L'identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Introduction

piccole molecole bioattive fondamentalmente funzionano interagendo ed alterare la funzione di uno o più molecole "target", più comunemente proteine, nella cellula. In scoperta di farmaci, quando un composto attivo viene scoperto attraverso lo screening fenotipico, identificazione del bersaglio molecolare (s) di detto composto è cruciale, non solo per la comprensione del meccanismo di azione e potenziali effetti collaterali del composto, ma anche per potenzialmente scoprire nuova biologia alla base del modello di malattia e aprendo la strada allo sviluppo di nuove classi meccanicistiche terapie in ^1. Anche se l'identificazione di destinazione non è richiesta per un farmaco da utilizzare terapeuticamente, negli ultimi anni c'è stato un crescente riconoscimento del fatto che nuovi farmaci candidati hanno maggiori probabilità di avere successo negli studi clinici, e quindi produrre rendimenti migliori degli investimenti, se un bersaglio convalidato è noto ^2. Così, c'è stato un crescente interesse metodi per identificare piccoleproteine ​​bersaglio molecola.

Un esperimento di identificazione di destinazione classica si basa in genere su purificazione di affinità, dove la piccola molecola di interesse è immobilizzato su una resina e incubato con lisati cellulari integrali, dopo di che le proteine ​​non legate vengono spazzati via e le restanti proteine ​​vengono eluite e identificati ^3. Sebbene questa tecnica è stata utilizzata per identificare i bersagli di molte piccole molecole ^4, è idoneo come metodo ID destinazione universale per diversi motivi. Innanzitutto, la proteina bersaglio deve mantenere la sua conformazione nativa upon lisi cellulare al fine di mantenere la sua capacità di legarsi alla piccola molecola. Questo può essere particolarmente problematico per proteine ​​di membrana, che spesso subiscono cambiamenti conformazionali dopo essere stato rimosso dal loro ambiente nativo, o semplicemente aggregata e precipitano dalla soluzione. In secondo luogo, la piccola molecola deve essere modificata chimicamente in modo tale che esso può essere immobilizzato sulla resina mantenendosua capacità di legare la proteina bersaglio. tasche vincolanti profondi possono pertanto diventare inaccessibile a una piccola molecola una volta che è fissato alla resina. In terzo luogo, l'affinità di legame deve essere sufficientemente elevata che l'interazione viene mantenuta durante le fasi di lavaggio, rendendo l'identificazione delle interazioni minore affinità impegnativi. Quarto, condizioni ambientali, quali pH, concentrazione di ioni, o la presenza di altre molecole endogene possono variare spazialmente all'interno della cellula e sono talvolta prerequisiti per interazioni farmaco-bersaglio. Così, trovare le condizioni corrette per consentire e mantenere al di fuori della cellula legame può richiedere una quantità significativa di tentativi ed errori.

etichettatura Photoaffinity elude questi problemi, consentendo il legame di una piccola molecola e il suo obiettivo nel contesto nativo di una cellula covalente. Invece di immobilizzare la piccola molecola ad una grande resina ingombrante, la molecola viene invece modificato chimicamente installare due piccoli g funzionaliruppi: un residuo fotoattivabile che permette covalente reticolazione alla proteina bersaglio quando irradiato con una particolare lunghezza d'onda della luce, e un gruppo giornalista che permette la proteina bersaglio da rilevare e successivamente isolato. cellule vive sono trattati con la sonda photoaffinity, la sonda si lega covalentemente e reticola alla proteina bersaglio, e il complesso sonda proteina è poi isolato intatto. La specificità di legame al bersaglio sonda è dimostrata effettuando un esperimento di competizione in parallelo, dove un eccesso del composto originario è utilizzato per competere via legame della sonda alla proteina bersaglio.

