Identifisering av lite molekyl bindende proteiner i en Native Cellular Miljø via Live-celle Photoaffinity Merking

Introduction

Bioaktive små molekyler prinsipielt virker ved å kommunisere med, og å endre funksjonen til en eller flere av "target" molekyler, oftest proteiner, i cellen. I drug discovery, når en aktiv forbindelse blir oppdaget gjennom fenotypisk screening, er identifisering av den molekylære mål (e) av denne forbindelse viktig, ikke bare for å forstå virkningsmekanismen og potensielle bivirkninger av forbindelsen, men også for potensielt å oppdage ny biologi underliggende sykdomsmodell og legge til rette for utvikling av nye mekanistiske klasser av therapeutics ^1. Selv om målet identifikasjon ikke er nødvendig for et medikament som skal brukes terapeutisk, i de senere årene har det vært en økende erkjennelse av at nye legemiddelkandidater er mer sannsynlig å lykkes i kliniske studier, og dermed gi bedre avkastning på investeringen, hvis en validert mål er kjent ^2. Således har det vært en økende interesse for fremgangsmåter for å identifisere småmolekyl target proteiner.

En klassisk mål identifisering eksperiment avhenger typisk av affinitetsrensing, hvor den lille molekylet av interesse er immobilisert på en harpiks og inkubert med helcellelysater, hvoretter ikke-bundne proteiner blir vasket bort, og de ​​gjenværende proteiner ble eluert og identifisert ^tre. Selv om denne teknikken har blitt brukt for å identifisere mål i mange små molekyler ^4, er det uegnet som en universell mål-identitet metode av flere grunner. For det første må målproteinet beholde sin naturlige konformasjon ved cellelysering for å beholde sin evne til å binde til det lille molekylet. Dette kan være spesielt problematisk for membranproteiner, som ofte undergår konformasjonsendringer etter å ha blitt fjernet fra sitt opprinnelige miljø, eller ganske enkelt aggregat og utfelles fra løsningen. For det andre må det lille molekylet modifiseres kjemisk på en slik måte at den kan immobiliseres på harpiksen og samtidig opprettholdedens evne til å binde mål-proteinet. Dype bindende lommer kan derfor bli utilgjengelige til et lite molekyl når den er festet til harpiksen. For det tredje må bindingsaffiniteten være tilstrekkelig høy til at vekselvirkningen blir opprettholdt i løpet av vasketrinnene, noe som gjør identifikasjon av lavere affinitetsinteraksjoner utfordrende. Fjerde, miljømessige forhold som pH, ion-konsentrasjon, eller tilstedeværelse av andre endogene molekyler kan variere romlig inne i cellen og er ofte en forutsetning for narkotika-målet interaksjoner. Dermed finne de riktige betingelser for å gi og opprettholde bindingen utsiden av cellen kan kreve en betydelig mengde av prøving og feiling.

Photoaffinity merking omgår disse problemene ved at den kovalente binding av et lite molekyl, og dens mål innenfor det native rammen av en celle. I stedet for å immobilisere det lite molekyl til et stort voluminøse harpiks, er molekylet i stedet kjemisk modifisert for å installere to liten funksjonell groups: en photoactivatable gruppe som tillater kovalent tverrbinding til målproteinet når de bestråles med en bestemt bølgelengde av lys, og en rapportørgruppe som lar målproteinet som skal påvises og deretter isolert. Levende celler er behandlet med den photoaffinity sonde, proben binder og kovalent kryssbinder til målet protein, og sonden-proteinkomplekset blir deretter isolert intakt. Spesifisiteten av proben bindes til målet blir påvist ved å utføre et konkurranseeksperiment i parallell, hvor et overskudd av den opprinnelige forbindelsen blir brukt til å konkurrere vekk binding av proben til mål-proteinet.

