Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

Introduction

de petites molécules bioactives fonctionnent fondamentalement par interaction avec et en modifiant la fonction d'une ou plusieurs molécules "cibles", le plus souvent des protéines dans la cellule. Dans la découverte de médicaments, quand un composé actif est découvert par le dépistage phénotypique, l'identification de la cible moléculaire (s) de ce composé est crucial, non seulement pour comprendre le mécanisme d'action et les effets secondaires potentiels du composé, mais aussi pour éventuellement découvrir nouvelle biologie sous - tend le modèle de la maladie et ouvrant la voie pour le développement de nouvelles classes mécanistiques de la thérapeutique ^1. Bien que l'identification des cibles est pas nécessaire pour un médicament à être utilisé en thérapeutique, ces dernières années, il y a eu une reconnaissance croissante que les nouveaux médicaments candidats sont plus susceptibles de réussir dans les essais cliniques, et donc d'obtenir de meilleurs rendements sur investissement, si une cible validée est connue ^2. Ainsi, il y a eu un intérêt croissant pour les méthodes d'identification des petitsprotéines cibles molécule.

Une expérience d'identification de cible classique repose généralement sur ​​la purification par affinité, où la petite molécule d'intérêt est immobilisée sur une résine et mis en incubation avec des lysats de cellules entières, après quoi les protéines non liées sont éliminées par lavage et les protéines restantes sont éluées et identifiés ^3. Bien que cette technique a été utilisée pour identifier les cibles de nombreuses petites molécules ^4, il ne convient pas comme procédé d'identification cible universelle pour plusieurs raisons. Tout d'abord, la protéine cible doit conserver sa conformation native lors de la lyse cellulaire, afin de conserver sa capacité à se lier à la petite molécule. Cela peut être particulièrement problématique pour les protéines membranaires, qui subissent souvent des changements conformationnels après avoir été retiré de son environnement d'origine, ou simplement d'agrégats et précipitent hors de la solution. D'autre part, la petite molécule doit être chimiquement modifiée de façon à ce qu'il puisse être immobilisé sur la résine tout en conservantsa capacité à se lier à la protéine cible. poches de liaison profondes peuvent donc devenir inaccessibles à une petite molécule, une fois qu'il est fixé à la résine. En troisième lieu, l'affinité de liaison doit être suffisamment élevée pour que l'interaction soit maintenue pendant les étapes de lavage, ce qui rend l'identification des interactions d'affinité inférieurs difficiles. En quatrième lieu, les conditions environnementales telles que le pH, la concentration d'ions, ou la présence d'autres molécules endogènes peuvent varier dans l'espace intérieur de la cellule et sont parfois des conditions préalables pour les interactions médicament-cible. Ainsi, trouver les bonnes conditions pour permettre et maintenir l'extérieur de la cellule de liaison peut nécessiter une quantité importante d'essais et d'erreurs.

Marquage photoaffinité évite ces problèmes en permettant la liaison d'une petite molécule et sa cible dans le contexte natif d'une cellule covalente. Plutôt que immobilisant la petite molécule dans une large résine volumineux, la molécule est plutôt modifiée chimiquement pour installer deux petits g fonctionnelleroupes: un groupement photoactivable qui permet une réticulation covalente à la protéine cible lors de l'irradiation avec une longueur d'onde particulière de la lumière, et un groupe rapporteur qui permet à la protéine cible à détecter et ensuite isolé. Les cellules vivantes sont traitées avec la sonde de photoaffinité, la sonde se lie de manière covalente et la réticulation de la protéine cible et le complexe sonde-protéine est ensuite isolée intacte. La spécificité de liaison à la cible sonde est mise en évidence en réalisant une expérience de compétition en parallèle, où un excès du composé parent est utilisé pour concourir à une distance de liaison de la sonde à la protéine cible.

