400mMの塩化ナトリウム、50mMトリス、0.2％SDS、pH7.4）中の1ミリリットルを追加し、回転させながら室温で5分間インキュベートします。
- 繰り返しは、4.12と4.13を3回繰り返します。
- ビーズから完全に洗浄緩衝液を吸引し、2×SDSサンプル緩衝液30μlを追加します。
- ビーズからタンパク質を放出するために95℃のヒートブロックで5分間インキュベートします。
- 室温で13,000×gで1分間、ビーズを遠心分離。
注：この時点で、サンプルは、SDS-PAGEを実行する準備ができるまで-20℃で保存することができます。サンプルを凍結する場合、使用前に95℃で5分間再加熱。 - 慎重にビーズのオフタンパク質を含む試料緩衝液をピペット、およびSDS-PAGE 20にロード（以下、重要な考慮事項を参照してください）。ビーズは、必要に応じて後で再沸騰のために保存することができます。
注：銀染色によるタンパク質の検出のために、良好な結果を1mm厚さのゲルを用いて得られます。バンドは、質量分析（MS）分析のための銀染色ゲルから切り出しする場合は、滅菌溶液からの新鮮な全ての試薬を準備し、ゲル上のサンプル間でよく空のままにしておきます。その背景タンパク質が減算することができるので、プローブ車線からカットごとの帯域については、並列スライスはDMSOレーンから取得する必要があります。ウェスタンブロットによるタンパク質のIDを検証するためには、SDS-PAGEゲルを実行するときにもステップ4.4からの入力サンプルをロードすることが重要です。 - 標的タンパク質（複数可）を検出するための銀染色21またはウェスタンブロット22のいずれかのための標準プロトコルに従ってください。
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Representative Results
ここに示す結果は、抗真菌薬のイトラコナゾールの光親和性プローブ、以前に16を公表されたを使用して得ました。これらの結果は、正常に35 kDaの膜タンパク質電位依存性陰イオンチャネル1（VDAC1）などの主要なイトラコナゾール結合タンパク質を同定するための生細胞光親和性標識技術の使用を実証します。
上記のプロトコルは、競合分子として光標識および非修飾イトラコナゾールためのイトラコナゾールのプローブを用いてHEK293T細胞で行いました。記載されるように試料を調製した後、それらは分子量によってタンパク質を分離するために、SDS-PAGEに供しました。左側の分子量マーカー単位はキロダルトン（kDaの）です。最初のレーンは、DMSOコントロール試料（D）であり、第二のレーンは、プローブ試料（P）であり、第3レーンは競合サンプル（C）です。バンドのpDMSOのみのレーンに憤慨背景と考えられています。結合タンパク質、その特定の点に注意してください、これらのデータを分析する際に、プローブ試料中に存在するとの競争のサンプルで減少し、DMSOコントロール試料中に存在しないはずです。この場合、主タンパク質バンドは、プローブ試料は、約35キロダルトンのバンドであった（ 図1および3）、VDAC1などの質量分析により同定されたのみで検出されました。このタンパク質の同一性は、特定のVDAC1抗体を用いたウエスタンブロットにより、図5で確認されました。まとめると、これらの結果は、私たちはVDAC1は、これらの細胞におけるイトラコナゾールの主要な結合タンパク質であると結論することができます。
図1は、蛍光タグで標識した後、タンパク質の可視化を実証する（プロトコールのステップ3から）; 図3は、ビオチンタグおよびPEで標識した後、銀染色によるタンパク質の可視化を実証します （プロトコールのステップ4から）rformingアフィニティー精製; 図5は VDAC1に特異的な抗体を用いてタンパク質IDの検証を示しています。2と4は、プロトコルにおける特定のステップは、（図の説明文に記さ）正しく行われていない場合は何が起こるかを例示する図 。
図1（ プロトコールのステップ3から）の代表的な蛍光スキャンしたSDS-PAGEゲル D = DMSOのみ。 P =プローブのみ（200 nM）を、 C =競争（10μM）。左側の分子量マーカー単位はキロダルトン（kDaの）です。プローブレーンに特異的に存在であり、それは特異的結合タンパク質であることを示す、離れて余分な親化合物による競っれる主要な光標識タンパク質バンドで約35 kDaの矢印をポイントします。529 / 54529fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. 蛍光スキャンしたゲル。過剰フッ素アジドは完全に大きな黒いスミアがゲルの下部に表示させる、（3.6および3.7ステップ）ゲルから削除されていない。 拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。
図3（ プロトコールのステップ4から）ビオチンプルダウン後の代表的な銀染色SDS-PAGEゲル。その後、切り出した図1に可視化された同じバンドへの矢印は、ゲルからおよびタンパク質同定のためのMS分析に供しました。左側のマーカー単位はキロダルトン（kDaの）です。ゲルローディングとバンド切除時のサンプルの交差汚染を避けるために、中間の各レーンの空のスペースに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. 銀染色。非常に高いバックグラウンド染色と銀染色ゲル、原因ビーズ（ステップ4.13）の不十分な溶解物のプレクリア（ステップ4.2）および/ または洗浄します。また、レーン間のスペースの不足に注意してください。左側のマーカー単位はキロダルトン（kDaの）である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。。