Design og syntese av photoaffinity sonder varierer fra ett lite molekyl til et annet, og vil ikke bli dekket i denne protokollen; har imidlertid flere gode diskusjoner om emnet publisert ^5-9. Hovedgrunnen er at sonden beholder bioaktivitet av modersubstansen, derfor presumably binding til det samme målet (s). Struktur-aktivitetsforhold (SAR) studier må utføres for å avgjøre hvilke deler av molekylet kan endres uten tap av bioaktivitet. En rekke forskjellige kjemiske grupper er blitt anvendt som photoactivatable tverrbindingsmidler, inkludert diazirine, benzofenon, og aryl azid, som hver har fordeler og ulemper ^10. Likeledes er det flere rapportør koder som har blitt brukt til å isolere probe-bindende proteiner. Rapportørgrupper kan være funksjonelle på egenhånd, slik som vanligvis anvendes biotin eller fluoriserende koder, eller kan være forløpere som krever ytterligere funksjonalisering etter at fototverrbindingen steg, som har fordelen av å være mindre og derfor mindre tilbøyelige til å gå på akkord bioaktivitet ^11.

I denne protokollen, har vi brukt en photoaffinity sonde som inneholder en diazirine fototverr gruppe, og en terminal alkyn for feste av en reporter gruppe gjennom en Cu (I) -catalyzed Azid-alkyn Sharpless-Hüisgen cykloaddisjon (eller klikk) reaksjon ^12-15. SAR-studier undersøke design og syntese, og resultatene av disse studiene er publisert andre steder ^16-18.

Protocol

MERK: Denne protokollen ble tilpasset fra MacKinnon og Taunton ¹⁰ for bruk i levende celler.

1. Utarbeidelse av dyrkede celler

1. Forbered sterile 6 cm cellekultur retter for antall prøver ønskede (se nedenfor).
   MERK: En tallerken av celler brukes per behandling tilstand, men hvis mer protein kreves 2 eller 3 retter kan tilberedes per tilstand og kombinert etter UV-bestråling.
   1. Forbered minst 3 retter av celler; Negativ kontroll med DMSO bare (D), bare Probe behandling (P), og probe + konkurrent (C).
   2. Eventuelt kan fremstille en 4 ^th tallerken som en ikke UV-kontroll, for å bli behandlet med proben, men ikke utsettes for UV-lys.
      MERK: Hvis flere konkurrerende molekyler som skal testes, for eksempel ulike analoger av den lille molekyl av interesse, fremstille ytterligere konkurrerende platene etter behov.
2. Legg HEK293T celler til kultur retter i 4 ml kulturmedier. Bruk 3,5 millioner calen per plate.
   MERK: Antall celler bør bestemmes for hver celletype, slik at cellene er nesten 100% konfluent ved begynnelsen av eksperimentet, for å oppnå den maksimale proteinutbytte. For HUVEC, bruke 0,3 millioner celler per plate. En god tilnærmelse er 1/10 av cellene i en konfluent 15 cm plate. HEK293T Cellene bør dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
3. Returner cellene til kulturen inkubator (37 ° C, 5% _CO2) natten over.