La progettazione e la sintesi di sonde photoaffinity varia notevolmente da una piccola molecola ad un altro, e non saranno coperti in questo protocollo; tuttavia, diversi ottimi discussioni sul tema sono stati pubblicati ^5-9. La considerazione principale è che la sonda mantiene la bioattività del composto originario, quindi presumabmente vincolante per la stessa destinazione (s). Relazione struttura-attività (SAR) studi devono essere effettuati per determinare quali parti della molecola possono essere modificate senza perdita di bioattività. Una varietà di diversi gruppi chimici sono stati utilizzati come reticolanti fotoattivabile, tra diazirine, benzofenone, e aril azide, che hanno ciascuno vantaggi e svantaggi ^10. Inoltre, ci sono più tag giornalista che sono stati utilizzati per isolare proteine ​​sonda vincolante. Gruppi Reporter possono essere funzionale da soli, come la biotina comunemente usato o tag fluorescenti, o possono essere precursori che richiedono ulteriori funzionalizzazione successivamente alla fase photocrosslinking, che hanno il vantaggio di essere più piccolo e quindi meno probabilità di compromettere bioattività ^11.

In questo protocollo, abbiamo utilizzato una sonda photoaffinity contenente un gruppo diazirine photocrosslinking, e un alchino terminale per il fissaggio di un gruppo giornalista attraverso un Cu (I) -catalyzEd azide-Acetilene Sharpless-Huisgen cicloaddizione (o click) reazione di ^12-15. Gli studi SAR, sonda progettazione e sintesi, e risultati di questi studi sono stati pubblicati altrove ^16-18.

Protocol

NOTA: Questo protocollo è stato adattato da MacKinnon e Taunton ¹⁰ per l'utilizzo in cellule vive.

1. Preparazione di cellule in coltura

1. Preparare sterili 6 cm piatti di coltura cellulare per il numero di campioni desiderati (vedi sotto).
   NOTA: Un piatto di cellule viene utilizzato per il trattamento condizione, ma se è necessario più proteine ​​2 o 3 piatti possono essere preparati per ogni condizione e combinati, dopo irradiazione UV.
   1. Preparare almeno 3 piatti di cellule; controllo negativo con DMSO solo (D), unico trattamento Probe (P), e sonda + concorrente (C).
   2. Facoltativamente, preparare un 4 ^° piatto come controllo non UV, da trattare con sonda ma non sottoposto a luce UV.
      NOTA: Se più molecole concorrenti devono essere testati, quali differenti analoghi della piccola molecola di interesse, preparare piastre concorrenti aggiuntivi come necessario.
2. Aggiungere cellule HEK293T a piatti della cultura in 4 terreni di coltura ml. Utilizzare 3,5 milioni di cells per piastra.
   NOTA: Il numero di celle deve essere determinato per ciascun tipo di cellula in modo che le cellule sono quasi il 100% confluenti all'inizio dell'esperimento, al fine di ottenere la massima resa di proteine. Per HUVEC, utilizzare 0,3 milioni di cellule per piastra. Una buona approssimazione è 1/10 delle cellule in un piatto cm confluenti 15. HEK293T cellule devono essere coltivate in Dulbecco Modified Eagles medio supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina.
3. Ritorna le cellule alla cultura incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante la notte.