La conception et la synthèse des sondes de photoaffinité varie considérablement d'une petite molécule à l'autre, et ne seront pas couverts par ce protocole; cependant, plusieurs excellentes discussions sur le sujet ont été publiés ^5-9. La considération principale est que la sonde conserve l'activité biologique du composé parent, par conséquent presumabment de liaison à la même cible (s). Relation structure-activité (SAR) des études doivent être effectuées pour déterminer quelles parties de la molécule peuvent être modifiés sans perte de bioactivité. Une variété de différents groupes chimiques ont été utilisés comme agents de reticulation, y compris photoactivables diazirine, la benzophénone, l' azide et aryle, qui présentent chacune des avantages et des inconvénients ^10. De même, il y a plusieurs étiquettes de reporteurs qui ont été utilisées pour isoler des protéines de liaison à la sonde. Les groupes rapporteurs peuvent être fonctionnels eux - mêmes, tels que la biotine couramment utilisés ou des marqueurs fluorescents, ou peuvent être des précurseurs qui nécessitent une fonctionnalisation supplémentaire postérieure à l'étape de photoréticulation, qui ont l'avantage d'être plus petite et donc moins susceptibles de compromettre l' activité biologique ^11.

Dans ce protocole, nous avons utilisé une sonde de photoaffinité contenant un groupe diazirine de photoréticulation et un alcyne terminal pour la fixation d'un groupe reporter par un Cu (I) -catalyzed Azide-Acétylène Sharpless-Huisgen cycloaddition (ou cliquez) Réaction ^12-15. Les études SAR, sonder la conception et la synthèse, et les résultats de ces études ont été publiés ailleurs ^16-18.

Protocol

NOTE: Ce protocole a été adapté de MacKinnon et Taunton ¹⁰ pour une utilisation dans des cellules vivantes.

1. Préparation des cellules cultivées

1. Préparer 6 cm des boîtes de culture de cellules stériles pour le nombre d'échantillons souhaités (voir ci-dessous).
   NOTE: Un plat de cellules est utilisée par condition de traitement, mais si plus de protéines est nécessaire 2 ou 3 plats peuvent être préparés par condition et combinés après irradiation UV.
   1. Préparer au moins 3 plats de cellules; Contrôle négatif avec du DMSO seulement (D), le traitement de la sonde seulement (P), et de la sonde + concurrent (C).
   2. Eventuellement, préparer un 4 ^ème plat comme aucun contrôle UV, à traiter avec la sonde mais non soumis à la lumière UV.
      Remarque: si des molécules multiples concurrents doivent être testés, tels que différents analogues de la petite molécule d'intérêt, préparer des plaques concurrentes supplémentaires si nécessaire.
2. Ajouter des cellules HEK293T à des boîtes de culture dans 4 milieux de culture ml. Utiliser 3,5 millions de caunes par plaque.
   REMARQUE: le nombre de cellules doit être déterminée pour chaque type de cellule de sorte que les cellules sont confluentes à près de 100% au début de l'expérience, afin d'obtenir le rendement maximal de protéine. Pour HUVEC, utiliser 0,3 millions de cellules par plaque. Une bonne approximation est de 1/10 des cellules dans un plat cm confluentes 15. des cellules HEK293T devraient être cultivées dans Dulbecco Modified Eagles Medium additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine.
3. Remettre les cellules dans l'incubateur de culture (37 ° C, 5% _CO2) pendant une nuit.