2. Behandling av celler og fototverrbindingen

1. Neste dag, pre-delmengde følgende legemidler i 1,5 ml mikrosentrifugerør:
   1. For den første behandling, tilsett 4 ul DMSO til 2 rør og 4 pl av 10 mM konkurrent (dvs. den umodifiserte opphavsforbindelsen) til en tube.
   2. For det andre behandling, tilsett 16 mL av DMSO til en tube og 16 mL av 50 &# 181; M photoaffinity sonde til 2 rør.
      MERK: Den optimale konsentrasjon kan være forskjellig for ulike prober (se diskusjon), men mellom 200-500 nm er et godt utgangspunkt (her bruker vi 200 nM). Konsentrasjonen av konkurrent bør overstige den for sonden på minst 20 ganger (her vi bruker 10 uM). Den endelige konsentrasjonen av DMSO bør være lik i alle platene, og bør ikke overstige 0,5% (20 ul volum).
2. Bringe celleplatene i cellekulturen hetten og legge de på forhånd porsjonert stoffer fra trinn 2.1.1 som følger: Sug 1 ml kulturmedium, resuspendering av pre-medikament porsjonert i media, og forsiktig tilsette den tilbake til platen fallet klok. Tilsett DMSO til DMSO (D) plate og sonden (P) plate, og legge til konkurrent til konkurransen (C) plate. Returnere platene til kulturen inkubator i 30 min.
3. Med lys i kultur panseret nedtonet, legge pre-porsjonert sonde fra trinn 2.1.2 å sondere (P) og konkurranse (C) plater og tilsettDMSO i DMSO (D) en plate, som ovenfor. Gå tilbake platene til kultur inkubator for en time.
4. Under inkubasjon, forberede følgende elementer; En skuff på is som kan passe alle platene; iskald lysebuffer (PBS [pH 8,5] + 1x proteasehemmer cocktail [komplett EDTA-fri, utvannet fra 50x stamløsning laget i vann]; 200 ul / plate); mikrosentrifugerør merket D, P eller C for hver av de forskjellige behandlingsbetingelser, på is.
5. 15 minutter før slutten av en time inkubasjon, sette opp UV-lampen (365 nm) i kjølerommet og slå den på å varme opp pære.
6. Etter 1 time inkubering med proben, plasserer retter på is. Vask cellene forsiktig med 5 ml iskald PBS (pH 7,4) for å fjerne overskudd av probe. Re-dekke cellene med 4 ml iskald PBS.
7. Sett fatet av celler sentrert 3 cm under UV-lampe på toppen av en ispose for å minimere varme fra lampen. Bestråle i 3 min. Fjern fatet til skuffen av is og gjenta for alle prøvene.
8. ENfter bestråling, aspirere PBS fra cellene og tilsett 200 ul av iskald PBS (pH 8,5) med proteaseinhibitorer til hver plate. Løsne cellene fra platen ved hjelp av en gummiskraper og overføring til pre-merket mikrosentrifugerør på is.
9. Legg SDS til en sluttkonsentrasjon på 0,4% (10 ul av 10% SDS i 250 ul av prøven).
   FORSIKTIG: SDS pulver er farlig. Unngå innånding av SDS-pulver med seg en maske over nese og munn.
10. Lyse cellene ved ultralydbehandling av suspensjonen for 10 pulser (utgangs 1, driftssyklus på 30%) og inkuber på is i 1 min før en andre runde av 10 pulser.
11. Hvis det er nødvendig, fjerne 2 mL av suspensjon og sjekke under et lysmikroskop for å sikre fullstendig cellelyse.
12. Koke prøvene på en varm plate innstilt på 95 ° C i 5 minutter for å gjennomføre cellelyse og denaturerer alle proteiner.
13. Måle proteinkonsentrasjonen i hver prøve ved anvendelse av en spektrofotometrisk vaskemiddel-kompatibel proteinanalyse, for eksempel the Dc proteinanalyse ^19, i henhold til produsentens instruksjoner, med et spektrofotometer innstilt til å måle absorbansen ved 750 nm.
14. Normalisere proteinkonsentrasjonen til 2,5 mg / ml (eller hvis konsentrasjonen er lavere enn 2,5 mg / ml, normal til prøven med den laveste proteinkonsentrasjon) ved tilsetning av PBS pH 8,5 + 0,4% SDS det er nødvendig (for eksempel hvis prøvene er 5 mg / ml i 250 ul, tilsett 250 ul av PBS pH 8,5 + 0,4% SDS for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 2,5 mg / ml).