2. Il trattamento di cellule e Photocrosslinking

1. Il giorno successivo, pre-aliquota dei seguenti farmaci in provette da 1,5 ml microcentrifuga:
   1. Per il primo trattamento, aggiungere 4 ml di DMSO a 2 tubi e 4 ml di 10 mM concorrente (cioè, il composto progenitore non modificato) a 1 tubo.
   2. Per il secondo trattamento, aggiungere 16 ml di DMSO a 1 tubo e 16 ml di 50 &# 181; M sonda photoaffinity a 2 tubi.
      NOTA: La concentrazione ottimale può essere diverso per i diversi sonde (vedi discussione), ma tra 200-500 nm è un buon punto di partenza (qui usiamo 200 nm). La concentrazione di concorrente dovrebbe superare quella della sonda almeno 20 volte (qui usiamo 10 pM). La concentrazione finale di DMSO dovrebbe essere uguale in tutte le piastre e non deve superare lo 0,5% (20 volumi mL).
2. Portare le piastre delle celle nella cappa di coltura cellulare e aggiungere i farmaci pre-aliquotati dal punto 2.1.1 come segue: Aspirare 1 ml di terreni di coltura, risospendere il farmaco pre-aliquotati nei media, e delicatamente aggiungendo di nuovo al calo piatto saggio. Aggiungere il DMSO alla (D) piastra e la piastra sonda (P) DMSO, e aggiungere il concorrente del (C) Piastra concorrenza. Ritorna le piastre alla cultura incubatore per 30 min.
3. Con le luci del cofano cultura oscurato, aggiungere la sonda pre-aliquotati dal punto 2.1.2 per sondare (P) e della concorrenza piastre (C) e aggiungere ilDMSO alla piastra DMSO (D), come sopra. Riportare le piastre per l'incubatore di coltura per 1 ora.
4. Durante l'incubazione, preparare i seguenti elementi; Un vassoio di ghiaccio che può andare bene tutti i piatti; tampone di lisi ghiacciata (PBS [pH 8,5] + inibitore della proteasi 1x cocktail [completa-EDTA libera, diluita dalla soluzione 50x magazzino effettuate in acqua]; 200 l / piastra); provette per microcentrifuga etichettati D, P o C per ciascuna delle diverse condizioni di trattamento, sul ghiaccio.
5. 15 min prima della fine dell'incubazione 1 hr, impostare la lampada UV (365 nm) in camera fredda e accenderlo per riscaldare la lampadina.
6. Dopo 1 ora di incubazione con la sonda, posizionare piatti sul ghiaccio. Lavare le cellule delicatamente con 5 ml di ghiacciata PBS (pH 7.4) per rimuovere la sonda in eccesso. Ri-coprire le cellule con PBS 4 ml ghiacciata.
7. Porre la capsula di cellule centrati 3 cm sotto la lampada UV su di un pacchetto di ghiaccio per minimizzare il riscaldamento dalla lampada. Irradiare per 3 min. Rimuovere il piatto al vassoio di ghiaccio e ripetere per tutti i campioni.
8. UNopo irradiazione, aspirare il PBS dalle cellule e aggiungere 200 ml di ghiacciata PBS (pH 8,5) con inibitori della proteasi per ogni piatto. Staccare le cellule dalla piastra con una spatola di gomma e il trasferimento ai tubi microcentrifuga pre-etichettati su ghiaccio.
9. Aggiungere SDS a una concentrazione finale di 0,4% (10 ml di 10% SDS in 250 microlitri di campione).
   ATTENZIONE: SDS polvere è pericolosa. Evitare l'inalazione di polvere SDS indossando una maschera sul naso e la bocca.
10. Lyse le cellule sonicating la sospensione per 10 impulsi (uscita 1, duty cycle del 30%) e incubare in ghiaccio per 1 minuto prima di un secondo giro di 10 impulsi.
11. Se necessario, rimuovere le 2 ml di sospensione e controllare sotto un microscopio ottico per garantire la completa lisi cellulare.
12. Far bollire i campioni su una piastra calda impostata a 95 ° C per 5 minuti per completare la lisi cellulare e denaturate tutte le proteine.
13. Misurare la concentrazione di proteine ​​in ciascun campione usando un saggio proteico detergente compatibile spettrofotometrica, come thtest e Dc proteine ^​​19, secondo le istruzioni del produttore, con uno spettrofotometro impostato per misurare l'assorbanza a 750 nm.
14. Normalizzare la concentrazione proteica di 2,5 mg / ml (o se le concentrazioni sono inferiori a 2,5 mg / ml, normalizzare il campione con la concentrazione proteica basso) aggiungendo PBS pH 8,5 + 0,4% SDS come necessario (ad esempio, se i campioni sono 5 mg / ml in 250 microlitri, aggiungere 250 microlitri di PBS pH 8,5 + 0,4% SDS per ottenere una concentrazione finale di 2,5 mg / ml).

