Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Introduction

pequeñas moléculas bioactivas, fundamentalmente, funcionan mediante la interacción con y alterar la función de una o más moléculas "objetivo", más comúnmente proteínas, en la célula. En el descubrimiento de fármacos, cuando un compuesto activo se descubrió mediante el cribado fenotípico, la identificación de la diana molecular (s) de ese compuesto es crucial, no sólo para entender el mecanismo de acción y efectos secundarios potenciales del compuesto, sino también para potencialmente descubrir nueva biología que subyace al modelo de enfermedad y allanando el camino para el desarrollo de nuevas clases mecanicistas de la terapéutica ^1. A pesar de la identificación de objetivos no se requiere de un medicamento para ser utilizado terapéuticamente, en los últimos años ha habido un creciente reconocimiento de que los nuevos candidatos a fármacos tienen más probabilidades de tener éxito en ensayos clínicos, y por lo tanto obtener mejores rendimientos de la inversión, si una diana validada es conocida ^2. Por lo tanto, ha habido un creciente interés en métodos para la identificación de pequeñaproteínas diana molécula.

Un experimento de identificación de objetivos clásica normalmente se basa en la purificación por afinidad, en donde la pequeña molécula de interés es inmovilizado en una resina y se incubó con lisados ​​de células enteras, después de lo cual las proteínas no unidos son lavados y las proteínas restantes se eluyeron y se identificaron ^3. Aunque esta técnica se ha utilizado para identificar los objetivos de muchas moléculas pequeñas ^4, no es adecuado como método de ID de destino universal para varias razones. En primer lugar, la proteína diana debe retener su conformación nativa en la lisis celular con el fin de conservar su capacidad de unirse a la molécula pequeña. Esto puede ser particularmente problemático para las proteínas de membrana, que a menudo se someten a cambios conformacionales después de haber sido retirado de su ambiente nativo, o simplemente agregan y precipitan de la solución. En segundo lugar, la molécula pequeña tiene que ser modificado químicamente de una manera tal que puede ser inmovilizado en la resina mientras se mantienesu capacidad de unirse la proteína diana. por lo tanto, bolsillos de unión profundos pueden llegar a ser inaccesibles a una molécula pequeña, una vez que está fijado a la resina. En tercer lugar, la afinidad de unión debe ser suficientemente alta de que la interacción se mantiene durante las etapas de lavado, haciendo la identificación de interacciones de afinidad inferiores desafiantes. En cuarto lugar, las condiciones ambientales tales como el pH, concentración de iones, o la presencia de otras moléculas endógenas pueden variar espacialmente dentro de la célula y, a veces son requisitos previos para las interacciones fármaco-diana. Por lo tanto, la búsqueda de las condiciones adecuadas para permitir y mantener fuera de la célula de unión puede requerir una cantidad significativa de ensayo y error.

marcaje de fotoafinidad evita estos problemas al permitir la unión de una molécula pequeña y su diana en el contexto nativo de una célula covalente. En lugar de inmovilización de la molécula pequeña en gran resina voluminosa, la molécula se modifica químicamente en lugar de instalar dos pequeños g funcionalrupos: un resto fotoactivable que permite la reticulación covalente a la proteína diana cuando se irradia con una longitud de onda particular de la luz, y un grupo indicador que permite que la proteína diana a detectar y se aisló posteriormente. Las células vivas se tratan con la sonda de fotoafinidad, la sonda se une de forma covalente y reticula a la proteína diana, y el complejo sonda-proteína es entonces aislado intacto. La especificidad de unión a la diana de la sonda se demuestra mediante la realización de un experimento de competición en paralelo, donde se utiliza un exceso del compuesto original para competir de distancia de unión de la sonda a la proteína diana.