3. Montering av Fluorescent Tag av Klikk kjemi for visualisering av merkede proteiner

1. Fjern 40 ul av cellelysatet og overføring til et nytt mikrosentrifugerør. Holde de gjenværende lysatene for reaksjon med biotin-azid (trinn 4).
2. Legg til følgende reagenser i rekkefølge: 0,2 ul fluor-azid (1 mM stamløsning i DMSO), 0,58 mL TCEP (100 mM lager i vann med 4 ekvivalenter NaOH tilsatt, forberedt frisk), og 3,38 mL TBTA (1.7 mM stamløsning i et 4: 1 forhold av t-butanol for å DMSO). Vortex å blande.
3. Legg 1,14 mL _CuSO4 -5H ₂ O (50 mM i vann) for å starte reaksjonen. Vortex kort og inkuber ved værelsestemperatur i 30 min i mørket.
4. Tilsett 50 ul av 2 x SDS prøvebuffer for å stanse reaksjonen. På dette punktet, kjøre prøvene direkte på en SDS-PAGE gel ²⁰ for best resultat, eller oppbevar ved -20 ° C over natten om nødvendig.
5. Dersom frysing prøver, oppvarmer i 5 minutter ved 95 ° C før lasting på gelen.
   MERK: Siden molekylvekten av målproteinet er vanligvis ikke kjent på dette stadiet, er det tilrådelig å kjøre 2 geler med forskjellige akrylamidkonsentrasjoner (dvs. 8% og 15%), eller et bredt molekylvektområde gradientgel (dvs. 4-15%), for å sikre fullstendig dekning molekylvekt.
6. Når fargestoffet fronten har nådd enden av gelen fortsette å kjøre gelen i ytterligere 5 minutter for å sikre at alt av det overskytende unreacted fluor-azid har kommet helt ut fra gel.
7. Fjerne gelen til en beholder med DDH ₂ O og inkuber i 10 min med forsiktig omrøring, for å vaske bort all overflødig fluor-azid.
8. Plasser gel på en glassplate og skanne gel ved hjelp av en Typhoon fluorescerende gel skanneren i henhold til produsentens instruksjoner.

4. Montering av Biotin Tag av Klikk kjemi for Affinity Rensing av merkede proteiner

1. Av de resterende lysatene fra trinn 3.1 ved å bruke den maksimale mengde etter protein normalisering slik at alle prøver er de samme volum (for eksempel, hvis etter normalisering til 2,5 mg / ml av de resulterende prøvevolumer er 500, 550, og 600 ul ved å bruke 500 mL av hver).
2. Forhånds fjerne lysatene ved å tilsette 50 ul med høy kapasitet streptavidin-agarose perler, forvasket 2 ganger med PBS (pH 7,4). Inkuber 1 time ved 4 ° C med rotasjon.
3. Pellet perlene ved sentrifugering ved 1000 x g i 3 min. Fjern than supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør på is og kast perlene.
4. Fjern 1-2% av DMSO prøven til et nytt rør merket "input". Legg et tilsvarende volum av 2x SDS prøvebuffer og oppbevares ved -20 ° C.
5. Per 500 mL av lysat, legge til følgende reagenser: 1,38 mL biotin-azid (10 mM lager i DMSO), 5,5 mL TCEP, og 32,5 mL TBTA. Vortex å blande.
6. Legg til 11 mL _CuSO4 5H ₂ O per 500 mL av lysat og virvle en kort stund. Inkuber ved romtemperatur i 30 min.
7. Tilsett 4 prøvevolumer aceton kjølt til -20 ° C. Vortex prøvene og inkuber over natten ved -80 ° C for fullstendig å utfelle proteinene og fjerne uomsatt biotin-azid.
8. Sentrifuger prøvene ved 17 000 xg i 15 min ved 4 ° C for å pelletere de utfelte proteiner.
9. Aspirer supernatanten helt, og resolubilize proteinene ved sonikering i 150 pl PBS (pH 7,4) + 1% SDS.
10. Tilsett prøvene til 30 pl forvasket med høy kapasitet streptavidin agarosekuler og inkuberes i 1 time ved 4 ° C med rotasjon.
11. Pellet perlene ved sentrifugering ved 1000 x g i 3 min. Aspirer supernatanten som inneholder ubundne proteiner og kast.
12. Tilsett 1 ml vaskebuffer (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) til kulene og inkuber i 5 minutter ved værelsestemperatur under rotasjon.
13. Gjenta trinn 4.12 og 4.13 3 ganger.
14. Suge vaskebuffer helt fra perlene, og legge til 30 mL av 2x SDS sample buffer.
15. Inkuber i 5 min på en 95 ° C varmeblokk for å frigjøre proteiner fra kulene.
16. Sentrifuger kulene i 1 minutt ved 13.000 xg ved romtemperatur.
    MERK: På dette punktet, kan prøvene oppbevares ved -20 ° C til den er klar til å kjøre SDS-PAGE. Dersom frysing prøver, oppvarmer i 5 minutter ved 95 ° C før bruk.
17. nøyepipette prøven buffer som inneholder proteiner av av perlene, og legg på SDS-PAGE ²⁰ (se viktige hensyn under). Perlene kan lagres for koking senere om nødvendig.
    NB: For protein deteksjon av sølvfarging, er bedre resultater oppnås ved anvendelse av en 1 mm tykk gel. Hvis et bånd som skal skjæres ut av en sølvfarget gel for massespektrometri (MS) analyse, fremstille alle reagenser fra friske sterile løsninger og la en tom brønn i mellom prøver på gelen. For hvert bånd skåret fra sonden kjørefelt, bør en parallell skive tas fra DMSO kjørefelt, slik at bakgrunns proteiner kan trekkes fra. For validering av protein ID ved western blot, er det avgjørende å også laste inn prøven fra trinn 4.4 når du kjører SDS-PAGE gel.
18. Følger en standardprotokoll for enten sølvfarging ²¹ eller Western blot ²² for å detektere målet protein (er).