2. Le traitement des cellules et photoréticulation

1. Le lendemain, pré-aliquote les médicaments suivants dans 1,5 ml microtubes:
   1. Pour le premier traitement, ajouter 4 pl de DMSO à 2 tubes et 4 pl de 10 mM de concurrent ( par exemple, le composé parent non modifié) à 1 tube.
   2. Pour le deuxième traitement, ajouter 16 pi de DMSO à 1 tube et 16 pi de 50 &# 181; M photoaffinité sonde à 2 tubes.
      NOTE: La concentration optimale peut être différente pour les différentes sondes (voir la discussion), mais entre 200-500 nM est un bon point de départ (ici, nous utilisons 200 nM). La concentration du compétiteur doit être supérieure à celle de la sonde au moins 20 fois (ici, nous utilisons 10 uM). La concentration finale de DMSO ne doit être égale dans toutes les plaques et ne doit pas dépasser 0,5% (volume 20 ul).
2. Apportez les plaques de cellules dans la hotte de culture cellulaire et ajouter les médicaments pré-aliquote de l'étape 2.1.1 comme suit: Aspirer 1 ml de milieux de culture, la remise en suspension du médicament pré-aliquotés dans les médias, et en ajoutant le doucement à la chute de la plaque sage. Ajouter le DMSO à la (D) Plaque DMSO et la sonde (P) plaque, et ajouter le concurrent à la concurrence (C) plaque. Retourner les plaques dans l'incubateur de culture pendant 30 min.
3. Avec les lumières de la hotte de culture estompés, ajouter la sonde pré-aliquotés de l'étape 2.1.2 pour sonder (P) et de la concurrence (C) plaques et ajouter laDMSO à la plaque de DMSO (D), comme ci-dessus. Remettre les plaques à l'incubateur de culture pendant 1 heure.
4. Pendant l'incubation, préparer les éléments suivants; Un plateau de glace qui peuvent convenir à toutes les plaques; tampon de lyse glacé (PBS [pH 8,5] + inhibiteur de protéase 1x cocktail [complet EDTA libre, dilué de solution 50x stock faite dans l'eau]; 200 pl / plaque); microtubes étiquetés D, P ou C pour chacune des différentes conditions de traitement sur de la glace.
5. 15 min avant la fin de l'incubation de 1 h, mis en place la lampe UV (365 nm) dans la chambre froide et allumez-le pour réchauffer l'ampoule.
6. Après 1 heure d'incubation avec la sonde, placez les plats sur la glace. Laver les cellules doucement avec 5 ml PBS glacé (pH 7,4) pour éliminer l'excès sonde. Re-couvrir les cellules avec 4 ml PBS glacé.
7. Placer le plat de cellules centrées 3 cm sous la lampe UV sur le dessus d'un sac de glace pour réduire au minimum le chauffage de la lampe. Irradiation pendant 3 min. Retirer le plat sur le plateau de glace et de répéter pour tous les échantillons.
8. UNEirradiation près avoir, aspirer le PBS des cellules et ajouter 200 pi de PBS glacé (pH 8,5) avec des inhibiteurs de la protéase à chaque plaque. Détacher les cellules de la plaque à l'aide d'une raclette en caoutchouc et le transfert des tubes à centrifuger pré-étiquetés sur la glace.
9. Ajouter du SDS à une concentration finale de 0,4% (10 pl de SDS à 10% dans 250 ul de l'échantillon).
   ATTENTION: la poudre SDS est dangereux. Éviter d'inhaler la poudre SDS en portant un masque sur le nez et la bouche.
10. Lyse des cellules par sonication de la suspension pour 10 impulsions (sortie 1, cycle de service de 30%) et incuber sur la glace pendant 1 min avant une deuxième série de 10 impulsions.
11. Si nécessaire, retirez 2 pl de suspension et vérifier sous un microscope optique pour assurer la lyse cellulaire complète.
12. Faire bouillir les échantillons sur une plaque chauffante réglée à 95 ° C pendant 5 min pour terminer la lyse des cellules et dénaturer toutes les protéines.
13. Mesurer la concentration en protéine dans chaque échantillon en utilisant un dosage de protéines compatible avec les détergents spectrophotométrique, par exemple the Dc protéine test ^19, selon les instructions du fabricant, avec un spectrophotomètre pour mesurer l' absorbance à 750 nm.
14. Normaliser la concentration en protéine de 2,5 mg / ml (ou si les concentrations sont inférieures à 2,5 mg / ml, normalise l'échantillon avec la concentration en protéines plus basse) en y ajoutant du PBS pH 8,5 + 0,4% de SDS selon les besoins (par exemple, si les échantillons sont 5 mg / ml dans 250 ul, ajouter 250 ul de PBS, pH 8,5 + 0,4% de SDS pour obtenir une concentration finale de 2,5 mg / ml).