El diseño y síntesis de sondas de fotoafinidad varía mucho de una pequeña molécula a otra, y no serán cubiertos en este protocolo; Sin embargo, varios excelentes discusiones sobre el tema han sido publicadas ^5-9. La consideración principal es que la sonda mantiene la bioactividad del compuesto de origen, por lo tanto presumably la unión a la misma diana (s). relación estructura-actividad (SAR) Los estudios deben llevarse a cabo para determinar qué partes de la molécula pueden ser modificadas sin pérdida de bioactividad. Una variedad de diferentes grupos químicos se han utilizado como agentes de entrecruzamiento fotoactivables, incluyendo diazirina, benzofenona, y azida de arilo, que tienen cada uno ventajas y desventajas ^10. Asimismo, hay varias etiquetas reportero que se han utilizado para aislar proteínas de unión a la sonda. Grupos informadores pueden ser funcionales por su cuenta, tales como la biotina se utiliza comúnmente o etiquetas fluorescentes, o pueden ser precursores que requieren más de funcionalización posterior a la etapa fotorreticulación, que tienen la ventaja de ser más pequeño y por lo tanto menos susceptible de comprometer la bioactividad ^11.

En este protocolo, se ha utilizado una sonda de fotoafinidad que contienen un grupo diazirina fotorreticulación, y un alquino terminal para la unión de un grupo informador a través de un Cu (I) -catalyzcicloadición ed azida-alquino Sharpless-Huisgen (o clic) reacción de ^12-15. Los estudios de SAR, la sonda de diseño y síntesis, y los resultados de estos estudios han sido publicados en otra parte ^16-18.

Protocol

NOTA: Este protocolo se adaptó de MacKinnon y Taunton ¹⁰ para su uso en células vivas.

1. Preparación de las células cultivadas

1. Preparar placas de cultivo de células estériles de 6 cm para el número de muestras deseadas (véase más adelante).
   NOTA: Una placa de células se utiliza por condición de tratamiento, pero si se requiere más proteína 2 o 3 platos se pueden preparar por condición y se combinaron después de la irradiación UV.
   1. Preparar al menos 3 placas de células; Control negativo con DMSO solamente (D), el tratamiento de la sonda solamente (P), y la sonda + competidor (C).
   2. Opcionalmente, preparar una 4 ^TH plato como un control sin UV, a ser tratados con la sonda, pero no sometido a la luz UV.
      NOTA: Si múltiples moléculas de la competencia son a ensayar, tales como diferentes análogos de la pequeña molécula de interés, preparar placas competidor adicionales según sea necesario.
2. Añadir células HEK293T con placas de cultivo en 4 ml de medio de cultivo. Utilizar 3,5 millones de cells por placa.
   NOTA: El número de células debe determinarse para cada tipo de célula de manera que las células son casi 100% de confluencia en el comienzo del experimento, a fin de lograr el máximo rendimiento de proteínas. Para HUVEC, utilizar 0,3 millones de células por placa. Una buena aproximación es un décimo de las células en un plato de 15 cm confluente. células HEK293T deben ser cultivadas en Dulbecco Modificado Eagles medio suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina.
3. Volver a las células a la incubadora de cultivo (37 ° C, 5% de CO ₂₎ durante la noche.