Representative Results

Resultatene som er vist her ble oppnådd med en foto-affinitet sonde av det antifungale legemiddel itrakonazol, bruk av dette har blitt tidligere utgitt ^16. Disse resultater viser at bruk av den levende celle photoaffinity merkingsteknikk for å kunne identifisere en større itrakonazol-bindende protein som 35 kDa membranprotein spenningsavhengig anion kanal 1 (VDAC1).

Ovennevnte protokollen ble utført i HEK293T celler bruker itrakonazol probe for photolabeling og umodifisert itrakonazol som konkurrenten molekylet. Etter at prøvene ble fremstilt som beskrevet, ble de underkastet SDS-PAGE for å separere proteinene av molekylvekten. Molekylvektsmarkørenhetene til venstre er i kilodalton (kDa). Den første bane er DMSO kontrollprøven (D), den andre kjørefelt er sonden prøven (P), og den tredje kjørefelt er konkurransen prøven (C). Bands pmisliker i den eneste DMSO kjørefelt regnes bakgrunn. I analysere disse data være oppmerksom på at spesifikke bindende proteiner bør være fraværende i DMSO kontrollprøven, som er tilstede i sonden prøven og sank i konkurransen prøven. I dette tilfellet er hovedproteinbånd påvises bare i sondeprøven ble et bånd på omtrent 35 kDa (figur 1 og 3), som ble identifisert ved massespektrometri som VDAC1. Identiteten av dette protein ble bekreftet i figur 5 ved Western blot ved anvendelse av et spesifikt antistoff VDAC1. Samlet utgjør disse resultatene tillate oss å konkludere med at VDAC1 er en stor bindende protein av itrakonazol i disse cellene.

Figur 1 viser visualisering av proteinene etter merking med en fluorescerende tag (fra trinn 3 i protokoll), figur 3 viser visualisering av proteinene ved sølvfarging etter merking med biotin tag og pe rforming affinitet rensing (fra trinn 4 i protokoll); Figur 5 viser valideringen av proteinet ID med et spesifikt antistoff for VDAC1. figur 2 og 4 eksemplifisere hva skjer hvis visse skritt i protokollen ikke er utført korrekt (bemerket i figur legender).