3. Fixation de Tag Fluorescent par Cliquez Chimie pour la visualisation des protéines marquées

1. Enlever 40 pi de lysat cellulaire et le transfert à un nouveau microtube. Maintenir les lysats restants pour une réaction avec de la biotine-azide (étape 4).
2. Ajouter les réactifs suivants dans l'ordre: 0,2 ul fluor-azoture (mM de solution 1 dans le DMSO), 0,58 ul PTCE (mM 100 dans de l'eau avec 4 équivalents NaOH ajouté, préparé frais), et 3,38 ul TBTA (1.7 mM dans un rapport de 4: 1 de t-butanol au DMSO). Vortex pour mélanger.
3. Ajouter 1,14 ul CuSO ₄ 5H ₂ O (50 mM dans l' eau) pour démarrer la réaction. Vortex brièvement et incuber à température ambiante pendant 30 min dans l'obscurité.
4. Ajouter 50 pi de tampon d'échantillon SDS 2x pour arrêter la réaction. À ce stade, exécutez les échantillons directement sur ​​un gel SDS-PAGE ²⁰ pour obtenir les meilleurs résultats, ou conserver à -20 ° C pendant la nuit si nécessaire.
5. Si les échantillons de gel, réchauffer pendant 5 min à 95 ° C avant le chargement sur le gel.
   REMARQUE: Etant donné que le poids moléculaire de la protéine cible est généralement pas connue à ce stade, il est recommandé de faire fonctionner 2 gels ayant des concentrations d'acrylamide différentes ( par exemple, 8% et 15%), ou d' un gel large gradient de plage de poids moléculaire ( à savoir, 4-15%), pour assurer une couverture complète du poids moléculaire.
6. Lorsque le front de colorant ait atteint la fin du gel, de continuer à exécuter le gel pendant 5 minutes pour assurer que tous les excès unreacted fluor-azoture a complètement quitté le gel.
7. Retirer le gel à un récipient avec ddH ₂ O et incuber pendant 10 min avec agitation douce, pour laver tous les excès de fluor-azoture.
8. Placer le gel sur une plaque de verre et analyser le gel à l'aide d'un scanner de gel Typhoon fluorescent selon les instructions du fabricant.

4. Fixation de biotine Tag par Click Chemistry for Affinity Purification des protéines marquées

1. Des lysats restants de l'étape 3.1, en utilisant la quantité maximale après la protéine de normalisation de telle sorte que tous les échantillons sont le même volume (par exemple, si après normalisation à 2,5 mg / ml, les volumes d'échantillons résultants sont 500, 550, et 600 ul, en utilisant 500 pi de chaque).
2. Pré-effacer les lysats en ajoutant 50 pi de billes streptavidine agarose à haute capacité, 2x pré-lavés avec du PBS (pH 7,4). Incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec rotation.
3. Pellet les billes par centrifugation à 1000 g pendant 3 min. Retirer til surnageant dans un nouveau tube sur la glace et jeter les perles.
4. Retirer 1-2% de l'échantillon de DMSO dans un nouveau tube marqué "entrée". Ajouter un volume équivalent de 2x SDS tampon d'échantillon et conserver à -20 ° C.
5. Par 500 pi de lysat, ajouter les réactifs suivants: 1,38 ul biotine-azoture (10 mM dans du DMSO), 5,5 pi PTCE, et 32,5 ul TBTA. Vortex pour mélanger.
6. Ajouter 11 ul CuSO ₄ 5H ₂ O par 500 pi de lysat et vortex brièvement. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
7. Ajouter 4 volumes d'échantillon d'acétone refroidi à -20 ° C. Vortex les échantillons et incuber pendant la nuit à -80 ° C pour précipiter les protéines complètement et retirer la biotine qui n'a pas réagi azide.
8. Centrifuger les échantillons à 17 000 g pendant 15 min à 4 ° C pour sédimenter les protéines précipitées.
9. Aspirer le surnageant complètement, et resolubiliser les protéines par traitement aux ultrasons dans 150 pl de PBS (pH 7,4) + 1% de SDS.
10. Ajouter les échantillons de 30 ul prélavés billes de streptavidine-agarose de haute capacité et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec rotation.
11. Pellet les billes par centrifugation à 1000 g pendant 3 min. Aspirer le surnageant contenant les protéines non liées et défausse.
12. Ajouter 1 ml de tampon de lavage (NaCl 400 mM, Tris 50 mM, 0,2% de SDS, pH 7,4) aux billes, et incuber pendant 5 minutes à température ambiante avec rotation.
13. Répétez les étapes 4.12 et 4.13 3 fois.
14. Aspirer le tampon de lavage complètement des perles, et d'ajouter 30 ul de tampon d'échantillon 2 x SDS.
15. Incuber pendant 5 min sur un bloc C à la chaleur à 95 ° pour libérer les protéines des perles.
16. Centrifuger les billes pendant 1 min à 13 000 xg à la température ambiante.
    NOTE: A ce stade, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à ce que prêt à fonctionner SDS-PAGE. Si les échantillons de gel, réchauffer pendant 5 min à 95 ° C avant utilisation.
17. Avec attentionpipetter le tampon d'échantillon contenant des protéines hors des perles, et charger sur SDS-PAGE ²⁰ (voir considérations importantes ci - dessous). Les perles peuvent être sauvegardés pour rebouillage plus tard si nécessaire.
    NOTE: Pour la détection des protéines par coloration à l'argent, de meilleurs résultats sont obtenus en utilisant un gel épais de 1 mm. Si une bande doit être coupée du gel coloré à l'argent pour la spectrométrie de masse (MS) analyse, préparer tous les réactifs frais à partir de solutions stériles et laisser un puits vide entre les deux échantillons sur le gel. Pour chaque bande découpée dans la voie de la sonde, une tranche parallèle devrait être prélevé sur la voie de DMSO de sorte que les protéines de fond peuvent être soustraites. Pour la validation de la protéine ID par western blot, il est essentiel de charger également l'échantillon d'entrée de l'étape 4.4 lors de l'exécution du gel SDS-PAGE.
18. Suivre un protocole standard pour l'une ou l' autre coloration à l' argent ou ²¹ transfert de Western pour détecter la ²² protéine (s) cible.