2. Tratamiento de las células y los foto-reticulación

1. El día siguiente, antes de la alícuota los siguientes fármacos en 1,5 ml tubos de microcentrífuga:
   1. Para el primer tratamiento, añadir 4 l de DMSO a 2 tubos y 4 l de competidor 10 mM (es decir, el compuesto de origen no modificado) a 1 tubo.
   2. Para el segundo tratamiento, añadir 16 l de DMSO a 1 tubo y 16 l de 50 y# 181; sonda de fotoafinidad M a 2 tubos.
      NOTA: La concentración óptima puede ser diferente para diferentes sondas (véase el debate), pero entre 200-500 nm es un buen punto de partida (aquí usamos 200 nM). La concentración de competidor debe ser superior a la de la sonda al menos 20 veces (aquí usamos 10 mM). La concentración final de DMSO debe ser igual en todas las placas y no debe exceder de 0,5% (volumen de 20 l).
2. Llevar las placas de las células dentro de la campana de cultivo de células y añadir los medicamentos pre-alícuotas del paso 2.1.1 de la siguiente manera: Aspirar 1 ml de medio de cultivo, volviendo a suspender el fármaco antes de la alícuota en los medios, y la adición de él con cuidado de nuevo a la caída de la placa sabio. Añadir el DMSO a la placa de DMSO (D) y la placa de la sonda (P), y añadir el competidor a la placa de la competencia (C). Volver las placas a la incubadora de cultivo de 30 min.
3. Con luces de la campana de cultivo atenuado, añadir la sonda antes de la alícuota del paso 2.1.2 a la sonda (P) y de competencia placas (C) y añadir laDMSO a la placa de DMSO (D), como anteriormente. Volver las placas a la incubadora de cultivo durante 1 hora.
4. Durante la incubación, preparar los siguientes elementos; Una bandeja de hielo que puede caber todas las planchas; tampón de lisis enfriado con hielo (PBS [pH 8,5] + 1x cóctel inhibidor de la proteasa [completa libre de EDTA, se diluyó la solución de 50x acciones hecha en agua]; 200 l / placa); tubos de microcentrífuga etiquetados D, P, o C para cada una de las diferentes condiciones de tratamiento, en el hielo.
5. 15 minutos antes del final de la incubación de 1 hora, establecieron la lámpara UV (365 nm) en el cuarto frío y la convierten en calentar la bombilla.
6. Después de 1 h de incubación con la sonda, colocar los platos en hielo. Lavar las células suavemente con 5 ml de PBS enfriado con hielo (pH 7,4) para eliminar el exceso de sonda. Vuelva a cubrir las células con 4 ml de PBS frío hielo.
7. Coloque la placa de células se centraron 3 cm bajo la lámpara UV en la parte superior de una bolsa de hielo para minimizar el calentamiento de la lámpara. Irradiar de 3 min. Retire el plato de la bandeja de hielo y repetir para todas las muestras.
8. UNespués de la irradiación, aspirar el PBS de las células y añadir 200 l de la PBS enfriado con hielo (pH 8,5) con inhibidores de la proteasa a cada placa. Desprender las células de la placa utilizando una espátula de goma y la transferencia de los tubos de microcentrífuga de pre-etiquetados en el hielo.
9. Añadir SDS a una concentración final de 0,4% (10 l de 10% SDS en 250 l de muestra).
   PRECAUCIÓN: SDS polvo es peligroso. Evitar la inhalación de polvo de SDS usando una máscara sobre la nariz y la boca.
10. Lisar las células por sonicación de la suspensión durante 10 impulsos (salida 1, ciclo de trabajo 30%) e incubar en hielo durante 1 min antes de una segunda ronda de 10 pulsos.
11. Si es necesario, retire 2 l de suspensión y se les presentarán bajo un microscopio óptico para asegurar la lisis celular completa.
12. Hervir las muestras en una placa caliente ajustada a 95 ° C durante 5 minutos para completar la lisis celular y desnaturalizar todas las proteínas.
13. Medir la concentración de proteína en cada muestra usando un ensayo de proteína con capacidad para un detergente espectrofotométrico, como THe ensayo Dc proteína ^19, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con un espectrofotómetro ajustado a medir la absorbancia a 750 nm.
14. Normalizar la concentración de proteína de 2,5 mg / ml (o si las concentraciones son inferiores a 2,5 mg / ml, a normalizar a la muestra con la concentración de proteína más bajo) mediante la adición de PBS pH 8,5 + 0,4% de SDS, según sea necesario (por ejemplo, si las muestras son 5 mg / ml en 250 l, añadir 250 l de PBS pH 8,5 + 0,4% de SDS para obtener una concentración final de 2,5 mg / ml).