Figur 1. Et representativt fluorescens-skannet SDS-PAGE gel (fra trinn 3 i protokollen) D = DMSO bare.; P = probe bare (200 nM); C = konkurranse (10 mm). Molekylvektsmarkørenhetene til venstre er i kilodalton (kDa). Pilen peker på de store photolabeled proteinbåndet på omtrent 35 kDa som er spesielt til stede i sonden kjørefelt og blir konkurrert bort av overflødig modersubstansen, noe som indikerer at det er en spesifikk binding protein.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. En fluorescens-skannet gel. Det overskytende fluor-azid har ikke blitt fullstendig fjernet fra gelen (trinn 3.6 og 3.7), forårsaker store svarte smears å vises på bunnen av gelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Figur 3. Et representativt sølvfarget SDS-PAGE-gel etter biotin rullegardin (fra trinn 4 i protokoll). Pilen peker på det samme bånd som ble visualisert i figur 1, noe som også ble spaltetfra gelen og underkastet MS-analyse for protein identifikasjon. Marker enheter til venstre er i kilodalton (KDA). Legg merke til den tomme plassen i mellom hvert kjørefelt, for å unngå kryss-kontaminering av prøvene under gel lasting og bandet excision. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. sølvfarging. En sølv-farget gel med meget høy bakgrunnsfarging, på grunn av utilstrekkelig pre-clearing av lysatene (trinn 4.2) og / eller vasking av kulene (trinn 4.13). Legg også merke til mangelen på plass mellom banene. Marker enheter til venstre er i kilodalton (KDA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Western blot av den photolabeled 35-kDa-proteinet, identifisert ved MS som VDAC1 etter biotin rullegardin (fra trinn 4 i protokoll). Signalet er tilstede i sonden kjørefelt og redusert i konkurransebane, som i figurene 1 og 3, noe som bekrefter identiteten av proteinet som VDAC1. Det er viktig at inngangs fraksjon (fra trinn 4.4) drives langs rullegardin prøver, for å sikre at antistoff verk og proteinet av interesse kan påvises i lysatet. En svak økning i molekylvekt kan observeres i rullegardinprøver på grunn av den ekstra størrelsen på kovalent bundet probe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Ulike tilnærminger til å identifisere målene for små molekyler kan grovt grupperes i to kategorier: top-down, hvor den cellulære fenotype av stoffet er brukt til å begrense sine potensielle mål basert på deres kjente funksjoner, eller bottom-up, hvor målet er direkte identifisert ved kjemisk eller genetisk betyr ^tre. Top-down eller fenotypiske undersøkelser kan identifisere visse cellulære prosesser som påvirkes av narkotika (f.eks transkripsjon / oversettelse / syntese DNA, cellesyklus blokk, signalveien aktivering / hemming, etc.) som kan ligge til grunn for den ultimate fenotype av lite molekyl, som hjelper innskrenke listen over potensielle mål til proteiner som er involvert i disse prosessene. Imidlertid er en stor ulempe ved den top-down tilnærmingen er at den er avhengig av hva som allerede er kjent om disse prosessene, og er derfor forspent mot mål hvis funksjoner ikke er blitt karakterisert, eller har ikke tidligere blitt beskrevet å være involverti en gitt prosess.

The bottom-up tilnærming omgår dette problemet ved å identifisere målet direkte på en objektiv måte. Dette kan oppnås ved genetiske midler; for eksempel ved screening en shRNA bibliotek for knockdown cellelinjer som gir resistens eller overfølsomhet til stoffet, eller ved å isolere resistente cellelinjer og bruk av genomisk sekvensering for å finne ut hvilke gener inneholde mutasjoner ^1. Slike eksperimenter kan identifisere viktige proteiner eller veier relatert til aktiviteten til medikamentet, men som ikke nødvendigvis vise seg direkte binding til den identifiserte protein. Kjemiske fremgangsmåter, på den annen side, vanligvis innebære bruk av et kjemisk sonde for å binde til target-proteinet direkte, og tillater dens isolering og identifikasjon. Å utforme en sonde som beholder sin evne til å bindes til mål-proteinet krever bruk av SAR-studier for å identifisere en posisjon i molekylet som kan endres uten vesentlig tap av aktivitet. det also krever at sonden være i stand til å binde dets mål, enten kovalent eller med høy nok affinitet til at det kan bli isolert fra andre cellulære proteiner (dvs. affinitets-renset), og at disse proteinene beholder sin evne til å binde det lille molekyl utenfor sitt eget mobilnettet miljø. Dette kravet kan være problematisk for visse mål; for eksempel integrerte membranproteiner krever ofte en spesifikk lipid miljø for å opprettholde sin aktive konformasjon, og kan bli aggregert eller feilorientert for ligandbinding når cellene lyseres. Metoden som beskrives i dette manuskriptet unngår disse potensielle farene ved affinitetsrensing ved å tillate kovalent modifikasjon av målproteinet i den native cellulære miljø, slik at etterfølgende manipulasjoner ikke kan avbryte medikament-target-interaksjon ^10.