（プロトコールのステップ4から）ビオチンプルダウン後VDAC1としてMSによって同定光標識35-kDaタンパク質の 図5. ウエスタンブロットは、。信号は、プローブのレーンに存在し、 図1のように 、競争車線に減少3、VDAC1、タンパク質の同一性を確認しました。 （工程4.4からの）入力画分は、抗体の機能と目的のタンパク質を溶解物中で検出することができるように、プルダウン試料と一緒に実行されることが重要です。分子量のわずかな増加は、共有結合したプローブの追加サイズにプルダウンサンプルで観察することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
薬剤の細胞表現型は、それらの既知の機能に基づいて、その潜在的なターゲットを絞り込むために使用されるトップダウン、またはボトムアップ、ターゲット：小分子の標的を同定するために、異なるアプローチは、大きく二つのカテゴリーに分類することができます化学的または遺伝的手段3によって直接識別されます。トップダウンまたは表現型の研究では、小分子の究極の表現型の基礎となる可能性がある薬剤（ 例えば 、転写/翻訳/ DNA合成、細胞周期のブロック、経路の活性化/シグナル伝達阻害、 など ）によって影響を受ける特定の細胞プロセスを識別することができ、これこれらのプロセスに関与するタンパク質への潜在的なターゲットのリストを絞り込むことができます。しかしながら、トップダウンアプローチの主要な欠点は、すでにこれらのプロセスについて知られているものに依存し、したがってその機能が特徴付けられていない、または以前に関与することが記載されていない標的に対して付勢されていることです与えられたプロセスインチ
ボトムアップ・アプローチは、公平な方法で直接ターゲットを識別することによって、この問題を回避します。これは、遺伝的手段により達成することができます。例えば、薬物耐性または過敏性を付与するノックダウン細胞株についてのshRNAライブラリーをスクリーニングすることによって、または薬剤耐性細胞株を単離し、突然変異1を含有する遺伝子を決定するために、ゲノム配列決定を使用して。実験のこれらのタイプは、薬物の活性に関連する重要なタンパク質または経路を同定することができるが、必ずしも同定されたタンパク質に結合する直接証明していません。化学的アプローチは、一方で、典型的には直接、標的タンパク質に結合し、その単離および同定を可能にするために、化学的プローブの使用を含みます。標的タンパク質に結合する能力を保持するプローブを設計することは、活性の有意な損失なしに変更することができる分子上の位置を識別するためのSAR研究の使用を必要とします。それALSoは、プローブが共有結合またはそれが他の細胞タンパク質（ すなわち、親和性精製された）から単離することができることは十分に高い親和性でその標的に結合することができることが必要であり、これらのタンパク質は、その天然の外側に小分子を結合する能力を保持すること細胞環境。この要件は、特定の標的に対して問題となる可能性があります。例えば、内在性膜タンパク質は、多くの場合、それらの活性コンフォメーションを維持するために特定の脂質環境を必要とし、凝集または不適切に細胞が溶解されると、リガンド結合のための配向になることができます。その後の操作は、薬物-標的相互作用10を中断することができないように、この原稿に記載された方法は、天然の細胞環境内の標的タンパク質の共有結合修飾を可能にすることによって親和性精製の これらの潜在的な落とし穴を回避します。
記載されたプロトコルの実装を成功させるには、いくつかの要因に依存します。それがtaことが重要です小分子の目標確認タンパク質が光標識のために選択された細胞型において十分に豊富です。最も強力な小分子により影響を受ける細胞型は、良好な出発点であることができるが、高い標的タンパク質の収量を有するものを見つけるために、複数の異なる細胞型をテストする必要があるかもしれません。バックグラウンド標識を減少させながらあるいは、細胞下分画により異なるタンパク質集団の富化は、標的収量を増加させることができます。蛍光標識されたタンパク質の検出は、銀染色により、一般的にはるかに敏感タンパク質検出よりも、したがって、蛍光によって検出されたバンドは、ビオチンプルダウンした後、銀染色によって検出可能ではないかもしれません。処理条件当たりのセルの複数の皿を使用して実験をスケールアップすると、この検出問題を克服するために助けることができます。プローブの濃度を増加させることも、プルダウン収率を向上させるのに役立つことができます。具体的なバンドはまた、高いバックグラウンドによって不明瞭にすることができ、この場合、より厳格洗濯、複数の前でステップをクリアする、または（例えば、代わりに、アガロースの磁気ビーズなど）異なる組成のビーズの使用が役に立つかもしれません。標的タンパク質が豊富で低すぎる場合は、銀染色によって検出することができないかもしれません。標的タンパク質は、（そのような高度にグリコシル化タンパク質など）をSDS-PAGEに鋭いバンドとして移行されない場合はさらに、また、視覚化することがより困難になります。プロトコルのさらなる修飾は、帯域をカットする必要がなくなり、このようなプルダウン後に標識されたタンパク質を同定するために全サンプルプロテオミクスまたはSILAC（細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識）を実行するように、これらの問題を克服するために行うことができます銀染色ゲル。