3. Collegamento di Tag fluorescente da Click Chimica per la visualizzazione delle proteine ​​marcate

1. Rimuovere 40 ml di lisato cellulare e trasferimento in una nuova provetta. Mantenere i restanti lisati per la reazione con biotina-azide (fase 4).
2. Aggiungere i seguenti reagenti in ordine: 0,2 ml Fluor-azide (1 mM soluzione madre in DMSO), 0,58 ml TCEP (100 mM magazzino in acqua con 4 equivalenti NaOH aggiunto, preparato fresco), e 3,38 ml TBTA (1.7 mm magazzino in un rapporto 4: 1 di t-butanolo a DMSO). Vortex per miscelare.
3. Aggiungere 1,14 ml CuSO ₄ -5H ₂ O (50 mM in acqua) per attivare la reazione. Vortex brevemente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
4. Aggiungere 50 ml di tampone campione SDS 2x per placare la reazione. A questo punto, eseguire i campioni direttamente su un gel SDS-PAGE ²⁰ per i migliori risultati, o conservare a -20 ° C per una notte, se necessario.
5. Se congelamento campioni, riscaldare per 5 minuti a 95 ° C prima di caricare sul gel.
   NOTA: Dato che il peso molecolare della proteina bersaglio è in genere non noto in questa fase, è consigliabile eseguire 2 gel con concentrazioni di acrilamide differenti (cioè, l'8% e il 15%), o un gel gradiente molecolare intervallo di peso ampia (cioè, 4-15%), al fine di garantire una copertura completa del peso molecolare.
6. Quando il fronte del colorante ha raggiunto la fine del gel, continuare a eseguire il gel per altri 5 minuti per assicurare tutto l'eccesso unreacted Fluor-azide ha completamente uscito il gel.
7. Rimuovere il gel in un contenitore con DDH ₂ O e incubare per 10 minuti con agitazione, per lavare via ogni eccesso Fluor-azide.
8. Porre il gel su una lastra di vetro e digitalizzare il gel usando uno scanner gel Typhoon fluorescente secondo le istruzioni del produttore.