Representative Results

Les résultats présentés ici ont été obtenus avec une sonde de photo-affinité de l'itraconazole médicament antifongique, dont l'utilisation a été précédemment publiée ^16. Ces résultats démontrent l'utilisation de la technique de marquage par photoaffinité des cellules vivantes afin d'identifier avec succès une protéine de liaison à l'itraconazole majeure de 35 kDa en tant que protéine de la membrane dépendant de la tension Anion canal 1 (VDAC1).

Le protocole ci-dessus a été réalisée dans des cellules HEK293T en utilisant la sonde pour l'itraconazole et l'itraconazole photomarquage non modifiée en tant que molécule de concurrents. Une fois que les échantillons ont été préparés comme décrit, ils ont été soumis à une SDS-PAGE pour séparer les protéines par poids moléculaire. Molecular unités de marqueurs de poids sur la gauche sont en kilodaltons (kDa). La première voie est l'échantillon témoin de DMSO (D), la seconde voie est l'échantillon de la sonde (P), et la troisième voie est l'échantillon de concours (C). Bands pressentiment dans la seule voie DMSO sont considérés comme arrière-plan. En analysant ces données, notez que les protéines de liaison spécifique devrait être absent dans l'échantillon témoin de DMSO, présent dans l'échantillon de la sonde et a diminué dans l'échantillon de la concurrence. Dans ce cas, la principale bande de protéine détectée que dans l'échantillon de la sonde était une bande d'environ 35 kDa (figures 1 et 3), qui a été identifié par spectrométrie de masse comme VDAC1. L'identité de cette protéine a été confirmée dans la figure 5 par transfert de Western en utilisant un anticorps spécifique VDAC1. Pris ensemble, ces résultats nous permettent de conclure que VDAC1 est une protéine de liaison majeure de l'itraconazole dans ces cellules.

La figure 1 montre la visualisation des protéines après marquage avec un marqueur fluorescent (de l' étape 3 dans le protocole); La figure 3 montre la visualisation des protéines par coloration à l' argent après marquage avec l' étiquette de biotine et pe rforming purification d'affinité (à partir de l'étape 4 dans le protocole); et la figure 5 montre la validation de l'ID de la protéine en utilisant un anticorps spécifique pour VDAC1. Les figures 2 et 4 illustrent ce qui se passe si certaines étapes du protocole ne sont pas effectuées correctement (noté dans les légendes des figures).