3. La fijación de la etiqueta fluorescente por Click Química para la visualización de las proteínas marcadas

1. Retire 40 l de lisado celular y la transferencia a un nuevo tubo de microcentrífuga. Mantener los lisados ​​restantes para la reacción con biotina-azida (etapa 4).
2. Añadir los siguientes reactivos en orden: 0,2 l fluor-azida (1 mM solución madre en DMSO), 0,58 l TCEP (madre 100 mM en agua con 4 equivalentes de NaOH añadido, preparado fresco), y 3,38 l TBTA (1.Foto 7 mM en una proporción de 4: 1 de t-butanol al DMSO). Vórtice para mezclar.
3. Añadir 1,14 l CuSO ₄ 5H ₂ O (50 mM en agua) para iniciar la reacción. Vortex brevemente e incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad.
4. Añadir 50 l de tampón de muestra 2x SDS para extinguir la reacción. En este punto, ejecute las muestras directamente en un gel de SDS-PAGE ²⁰ para obtener los mejores resultados, o almacenar a -20 ° C durante la noche si es necesario.
5. Si la congelación de muestras, calentar durante 5 minutos a 95 ° C antes de cargar sobre el gel.
   NOTA: Como el peso molecular de la proteína diana es típicamente no se conoce en esta etapa, es aconsejable ejecutar 2 geles con diferentes concentraciones de acrilamida (es decir, 8% y 15%), o un gel de gradiente de rango de peso molecular amplia (es decir, 4-15%), para asegurar una cobertura completa del peso molecular.
6. Cuando el frente de colorante ha alcanzado el final del gel, continuar ejecutando el gel durante 5 minutos para asegurar todo el exceso de unreacted fluor-azida ha salido completamente el gel.
7. Quitar el gel a un recipiente con _ddH2O y se incuba durante 10 minutos con agitación suave, para quitar todo el exceso de fluor-azida.
8. Colocar el gel sobre una placa de vidrio y escanear el gel usando un escáner de gel Typhoon fluorescente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4. La unión de biotina etiqueta de química modular para Affinity purificación de proteínas marcadas

1. De los lisados ​​restantes de la etapa 3.1, utilizar la cantidad máxima después de la normalización de proteína de tal manera que todas las muestras son el mismo volumen (por ejemplo, si después de la normalización a 2,5 mg / ml de los volúmenes de muestra resultantes son 500, 550, y 600 l, utilice 500 l de cada uno).
2. Pre-borrar los lisados ​​mediante la adición de 50 l perlas de estreptavidina agarosa de alta capacidad, 2x prelavada con PBS (pH 7,4). Incubar 1 hora a 4 ° C con rotación.
3. Sedimentar las perlas por centrifugación a 1000 xg durante 3 min. Retire tél sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga en hielo y desechar las cuentas.
4. Retire el 1-2% de la muestra DMSO a un nuevo tubo etiquetado como "entrada". Añadir un volumen equivalente de tampón de muestra 2x SDS y se almacena a -20 ° C.
5. Por cada 500 l de lisado, añadir los siguientes reactivos: 1,38 l biotina-azida (madre 10 mM en DMSO), 5,5 l TCEP y 32.5 TBTA l. Vórtice para mezclar.
6. Añadir 11 l de CuSO ₄ 5H ₂ O por cada 500 l de lisado y agitar brevemente. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
7. Añadir 4 volúmenes de muestra de acetona fría a -20 ° C. Vortex las muestras y se incuban durante la noche a -80 ° C para precipitar completamente las proteínas y quitar sin reaccionar biotina-azida.
8. Centrifugar las muestras a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar las proteínas precipitadas.
9. Aspirar el sobrenadante por completo, y resolubilizar las proteínas por sonicación en 150 l de PBS (pH 7,4) + 1% de SDS.
10. Añadir las muestras de 30 l de pre-lavados perlas de agarosa con estreptavidina de alta capacidad y se incuba 1 hora a 4 ° C con rotación.
11. Sedimentar las perlas por centrifugación a 1000 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante que contiene las proteínas no unidas y descarte.
12. Añadir 1 ml de tampón de lavado (NaCl 400 mM, Tris 50 mM, 0,2% de SDS, pH 7,4) a las perlas y se incuba 5 min a temperatura ambiente con rotación.
13. Repita los pasos 4.12 y 4.13 3 veces.
14. Aspirar el tampón de lavado completo de las perlas, y añadir 30 l de tampón de muestra 2x SDS.
15. Incubar durante 5 minutos en un bloque de calor 95 ° C para liberar las proteínas de las perlas.
16. Centrifugar las perlas durante 1 min a 13.000 xg a la temperatura ambiente.
    NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para funcionar SDS-PAGE. Si la congelación de muestras, calentar durante 5 minutos a 95 ° C antes de su uso.
17. Cuidadosamentepipeta de la muestra de amortiguación que contiene proteínas fuera de las perlas, y cargar en SDS-PAGE al ²⁰ (ver consideraciones importantes a continuación). Las perlas se pueden guardar para más adelante si es necesario re-ebullición.
    NOTA: Para la detección de proteínas por tinción de plata, se obtienen mejores resultados utilizando un gel de 1 mm de espesor. Si una banda es que ser cortada del gel teñido con plata para el análisis de espectrometría de masas (MS), preparar todos los reactivos frescos de soluciones estériles y dejar un vacío bien en entre las muestras en el gel. Por cada banda de cortar desde el carril de la sonda, una rebanada paralelo debería adoptarse desde el carril de DMSO de modo que las proteínas del fondo se pueden restar. Para la validación de la identificación de proteínas por Western blot, es fundamental para cargar también la muestra de entrada desde el paso 4.4 al ejecutar el gel de SDS-PAGE.
18. Sigue un protocolo estándar, ya sea para la tinción de plata o Western blot ^{21 22} para detectar la proteína (s) objetivo.