4. Fissaggio di biotina Tag da Click Chimica per affinità purificazione di proteine ​​marcate

1. Dei restanti lisati dal punto 3.1, usare la quantità massima dopo la normalizzazione proteine ​​tale che tutti i campioni sono lo stesso volume (per esempio, se dopo la normalizzazione a 2,5 mg / ml i volumi dei campioni risultanti sono 500, 550, e 600 microlitri, utilizzare 500 ml di ciascuno).
2. Pre-cancellare i lisati con l'aggiunta di 50 ml ad alta capacità perline streptavidina agarosio, 2x pre-lavate con PBS (pH 7,4). Incubare 1 ora a 4 ° C con rotazione.
3. Agglomerare le perline per centrifugazione a 1.000 xg per 3 min. rimuovere tegli surnatante in una nuova provetta su ghiaccio e gettare le perle.
4. Rimuovere 1-2% del campione DMSO in una nuova provetta etichettata "input". Aggiungere un volume equivalente di tampone campione 2x SDS e conservare a -20 ° C.
5. Per 500 ml di lisato, aggiungere i seguenti reagenti: 1.38 ml biotina-azide (10 mM magazzino in DMSO), 5,5 ml TCEP, e 32,5 ml TBTA. Vortex per miscelare.
6. Aggiungere 11 ml CuSO ₄ -5H ₂ O per 500 ml di lisato e vortex brevemente. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
7. Aggiungere 4 volumi di campione di acetone refrigerate a -20 ° C. Vortex i campioni e incubare durante la notte a -80 ° C per precipitare completamente le proteine ​​e rimuovere reagito biotina-azide.
8. Centrifugare i campioni a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C per sedimentare le proteine ​​precipitate.
9. Aspirare il surnatante completamente, e resolubilize le proteine ​​mediante sonicazione in 150 microlitri di PBS (pH 7,4) + 1% SDS.
10. Aggiungere i campioni da 30 microlitri pre-lavati ad alta capacità streptavidina agarosio e incubare 1 ora a 4 ° C con rotazione.
11. Agglomerare le perline per centrifugazione a 1.000 xg per 3 min. Aspirare il surnatante contenente proteine ​​non legate e degli scarti.
12. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0.2% SDS, pH 7.4) ai talloni e incubare 5 min a temperatura ambiente con rotazione.
13. Ripetere i punti 4.12 e 4.13 3 volte.
14. Aspirare il tampone di lavaggio completamente dalle perline, e aggiungere 30 ml di tampone campione 2x SDS.
15. Incubare per 5 minuti su un blocco C di calore 95 ° per rilasciare le proteine ​​dalle perline.
16. Centrifugare le perline per 1 min a 13.000 xg a temperatura ambiente.
    NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a -20 ° C fino al momento di eseguire SDS-PAGE. Se congelamento campioni, riscaldare per 5 minuti a 95 ° C prima dell'uso.
17. AccuratamentePipettare il tampone campione contenente proteine ​​al largo delle perle, e caricare su SDS-PAGE ²⁰ (vedi importanti considerazioni di seguito). Le sfere possono essere salvate per ribollitura seguito, se necessario.
    NOTA: Per la rivelazione delle proteine ​​mediante macchia d'argento, i risultati migliori si ottengono utilizzando un gel di spessore 1 mm. Se una banda da tagliare su gel d'argento macchiate per analisi spettrometria di massa (MS), preparare tutti i reagenti freschi soluzioni sterili e lasciare un pozzo vuoto tra campioni sul gel. Per ogni fascia tagliata dalla corsia della sonda, una fetta parallelo dovrebbe essere presa dalla corsia DMSO in modo che le proteine ​​di fondo possono essere sottratti. Per la convalida di ID proteine ​​mediante western blot, è fondamentale per caricare anche il campione in ingresso dal punto 4.4 quando si esegue il gel SDS-PAGE.
18. Seguire un protocollo standard per entrambi argento colorazione ²¹ o Western blot ²² per rilevare la proteina bersaglio (s).

Representative Results

I risultati riportati sono stati ottenuti con una sonda foto-affinità del itraconazolo farmaco antimicotico, il cui uso è stato precedentemente pubblicato ^16. Questi risultati dimostrano l'uso della tecnica di etichettatura photoaffinity live-cell per identificare correttamente una proteina itraconazolo vincolante come 35 kDa proteina di membrana Voltage-Dependent dell'anione Canale 1 (VDAC1).

Il protocollo di cui sopra è stata effettuata in cellule HEK293T utilizzando la sonda itraconazolo per photolabeling e itraconazolo non modificato come la molecola concorrente. Dopo che i campioni sono stati preparati come descritto, sono stati sottoposti a SDS-PAGE per separare le proteine ​​dal peso molecolare. Molecolari unità marcatore di peso a sinistra sono in kilodaltons (kDa). La prima corsia è campione di controllo DMSO (D), la seconda corsia è campione sonda (P), e la terza corsia è campione concorrenza (C). bande prisentirsi nell'unica corsia DMSO sono considerati sfondo. Nell'analizzare questi dati, notare che specifica proteine ​​leganti dovrebbe essere assente nel campione di controllo DMSO, presenti nel campione sonda e diminuita nel campione concorso. In questo caso, il gruppo principale proteina rilevata solo nel campione sonda era una banda di circa 35 kDa (figure 1 e 3), che è stato identificato mediante spettrometria di massa come VDAC1. L'identità di questa proteina è stata confermata in Figura 5 mediante Western blot utilizzando un anticorpo specifico VDAC1. Presi insieme, questi risultati ci permettono di concludere che VDAC1 è una delle principali proteine ​​di legame di itraconazolo in queste cellule.

La figura 1 mostra la visualizzazione delle proteine ​​dopo marcatura con un tag fluorescenti (dal punto 3 del protocollo); Figura 3 mostra la visualizzazione di proteine ​​da macchia d'argento dopo la marcatura con tag biotina e pe rforming purificazione di affinità (dal punto 4 in protocollo); la figura 5 illustra la convalida dell'ID proteine ​​utilizzando un anticorpo specifico per VDAC1. Figure 2 e 4 esemplificano cosa succede se alcune fasi del protocollo non vengono eseguite correttamente (indicato nella legenda delle figure).