Figure 1. Un gel SDS-PAGE représentant la fluorescence à balayage (de l' étape 3 dans le protocole) D = DMSO seulement. P = sonde seulement (200 nM); C = la concurrence (10 uM). Molecular unités de marqueurs de poids sur la gauche sont en kilodaltons (kDa). La flèche pointe vers la principale bande de protéine photomarqués à environ 35 kDa qui est spécifiquement présente dans la voie de la sonde et est en compétition de distance par le composé parent en excès, ce qui indique qu'il est une protéine de liaison spécifique.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Un gel de fluorescence numérisée. Le fluor-azide en excès n'a pas été complètement retiré du gel (étapes 3.6 et 3.7), ce qui provoque de grands frottis noir à apparaître au bas du gel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3. Un gel SDS-PAGE coloré à l' argent représentant après la biotine pull-down (de l' étape 4 dans le protocole). La flèche à la même bande qui a été visualisées sur la figure 1, qui a ensuite été exciséà partir du gel et soumis à une analyse par MS pour identifier les protéines. unités de marqueurs sur la gauche sont en kilodaltons (kDa). Notez l'espace vide entre chaque voie, afin d'éviter la contamination croisée des échantillons pendant le chargement de gel et la bande excision. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. coloration à l' argent. Un gel coloré à l'argent avec un fond très élevé coloration, en raison de l' insuffisance de pré-compensation des lysats (étape 4.2) et / ou le lavage des billes (étape 4.13). A noter également le manque d'espace entre les voies. Unités de marqueurs sur la gauche sont en kilodaltons (kDa). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Western blot de la photomarqués protéine de 35 kDa, identifiée par MS comme VDAC1 après la biotine pull-down (de l' étape 4 dans le protocole). Le signal est présent dans la voie de la sonde et une diminution dans la voie de la concurrence, comme dans les figures 1 et 3, ce qui confirme l'identité de la protéine telle que VDAC1. Il est important que la fraction d'entrée (étape 4.4) est exécutée parallèlement aux échantillons d'excursion basse, afin de faire en sorte que les travaux d'anticorps et la protéine d'intérêt peut être détectée dans le lysat. Une légère augmentation du poids moléculaire peut être observé dans les échantillons déroulants en raison de la taille supplémentaire de la sonde fixée de manière covalente. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Différentes approches de l'identification des cibles de petites molécules peuvent être regroupées en deux catégories: de haut en bas, où le phénotype cellulaire du médicament est utilisé pour affiner ses cibles potentielles en fonction de leurs fonctions connues, ou bottom-up, où la cible est identifié directement par voie chimique ou génétique ^3. Top-down ou les études phénotypiques peuvent identifier certains processus cellulaires affectés par le médicament (par exemple, la transcription / traduction / synthèse de l' ADN, blocage du cycle cellulaire, la signalisation activation de la voie / inhibition, etc.) qui pourraient sous - tendre le phénotype ultime de la petite molécule, qui aide à affiner la liste des cibles potentielles pour des protéines impliquées dans ces processus. Cependant, un inconvénient majeur de l'approche top-down est qu'elle repose sur ce qui est déjà connu sur ces processus, et est donc un parti pris contre des cibles dont les fonctions ne sont pas caractérisées ou n'a pas été décrit précédemment d'être impliquédans un procédé donné.

L'approche bottom-up de contourner ce problème en identifiant la cible directement d'une manière impartiale. Ceci peut être accompli par des moyens génétiques; par exemple, par criblage d' une banque shRNA pour les lignées cellulaires knock - down qui confèrent une résistance ou une hypersensibilité au médicament, ou en isolant des lignées cellulaires résistantes aux médicaments et à l' aide d'un séquençage génomique pour déterminer quels gènes contiennent des mutations ^1. Ces types d'expériences peuvent identifier des protéines ou des voies principales liées à l'activité du médicament, mais ne prouvent pas nécessairement directement lier à la protéine identifiée. les approches chimiques, d'autre part, impliquent généralement l'utilisation d'une sonde chimique de se lier à la protéine cible directement et permettre son isolement et l'identification. La conception d'une sonde qui conserve son aptitude à se lier à la protéine cible, nécessite l'utilisation d'études SAR pour identifier une position sur la molécule qui peut être modifiée sans perte significative d'activité. Il also exige que la sonde soit capable de se lier à sa cible , soit de manière covalente ou avec suffisamment d' affinité élevée qu'il peut être isolé à partir d' autres protéines cellulaires ( par exemple, purifiée par affinité), et que ces protéines conservent leur capacité à lier la petite molécule à l'extérieur de leur native environnement cellulaire. Cette exigence peut être problématique pour certaines cibles; par exemple, des protéines membranaires intégrales nécessitent souvent un environnement lipidique spécifique pour maintenir leur conformation active et peuvent être agrégées ou mal orientée pour la liaison une fois que les cellules sont lysées ligand. Le procédé décrit dans ce manuscrit évite ces pièges potentiels de purification par affinité en permettant la modification covalente de la protéine cible au sein de l'environnement cellulaire natif, de sorte que les manipulations ultérieures ne peuvent pas interrompre l'interaction médicament-cible ^10.