Representative Results

Los resultados mostrados aquí se obtuvieron con una sonda de foto-afinidad del fármaco antifúngico itraconazol, el uso de que se ha publicado previamente ^16. Estos resultados demuestran el uso de la técnica de marcaje de fotoafinidad en vivo de células para identificar con éxito una importante proteína de unión itraconazol-como el 35 kDa proteína de membrana dependiente de la tensión del anión Canal 1 (VDAC1).

El protocolo anterior se realizó en células HEK293T utilizando la sonda de itraconazol para photolabeling e itraconazol no modificada como la molécula de competidor. Después de que las muestras se prepararon como se ha descrito, se sometieron a SDS-PAGE con el fin de separar las proteínas en peso molecular. unidades de marcador de peso molecular a la izquierda están en kilodaltons (kDa). El primer carril es la muestra de control DMSO (D), el segundo carril es la muestra de la sonda (P), y el tercer carril es la muestra de la competencia (C). bandas presentir en el único carril de DMSO se consideran fondo. En el análisis de estos datos, tenga en cuenta que las proteínas de unión específica debe estar ausente en la muestra de control DMSO, presente en la muestra de la sonda y la disminución en la muestra de la competencia. En este caso, la banda principal de proteína detectada sólo en la muestra de la sonda era una banda de aproximadamente 35 kDa (Figuras 1 y 3), que fue identificado por espectrometría de masas como VDAC1. La identidad de esta proteína se confirmó en la Figura 5 por Western blot utilizando un anticuerpo específico VDAC1. Tomados en conjunto, estos resultados nos permiten concluir que VDAC1 es una proteína de unión importante de itraconazol en estas células.

La Figura 1 demuestra la visualización de proteínas después de marcar con un marcador fluorescente (del paso 3 en el protocolo); Figura 3 muestra la visualización de proteínas por tinción de plata después de marcar con etiqueta de biotina y pe rforming purificación por afinidad (del paso 4 en el protocolo); y la Figura 5 demuestra la validación de la identificación de proteínas utilizando un anticuerpo específico para VDAC1. Figuras 2 y 4 ejemplifican lo que sucede si ciertos pasos en el protocolo no se realizan correctamente (se señala en leyendas de las figuras).