Figura 1. Un gel SDS-PAGE fluorescenza a scansione rappresentante (dal punto 3 del protocollo) D = DMSO solo.; P = Sonda solo (200 nm); C = la concorrenza (10 micron). Molecolari unità marcatore di peso a sinistra sono in kilodaltons (kDa). La freccia indica la principale proteina banda photolabeled a circa 35 kDa che è specificamente presente nella corsia della sonda ed è gareggiato via dal composto progenitore eccesso, a indicare che si tratta di una specifica proteina di legame.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Un gel fluorescenza-scansione. L'eccesso di fluoro-azide, non è stato completamente rimosso dal gel (passi 3.6 e 3.7), provocando grandi macchie di colore ad apparire nella parte inferiore del gel. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Un gel SDS-PAGE argento macchiate rappresentante dopo biotina pull-down (dal punto 4 in protocollo). La freccia indica la stessa banda che è stata visualizzata in figura 1, che è stata successivamente asportatodal gel e sottoposti ad analisi MS per l'identificazione di proteine. unità marcatore sulla sinistra sono in kilodaltons (kDa). Notare lo spazio vuoto di mezzo ogni corsia, al fine di evitare la contaminazione incrociata di campioni durante caricamento del gel e banda escissione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. colorazione argento. Un gel argento-colorati con sfondo molto elevata colorazione, a causa di insufficiente pre-compensazione dei lisati (passo 4.2) e / o il lavaggio delle microsfere (passo 4.13). Si noti inoltre la mancanza di spazio tra le corsie. Unità marcatore sulla sinistra sono in kilodaltons (kDa). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Western blot delle proteine ​​photolabeled 35-kDa, identificato da MS come VDAC1 dopo biotina pull-down (dal punto 4 in protocollo). Il segnale è presente nella corsia sonda e diminuito nella corsia di competizione, come nelle figure 1 e 3, confermando l'identità della proteina come VDAC1. È importante che la frazione di ingresso (dal punto 4.4) viene eseguito a fianco dei campioni di pull-down, per garantire che i lavori di anticorpi e la proteina di interesse può essere rilevato nel lisato. Un lieve aumento di peso molecolare può essere osservato nei campioni di pull-down a causa delle dimensioni aggiunta della sonda covalentemente attaccata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Diversi approcci per identificare gli obiettivi di piccole molecole possono essere sostanzialmente raggruppati in due categorie: top-down, in cui il fenotipo cellulare del farmaco è usato per limitare i suoi potenziali obiettivi in ​​base alle loro funzioni note, o bottom-up, in cui l'obiettivo è identificato direttamente con mezzi chimici o genetici ^3. Top-down o studi fenotipici in grado di identificare alcuni processi cellulari colpite dal farmaco (per esempio, la trascrizione / traduzione / sintesi del DNA, il blocco del ciclo cellulare, segnalando l'attivazione della via / inibizione, ecc), che potrebbe essere alla base del fenotipo finale della piccola molecola, che aiuta a restringere la lista dei potenziali obiettivi di proteine ​​coinvolte in questi processi. Tuttavia, un grande svantaggio dell'approccio top-down è che si basa su ciò che è già noto su questi processi, ed è quindi prevenuto contro obiettivi le cui funzioni non sono state caratterizzate o non sono stati precedentemente descritto di essere coinvoltiin un determinato processo.