la mise en œuvre réussie du protocole décrit dépend de plusieurs facteurs. Il est important que le target protéine de la petite molécule soit suffisamment abondant dans le type cellulaire choisi pour photomarquage. Le type de cellule la plus puissante affectée par la petite molécule peut être un bon point de départ, mais il peut être nécessaire de tester plusieurs types de cellules différentes pour trouver un avec des rendements en protéines de haute cibles. En variante, l'enrichissement des populations de protéines différentes par fractionnement subcellulaire peut augmenter le rendement de la cible tout en diminuant l'étiquetage de fond. La détection des protéines marquées par fluorescence est en général beaucoup plus sensible que la détection des protéines par coloration à l'argent; par conséquent, des bandes détectées par fluorescence peuvent ne pas être détectable par coloration à l'argent après la biotine pull-down. Amplifier l'expérience en utilisant de multiples plats de cellules par condition de traitement peut aider à surmonter ce problème de détection. L'augmentation de la concentration de la sonde peut aussi aider à améliorer les rendements déroulantes. bandes spécifiques peuvent également être masqués par un bruit de fond, auquel cas le lavage plus rigoureux, pré multiplecompensation étapes, ou l'utilisation de billes d'une composition différente (tels que des perles magnétiques au lieu d'agarose) peut être utile. Cependant, si la protéine cible est trop faible abondance, il peut ne pas être possible de détecter par coloration à l'argent. En outre, si la protéine cible ne migre pas comme une bande étroite sur SDS-PAGE (telles que des protéines fortement glycosylées), il sera également plus difficile à visualiser. D'autres modifications au protocole pourraient être prises pour remédier à ces problèmes, tels que l'exécution protéomique entier échantillons ou SILAC (Stable Isotope Étiquetage par les acides aminés dans la culture cellulaire) pour identifier les protéines marquées après pull-down, ce qui élimine le besoin de couper une bande sur d'un gel coloré à l'argent.

Une autre considération importante est la concentration de la sonde à utiliser dans l'expérience. Idéalement, la plus faible quantité de sonde qui produit un signal détectable doit être utilisé. Des concentrations plus élevées donneront signal plus élevé, mais aussi plus élevé étiquetage de fond, et une fois tous les of les sites de liaison sur la cible d'affinité la plus élevée deviennent saturés il peut y avoir des cibles d'affinité inférieure supplémentaires qui commencent à détecter. La concentration optimale doit donc être déterminée de façon empirique en partant d'une concentration relativement élevée (1-2 pm) et titrer en arrière jusqu'à ce qu'une ou deux protéines sont marquées et la compétition est évidente.

La puissance de la sonde peut être prise en considération dans le choix de la concentration de départ; Toutefois, en fonction de l'abondance de la cible et le mode d'inhibition, il ne peut pas être une bonne corrélation entre l'activité de la sonde et la détection des cibles (par exemple, une sonde avec une faible inhibition nanomolaire ne tirez nécessairement vers le bas suffisamment de protéines à de faibles concentrations nanomolaires pour être détectable ). Par conséquent, il est préférable de déterminer la concentration la plus appropriée de manière empirique en utilisant une détection des protéines marquées en tant que lecture. La concentration du compétiteur utilisé ne doit dépasser celle de la sonde par aumoins 20 fois, mais des précautions doivent également être prises pour ne pas dépasser la limite de solubilité du concurrent.