Figura 1. Un gel de SDS-PAGE de fluorescencia de escaneado representativa (de la etapa 3 en el protocolo) D = DMSO solamente.; P = sonda única (200 nM); C = la competencia (10 mM). unidades de marcador de peso molecular a la izquierda están en kilodaltons (kDa). La flecha indica la banda principal de proteína photolabeled a aproximadamente 35 kDa, que es específicamente presente en el carril de la sonda y se compitió por el exceso de distancia compuesto de origen, indicando que es una proteína de unión específica.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Un gel de fluorescencia de escaneado. El exceso de fluor-azida no se ha eliminado por completo del gel (pasos 3.6 y 3.7), causando grandes manchas negras que aparecen en la parte inferior del gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 3. Un gel SDS-PAGE teñido con plata representante después de biotina desplegable (del paso 4 en el protocolo). La flecha apunta a la misma banda que se visualizó en la Figura 1, que se escindió posteriormentedel gel y se sometió a análisis de MS para la identificación de proteínas. unidades de marcadores de la izquierda son en kilodaltons (kDa). Tenga en cuenta el espacio vacío en el medio de cada calle, con el fin de evitar la contaminación cruzada de las muestras durante la carga del gel y la banda de la escisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. La tinción con plata. Un gel teñido con plata con muy alta tinción de fondo, debido a la insuficiente pre-limpieza de los lisados ​​(paso 4.2) y / o el lavado de las perlas (paso 4,13). También tenga en cuenta la falta de espacio entre los carriles. Unidades de marcadores de la izquierda son en kilodaltons (kDa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Western blot de la proteína photolabeled 35-kDa, identificado por MS como VDAC1 después de biotina desplegable (del paso 4 en el protocolo). La señal está presente en el carril de la sonda y la disminución en el carril de la competencia, como en las figuras 1 y 3, lo que confirma la identidad de la proteína como VDAC1. Es importante que la fracción de entrada (de la etapa 4.4) se ejecuta junto con las muestras desplegables, para garantizar que los trabajos de anticuerpos y la proteína de interés se pueden detectar en el lisado. Un ligero aumento en el peso molecular se puede observar en las muestras desplegables debido al tamaño agregado de la sonda unida covalentemente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Diferentes enfoques para la identificación de los objetivos de moléculas pequeñas se pueden agrupar en dos categorías: de arriba hacia abajo, cuando se utilice el fenotipo celular del fármaco para reducir sus posibles objetivos sobre la base de sus funciones conocidas, o de abajo hacia arriba, donde el objetivo se identifica directamente por medios químicos o genéticos ^3. De arriba hacia abajo o estudios fenotípicos pueden identificar ciertos procesos celulares afectados por el fármaco (por ejemplo, la transcripción / traducción / síntesis de ADN, bloqueo del ciclo celular, activación de la vía de señalización / inhibición, etc.) que podrían ser la base del fenotipo final de la molécula pequeña, que ayuda a reducir la lista de posibles objetivos de las proteínas implicadas en estos procesos. Sin embargo, una desventaja importante del enfoque de arriba hacia abajo es que se basa en lo que ya se sabe acerca de estos procesos, y por lo tanto está sesgada en contra de blancos cuyas funciones no se han caracterizado o no se han descrito previamente para participaren un proceso dado.

El enfoque de abajo hacia arriba evita este problema mediante la identificación de la diana directa de una manera imparcial. Esto se puede lograr por medios genéticos; por ejemplo, mediante el cribado de una biblioteca de shRNA para líneas celulares desmontables que confieren resistencia o hipersensibilidad a la droga, o mediante el aislamiento de líneas de células resistentes a los medicamentos y el uso de la secuenciación genómica para determinar qué genes contienen mutaciones ^1. Estos tipos de experimentos pueden identificar las proteínas clave o vías relacionadas con la actividad de la droga, pero no necesariamente resultar directamente la unión a la proteína identificada. enfoques químicos, por otra parte, por lo general implican el uso de una sonda química para unirse a la proteína diana directamente y permitir su aislamiento e identificación. El diseño de una sonda que conserva su capacidad para unirse a la proteína diana requiere el uso de estudios de SAR para identificar una posición en la molécula que puede ser modificado sin pérdida significativa de actividad. se ALSO requiere que la sonda sea capaz de unirse a su objetivo, ya sea de forma covalente o con alta afinidad suficiente que se puede aislar de otras proteínas celulares (es decir, purificado por afinidad), y que estas proteínas retienen su capacidad de unirse a la molécula pequeña fuera de su nativa entorno celular. Este requisito puede ser problemático para determinados objetivos; por ejemplo, las proteínas integrales de membrana a menudo requieren un entorno de lípidos específicos para mantener su conformación activa, y pueden llegar a ser agregada o orientado incorrectamente para la unión una vez que se lisan las células ligando. El método descrito en este manuscrito evita estos peligros potenciales de la purificación por afinidad al permitir que la modificación covalente de la proteína diana dentro del ambiente celular nativo, de modo que las manipulaciones posteriores no pueden interrumpir la interacción fármaco-diana ^10.