別の重要な考慮事項は、実験で使用するプローブの濃度です。理想的には、検出可能なシグナルを生成するプローブの最低量は、使用されるべきです。より高い濃度は、より高い信号ではなく、より高いバックグラウンド標識を与え、一度すべてのOますなる最も高い親和性の標的上の結合部位が飽和fを検出することを開始する追加の低い親和性の目標があるかもしれません。最適濃度は、したがって、比較的高濃度（1-2μM）で始まり、1つまたは2つのタンパク質を標識し、競争が明らかであるされるまで、バック滴定することにより経験的に決定されるべきです。
プローブの効力は、開始濃度を選択する際に考慮することができます。しかし、ターゲット豊かさと抑制のモードに応じて、プローブの活動と目標検出との間に良好な相関関係がないかもしれません（例えば、低ナノモル阻害を有するプローブは、必ずしも検出可能で、低ナノモル濃度で十分なタンパク質をプルダウンしません）。したがって、実験的読み出しとして標識されたタンパク質の検出を使用して、最も適切な濃度を決定することが好ましいです。使用競合相手の濃度は、によって、プローブのそれを超えている必要があります少なくとも20倍、しかし介護も競合他社の溶解限度を超えないように注意する必要があります。
複数のタンパク質プローブによってプルダウンされた場合に、機能的に関連するタンパク質の同定は、より複雑になります。しかし、潜在的な標的タンパク質を絞り込むためにいくつかの方法があります。前述したように、プローブ濃度をバック滴定すると、標識化の特異性を向上させることができます。プローブの濃度が低下すると低い親和性タンパク質は消えるはずですしながら、より高い親和性結合タンパク質は、それらの信号強度を保持すべきです。複数の潜在的なターゲットのデコンボリューションはまた、活動の程度が異なる親化合物の化学的類似体の使用によって支援することができます。理論的には、機能的に関連する目標のために、アナログの目標と活動への結合との間に相関関係があるはずです。例えば、親化合物の不活性類似体による競合は、p結合を排除するために使用することができ化合物の表現型効果に関与していないroteins。同様に、親化合物と同様の表現型を誘導する活性な類似体、または他の小分子は、関連する結合タンパク質でルールを助けるために使用することができます。同じラインに沿って、非アクティブまたは構造的に無関係な光親和性プローブの使用は無関係なタンパク質を排除することができます。
標的タンパク質の検証は、最初のMSによって同定されたタンパク質の検証が必要です。これは、容易に、標的タンパク質のための高品質の抗体が利用可能であると仮定すると、ビオチンプルダウン以下のウェスタンブロットによって行うことができます。不慣れなタンパク質で作業する場合しかし、悪い抗体にかなりの時間とお金を無駄にすることは容易です。抗体を検証することが重要であり、それは細胞の溶解物中の特異的なバンドを検出した標識（ すなわち、入力サンプル）のために使用されています。また、プルダウン後のタンパク質の収率が低くなる可能性があるため、アリibodyは非常に敏感である必要があり、かつ抗体に応じて、高濃度が必要な場合があります（最大1：いくつかのケースでは100希釈）。これらの問題を回避するために、タンパク質のタグ付けされたバージョンは、光標識の前に細胞内で発現させることができ、タグは、その後、プルダウン後のタンパク質を検出するために使用することができます。
タンパク質のIDが確認されると、標的の機能的検証は、標的の活性は、小分子の結合によって影響されることを示すために、遺伝的および/または薬理学的操作、または関心対象の機能的アッセイによって達成することができます。結合部位は、プローブによって修飾されたアミノ酸の同定、またはX線結晶学又はNMR分光法により結合された小分子の3次元構造を決定することによってマッピングすることができます。変異体は小分子に結合する能力を失うことがわかる場合、野生型プロの代わりに発現された場合に理想的には、小分子の活性を廃止することができるはずTEIN。また、他の構造的に関連する、または「オフターゲット」タンパク質上の標的への結合の特異性を示すことが望ましい場合があります。
この一般的なプロトコルは、プローブは、親化合物の生物活性を保持して作製することができる限り、小分子結合タンパク質の標的への直接測定を必要とする任意の用途に使用することができます。潜在的な用途は、新規化合物の分子標的を同定するオフターゲット既存薬の可能性を調査し、目的の特定のタンパク質の小分子の直接結合を確認し、で他の小分子による結合の競合を決定する、これらに限定されないが、同じ結合タンパク質上のサイト、および天然由来または内因性リガンドの新しい受容体を発見します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C. |
| Copper Sulfate (CuSO4•5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20 °C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2x) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
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