L'approccio bottom-up aggira questo problema identificando il target direttamente in modo imparziale. Ciò può essere ottenuto con mezzi genetici; per esempio, attraverso lo screening di una libreria shRNA per linee cellulari smontabili che conferiscono resistenza o ipersensibilità al farmaco, o isolando linee cellulari resistenti ai farmaci e utilizzando sequenziamento genomico per determinare quali geni contengono mutazioni ^1. Questi tipi di esperimenti possono identificare proteine ​​chiave o percorsi connessi all'attività del farmaco, ma non necessariamente dimostrare diretta legame alla proteina identificata. approcci chimici, invece, tipicamente coinvolgono l'uso di una sonda chimica di legarsi alla proteina bersaglio direttamente e consentire l'isolamento e l'identificazione. Progettare una sonda che mantiene la sua capacità di legarsi alla proteina bersaglio richiede l'uso di studi SAR per identificare una posizione sulla molecola che può essere modificato senza significativa perdita di attività. E 'also richiede che la sonda sia in grado di legare il suo obiettivo sia covalentemente o con alta affinità sufficiente che esso può essere isolato da altre proteine ​​cellulari (cioè, purificato per affinità), e che queste proteine ​​mantengono la loro capacità di legare la piccola molecola di fuori della loro nativa ambiente cellulare. Questo requisito può essere problematico per alcuni obiettivi; per esempio proteine ​​integrali di membrana spesso richiedono un ambiente lipidico specifico per mantenere la loro conformazione attiva, e può diventare aggregati o impropriamente orientato per il legame volta che le cellule vengono lisate ligando. Il metodo descritto in questo manoscritto evita questi potenziali insidie ​​di purificazione per affinità consentendo la modifica covalente della proteina bersaglio all'interno dell'ambiente cellulare nativo, in modo che le manipolazioni successive non possono interrompere l'interazione farmaco-porta ^10.

Il successo dell'attuazione del protocollo descritto dipende da diversi fattori. È importante che la target proteine ​​della piccola molecola sufficientemente abbondante nel tipo di cellula scelto per photolabeling. Il tipo di cella più potentemente colpiti dalla piccola molecola può essere un buon punto di partenza, ma può essere necessario provare più tipi di cellule differenti per trovare uno con rese proteine ​​di bersaglio. In alternativa, l'arricchimento delle diverse popolazioni di proteine ​​per frazionamento subcellulare può aumentare la resa di destinazione pur diminuendo l'etichettatura di fondo. Il rilevamento di fluorescenza tagged proteine ​​è in generale molto più sensibile di rilevazione delle proteine ​​da macchia d'argento; Pertanto, bande rilevate mediante fluorescenza possono non essere individuabile mediante colorazione argento dopo la biotina pull-down. Scaling l'esperimento utilizzando più piatti a base di cellule per condizione di trattamento può aiutare a superare questo problema di rilevamento. L'aumento della concentrazione di sonda può anche contribuire a migliorare i rendimenti a discesa. bande specifiche possono anche essere oscurati da fondo elevato, nel qual caso il lavaggio più stringente, pre- multiplacompensazione passi, o l'uso di perline di una composizione diversa (come ad esempio sfere magnetiche invece di agarosio) può essere utile. Tuttavia, se la proteina bersaglio è troppo basso in abbondanza può non essere possibile rilevare dalla macchia d'argento. Inoltre, se la proteina bersaglio non migra come band tagliente su SDS-PAGE (come proteine ​​fortemente glicosilata) sarà anche più difficile da visualizzare. Ulteriori modifiche al protocollo potrebbe essere fatto per superare questi problemi, come ad esempio l'esecuzione di proteomica tutto il campione o SILAC (Stable Isotope Labeling da amminoacidi in coltura cellulare) per identificare le proteine ​​marcate dopo pull-down, eliminando la necessità di tagliare una band fuori di un gel d'argento macchiate.

Un'altra considerazione importante è la concentrazione della sonda da utilizzare nell'esperimento. Idealmente, dovrebbe essere utilizzata la quantità minima di sonda che produce un segnale rilevabile. Concentrazioni più elevate daranno segnale più alto, ma anche una maggiore etichettatura di fondo, e una volta che tutti of i siti di legame sul più alto obiettivo affinità diventare saturi ci possono essere ulteriori obiettivi più bassa affinità che iniziano a essere rilevato. La concentrazione ottimale dovrebbe pertanto essere determinata empiricamente partendo da una concentrazione relativamente elevata (1-2 mM) e titolando indietro finché solo uno o due proteine ​​sono etichettati e la concorrenza è evidente.