La implementación exitosa del protocolo descrito depende de varios factores. Es importante que la taproteína rget de la molécula pequeña sea suficientemente abundante en el tipo celular elegido para photolabeling. El tipo celular más potentemente afectada por la molécula pequeña puede ser un punto de partida bueno, pero puede ser necesario probar varios tipos de células diferentes para encontrar uno con rendimientos elevados de proteína diana. Alternativamente, el enriquecimiento de las diferentes poblaciones de proteínas por fraccionamiento subcelular puede aumentar el rendimiento objetivo, mientras que la disminución de etiquetado de fondo. Detección etiquetada de manera fluorescente proteínas es en general mucho más sensible que la detección de proteínas por tinción de plata; por lo tanto, bandas detectadas por fluorescencia pueden no ser detectable por tinción con plata después de la biotina desplegable. La ampliación del experimento mediante el uso de múltiples platos de células por condición de tratamiento puede ayudar a superar este problema de detección. El aumento de la concentración de la sonda también puede ayudar a mejorar los rendimientos desplegable. bandas específicas también pueden ser oscurecidos por alto fondo, en cuyo caso el lavado más riguroso, pre- múltiplela limpieza de pasos, o el uso de perlas de una composición diferente (por ejemplo, perlas magnéticas en lugar de agarosa) puede ser útil. Sin embargo, si la proteína diana es demasiado bajo en abundancia puede que no sea posible detectar por tinción de plata. Además, si la proteína diana no migra como una banda fuerte en SDS-PAGE (tales como las proteínas fuertemente glicosiladas que) también será más difícil de visualizar. Otras modificaciones en el protocolo podrían hacerse para superar estos problemas, tales como la realización de la proteómica conjunto de muestras o SILAC (isótopos estables de etiquetado de Aminoácidos en cultivo celular) para identificar proteínas marcadas después desplegable, lo que elimina la necesidad de cortar una banda cabo de un gel teñido con plata.

Otra consideración importante es la concentración de la sonda para ser utilizado en el experimento. Idealmente, se debe usar la menor cantidad de sonda que produce una señal detectable. Las concentraciones más altas darán más alta de la señal, pero también es mayor el etiquetado de fondo, y una vez que todos of los sitios de unión en el objetivo de afinidad más alta se saturan puede haber objetivos menor afinidad adicionales que comienzan a detectar. Por consiguiente, la concentración óptima debe determinarse empíricamente comenzando con una concentración relativamente alta (1-2 M) y titulando hacia atrás hasta sólo una o dos proteínas están etiquetados y la competencia es obvio.

La potencia de la sonda puede ser tomada en consideración en la elección de la concentración de partida; sin embargo, dependiendo de la abundancia de destino y el modo de inhibición, puede no ser una buena correlación entre la actividad de la sonda y detección de la diana (por ejemplo, una sonda con la inhibición de bajo nanomolar no necesariamente tire hacia abajo suficiente proteína a bajas concentraciones nanomolares a ser detectable ). Por lo tanto, es preferible determinar la concentración más adecuada empíricamente usando la detección de proteínas marcadas como una lectura. La concentración de competidor utilizado debe ser superior a la de la sonda por almenos 20 veces, pero la atención también se deben tomar para no exceder el límite de solubilidad del competidor.