Vellykket gjennomføring av den beskrevne protokoll avhenger av flere faktorer. Det er viktig at TArFå protein av den lille molekylet være tilstrekkelig rikelig i den celletypen valgt for photolabeling. Den celletype mest potente påvirket av lite molekyl kan være et godt utgangspunkt, men det kan være nødvendig å teste flere ulike celletyper for å finne en med høy target protein avkastning. Alternativt kan berikelse av forskjellige protein populasjoner av subcellulære fraksjone øke målet utbyttet samtidig redusere bakgrunns merking. Påvisning av fluorescerende merket proteiner er generelt mye mer følsom enn protein gjenkjenning av sølv flekken; Derfor kan båndene som påvises ved fluorescens ikke være detekterbar ved sølvfarging etter biotin pull-down. Skalere opp eksperimentet ved hjelp av flere retter av celler per behandling tilstand kan bidra til å overvinne denne deteksjons problem. Øke konsentrasjonen av sonden kan også bidra til å forbedre pull-down avkastning. Spesifikke bånd kan også være skjult av høy bakgrunn, i hvilket tilfelle mer stringent vasking, multippel pre-avskjære trinn, eller bruken av perler av en annen sammensetning (for eksempel magnetiske kuler i stedet for agarose) kan være nyttig. Men hvis målproteinet er for lav i overflod det kanskje ikke være mulig å detektere ved sølvfarging. I tillegg, hvis målproteinet ikke migrerer som et skarpt bånd på SDS-PAGE (som tungt glykosylerte proteiner) vil det også være vanskelig å visualisere. Ytterligere modifikasjoner i protokollen kan gjøres for å løse disse problemene, for eksempel å utføre hel-sample proteomikk eller SILAC (stabile isotoper Merking av aminosyrer i cellekultur) for å identifisere merkede proteiner etter pull-down, eliminerer behovet for å kutte et band ut av en sølvfarget gel.

Et annet viktig hensyn er konsentrasjonen av proben som skal brukes i forsøket. Ideelt sett bør den laveste mengden av sonde som produserer et detekterbart signal benyttes. Høyere konsentrasjoner vil gi høyere signal, men også høyere bakgrunn merking, og når alle of bindingssetene på den høyeste affiniteten målet blitt mettet, kan det være flere lavere affinitet mål som begynner å bli detektert. Den optimale konsentrasjon bør derfor bestemmes empirisk ved å starte med en relativt høy konsentrasjon (1-2 uM) og titrert tilbake til bare en eller to proteiner er merket, og konkurransen er åpenbare.

Styrken av sonden kan tas i betraktning ved valg av utgangskonsentrasjon; imidlertid, avhengig av målet overflod og modus for inhibering, kan det ikke være en god korrelasjon mellom proben aktivitet og target deteksjon (for eksempel en sonde med lav nanomolar hemming vil ikke nødvendigvis trekke ned nok protein ved lave nanomolare konsentrasjoner for å være detekterbar ). Således er det foretrukket å bestemme den mest passende konsentrasjon empirisk ved hjelp av påvisning av merkede proteiner som en avlesning. Konsentrasjonen av konkurrent som brukes bør ikke overstige den av sonden ved atminst 20 ganger, men forsiktighet bør også utvises for ikke å overstige løselighetsgrensen av konkurrenten.