Dans le cas où plusieurs protéines sont tirés vers le bas par la sonde, l'identification de la protéine fonctionnellement pertinente devient plus compliqué. Cependant, il y a plusieurs façons d'aider à affiner les protéines cibles potentielles. Comme mentionné ci-dessus, titration retour la concentration de la sonde peut aider à améliorer la spécificité de l'étiquetage. Que la concentration de la sonde baisse, les protéines de liaison d'affinité élevée doivent conserver leur intensité de signal tandis que les protéines d'affinité inférieure doivent disparaître. Déconvolution de multiples cibles potentielles peuvent également être facilitée par l'utilisation d'analogues chimiques du composé parent avec des degrés variables d'activité. En théorie, pour une cible fonctionnellement pertinente, il devrait y avoir une corrélation entre la liaison à la cible et l'activité de l'analogue. Par exemple, la concurrence par des analogues inactifs du composé parent peut être utilisé pour exclure p liaisonroteins qui ne sont pas impliqués dans les effets phénotypiques du composé. De même, les analogues actifs, ou d'autres petites molécules qui induisent le même phénotype que le composé parent, peuvent être utilisés pour aider à la règle dans les protéines de liaison appropriées. Dans le même sens, l'utilisation d'une sonde de photoaffinité inactive ou structurellement indépendant peut aider à éliminer les protéines non pertinentes.

La validation de la protéine cible, il faut d'abord la vérification de la protéine identifiée par la sclérose en plaques. Ceci peut être facilement réalisée par Western Blot après la biotine pull-down, en supposant un anticorps de haute qualité pour la protéine cible est disponible. Cependant, lorsque l'on travaille avec une protéine inconnue, il est facile de perdre du temps et de l'argent sur les mauvais anticorps. Il est donc essentiel que l'anticorps soit validé, et qu'il détecte une bande spécifique dans le lysat des cellules étant utilisée pour le marquage ( par exemple, l'échantillon d'entrée). En outre, parce que le rendement en protéine après pull-down peut être faible, la fourmiibody doit être extrêmement sensible, et en fonction des concentrations élevées d'anticorps peut être nécessaire (jusqu'à 1: 100 dilution dans certains cas). Pour éviter ces problèmes, une version étiqueté de la protéine peut être exprimée dans les cellules avant photomarquage, et le marqueur peut ensuite être utilisé pour détecter la protéine après pull-down.

Une fois que l'ID de la protéine est confirmée, la validation fonctionnelle de la cible peut être accomplie par des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques, ou des tests fonctionnels de la cible d'intérêt, afin de démontrer que l'activité de la cible est affectée par la liaison de petite molécule. Le site de liaison peut être mise en correspondance en identifiant les acides aminés modifiée par la sonde, ou la détermination de la structure en 3 dimensions de la petite molécule liée par cristallographie aux rayons X ou par spectroscopie RMN. Idéalement, si un mutant peut être trouvée qui perd sa capacité à se lier à la petite molécule, il devrait être capable de supprimer l'activité de la petite molécule lorsqu'elle est exprimée à la place du pro de type sauvagetein. Il peut également être souhaitable de montrer la spécificité de la liaison à la cible par rapport aux autres protéines de structure apparentée ou «hors cible».

Ce protocole général peut être utilisé dans toute application nécessitant une mesure directe de la petite molécule se liant à une protéine cible, tant qu'une sonde peut être faite qui conserve l'activité biologique du composé parent. Les applications potentielles comprennent, mais sans s'y limiter, l'identification de cibles moléculaires des nouveaux composés, le potentiel d'arpentage hors des cibles des médicaments existants, ce qui confirme la liaison directe d'une petite molécule à une protéine particulière d'intérêt, la détermination de la compétition de la liaison par d'autres petites molécules à le même site de liaison sur une protéine, et la découverte de nouveaux récepteurs de ligands naturellement dérivés ou endogènes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp	Spectroline	FC100	UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free	Roche Life Science	11873580001	Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Set to output 1, duty 30%.
Fluorescent gel scanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualified	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin solution	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676