En el caso de que múltiples proteínas son derribados por la sonda, la identificación de la proteína funcionalmente relevante se vuelve más complicado. Sin embargo, hay varias maneras de ayudar a reducir las proteínas diana potenciales. Como se mencionó anteriormente, valorando de nuevo la concentración de la sonda puede ayudar a mejorar la especificidad de etiquetado. A medida que la concentración de sonda de gotas, proteínas de unión de mayor afinidad deben conservar su intensidad de la señal mientras que las proteínas de menor afinidad deben desaparecer. La deconvolución de múltiples objetivos potenciales también puede ser ayudada por el uso de análogos químicos del compuesto original con diversos grados de actividad. En teoría, para un objetivo funcionalmente relevante, no debería haber una correlación entre la unión a la diana y la actividad del análogo. Por ejemplo, la competencia por los análogos inactivos del compuesto original se puede utilizar para descartar p vinculanteroteins que no están involucrados en los efectos fenotípicos del compuesto. Del mismo modo, análogos activos, u otras pequeñas moléculas que inducen el mismo fenotipo como el compuesto original, se pueden utilizar para ayudar a descartar en proteínas de unión correspondientes. En la misma línea, el uso de una sonda de fotoafinidad inactivos o no relacionado estructuralmente puede ayudar a descartar las proteínas irrelevantes.

Validación de la proteína diana requiere primero la verificación de la proteína identificada por MS. Esto se puede lograr fácilmente por transferencia de Western después de la biotina desplegable, suponiendo un anticuerpo de alta calidad para la proteína diana está disponible. Sin embargo, cuando se trabaja con una proteína desconocida es fácil perder mucho tiempo y dinero en malos anticuerpos. Por tanto, es crítico que el anticuerpo ser validada, y que detecta una banda específica en el lisado de las células se utiliza para el marcaje (es decir, la muestra de entrada). Además, debido a que el rendimiento de proteína después desplegable puede ser baja, la hormigaibody tiene que ser muy sensible, y dependiendo del anticuerpo puede ser necesario altas concentraciones (hasta 1: 100 dilución en algunos casos). Para evitar estos problemas, una versión marcada de la proteína puede expresarse en las células antes de photolabeling, y la etiqueta se puede utilizar para detectar la proteína después desplegable.

Una vez confirmada la ID de proteína, la validación funcional de la diana se puede lograr mediante manipulaciones genéticas y / o farmacológicos, o ensayos funcionales de la diana de interés, para demostrar que la actividad de la diana se ve afectada por la unión de moléculas pequeñas. El sitio de unión se puede asignar mediante la identificación del aminoácido modificado por la sonda, o la determinación de la estructura de 3 dimensiones de la molécula pequeña unida por cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN. Idealmente, si un mutante se puede encontrar que pierde su capacidad de unirse a la molécula pequeña, debe ser capaz de suprimir la actividad de la molécula pequeña cuando se expresa en lugar de la pro-tipo salvajetein. También puede ser deseable para mostrar la especificidad de la unión a la diana sobre otras proteínas estructuralmente relacionadas o "fuera de diana".

Este protocolo general se puede utilizar en cualquier aplicación que requiera la medición directa de la pequeña molécula de unión a una proteína objetivo, siempre y cuando una sonda se puede hacer que retiene la actividad biológica del compuesto padre. Las aplicaciones potenciales incluyen, pero no se limitan a, la identificación de dianas moleculares de nuevos compuestos, la evaluación del potencial fuera de los objetivos de los medicamentos existentes, confirmando la unión directa de una molécula pequeña a una proteína particular de interés, la determinación de la competencia de la unión por otras moléculas pequeñas en el mismo sitio de unión en una proteína, y el descubrimiento de nuevos receptores de ligandos de origen natural o endógeno.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp	Spectroline	FC100	UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free	Roche Life Science	11873580001	Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Set to output 1, duty 30%.
Fluorescent gel scanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualified	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin solution	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676