I det tilfellet at flere proteiner blir trukket ned av sonden, blir identifikasjon av den funksjonelt relevante proteinet mer komplisert. Men det er flere måter å hjelpe begrense de potensielle target proteiner. Som nevnt ovenfor, kan titrere tilbake sonden konsentrasjonen bidrar til å forbedre spesifisiteten til merking. Ettersom konsentrasjonen av sonden synker, bør høyere affinitet-bindende proteiner beholde sin signalintensiteten, mens lavere affinitet proteiner skulle forsvinne. Dekonvolvering av flere mulige mål kan også bli hjulpet ved bruk av kjemiske analoger av moderforbindelsen med varierende grad av aktivitet. I teorien for en funksjonelt relevant mål, bør det være en sammenheng mellom binding til målet og aktiviteten til analogen. For eksempel kan brukes konkurransen ved inaktive analoger av modersubstansen å utelukke bindende proteins som ikke er involvert i de fenotypiske effekter av det sammensatte. Likeledes, aktive analoger eller andre små molekyler som induserer den samme fenotype som moderforbindelsen, kan brukes for å bidra til å styre i relevante bindende proteiner. Langs de samme linjene, kan bruk av en inaktiv eller strukturelt er relatert photoaffinity sonde hjelpe utelukke irrelevante proteiner.

Validering av målproteinet krever først verifisering av proteinet identifisert ved MS. Dette kan enkelt oppnås ved western blot følge biotin rullegardin, forutsatt at en høy kvalitet antistoff for målproteinet er tilgjengelig. Men når du arbeider med en ukjent protein er det lett å kaste bort mye tid og penger på dårlige antistoffer. Det er derfor avgjørende at antistoffet skal valideres, og at den detekterer et spesifikt bånd i lysatet av cellene som blir anvendt for merking (det vil si input prøve). I tillegg, fordi proteinet utbytte etter rullgardin kan være lav, mauriBody må være meget følsom, og avhengig av antistoffet høye konsentrasjoner kan det være nødvendig (opp til 1: 100 fortynning i noen tilfeller). For å unngå disse problemene, kan en merket versjon av proteinet blir uttrykt i cellene før photolabeling, og koden kan så brukes til å påvise proteinet etter pull-down.

Når proteinet ID er bekreftet, kan funksjonelle validering av målet oppnås ved genetisk og / eller farmakologiske manipulasjoner, eller funksjonelle analyser av målet av interesse, for å vise at aktiviteten til målet er påvirket av lite molekyl binding. Bindingssetet kan kartlegges ved å identifisere aminosyre modifisert av sonden, eller bestemmelse av 3-dimensjonale strukturen av det bundne lite molekyl av røntgenkrystallografi eller NMR-spektroskopi. Ideelt sett, hvis en mutant kan bli funnet som mister sin evne til å binde det lille molekyl, bør det være i stand til å avskaffe aktiviteten av det lille molekylet når den uttrykkes i stedet for villtype-protein. Det kan også være ønskelig for å vise spesifisiteten av binding til målet i forhold til andre strukturelt beslektede eller "off-target" proteiner.

Denne generelle protokollen kan brukes i en hvilken som helst anvendelse som krever direkte måling av små molekyl-bindende protein til et mål, så lenge som en sonde kan fremstilles som beholder den biologiske aktivitet av moderforbindelsen. Potensielle anvendelser omfatter, men er ikke begrenset til, identifisering av molekylære mål for nye forbindelser, oppmåling potensiell off-målene for eksisterende legemidler, noe som bekrefter den direkte binding av et lite molekyl til et bestemt protein av interesse, å bestemme konkurranse av binding av andre små molekyler ved det samme bindingssetet på et protein, og oppdage nye reseptorer av naturlig avledet eller endogene ligander.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp	Spectroline	FC100	UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free	Roche Life Science	11873580001	Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Set to output 1, duty 30%.
Fluorescent gel scanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualified	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin solution	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676