La potenza della sonda può essere presa in considerazione nella scelta della concentrazione iniziale; Tuttavia, a seconda della abbondanza e modalità di inibizione di destinazione, non ci può essere una buona correlazione tra l'attività sonda e rivelazione del bersaglio (per esempio, una sonda con inibizione partire nanomolari non sarà necessariamente abbattere abbastanza proteine ​​a concentrazioni basse nanomolari essere rilevabile ). Pertanto, è preferibile determinare la concentrazione più appropriato empiricamente usando rilevazione di proteine ​​marcate come lettura. La concentrazione di competitore usato deve superare quella della sonda di ATalmeno 20 volte, ma la cura dovrebbe anche essere presa per non superare il limite di solubilità del concorrente.

Nel caso in cui più proteine ​​vengono abbattute dalla sonda, l'identificazione della proteina funzionalmente rilevante diventa più complicata. Tuttavia, ci sono diversi modi per aiutare a restringere i potenziali proteine ​​bersaglio. Come accennato in precedenza, titolando indietro la concentrazione sonda può contribuire a migliorare la specificità di etichettatura. Come la concentrazione di sonda scende, maggiore affinità proteine ​​leganti dovrebbero mantenere il loro intensità del segnale, mentre le proteine ​​minore affinità dovrebbero scomparire. Deconvoluzione di più potenziali bersagli può essere aiutata con l'uso di analoghi chimiche del composto genitore con vari gradi di attività. In teoria, per un target funzionalmente rilevante, dovrebbe esserci una correlazione tra il legame al bersaglio e attività della analogico. Ad esempio, la concorrenza analoghi inattivi del composto genitore può essere utilizzato per escludere vincolante proteins che non sono coinvolti negli effetti fenotipici del composto. Allo stesso modo, analoghi attivi o altre piccole molecole che inducono lo stesso fenotipo come il composto progenitore, possono essere utilizzati per aiutare regola in materia proteine ​​leganti. Sulla stessa linea, l'uso di una sonda photoaffinity inattivo o strutturalmente non correlato può aiutare a escludere le proteine ​​irrilevanti.

Validazione della proteina bersaglio richiede prima verifica della proteina identificata da MS. Questo può essere facilmente realizzato mediante western blot seguendo la biotina pull-down, assumendo un anticorpo alta qualità per la proteina bersaglio è disponibile. Tuttavia, quando si lavora con una proteina non familiare, è facile perdere tempo e denaro in cattive anticorpi. È quindi importante che l'anticorpo essere convalidato, e che rileva una banda specifica nel lisato delle cellule utilizzata per l'etichettatura (cioè, il campione di ingresso). Inoltre, poiché il rendimento proteica dopo discesa può essere basso, la formicaiBody deve essere altamente sensibile e seconda l'anticorpo può essere necessario concentrazioni elevate (fino a diluizione 1: 100 in alcuni casi). Per evitare questi problemi, una versione etichettato della proteina può essere espressa nelle cellule prima photolabeling, e il tag può quindi essere utilizzato per rilevare la proteina dopo pull-down.

Una volta che l'ID proteina è confermata, validazione funzionale del bersaglio può essere eseguito manipolazioni genetiche e / o farmacologiche, o saggi funzionali del bersaglio di interesse, per dimostrare che l'attività del bersaglio è influenzata dal legame piccola molecola. Il sito di legame può essere mappato identificando l'amminoacido modificato dalla sonda, o determinare la struttura 3-dimensionale della piccola molecola vincolato mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR. Idealmente, se un mutante può constatare che perde la sua capacità di legare la piccola molecola, dovrebbe essere in grado di abolire l'attività della piccola molecola quando espresso in posto del wild-type proTEIN. Può anche essere desiderabile mostrare specificità del legame al bersaglio su altri "off-target" proteine ​​strutturalmente correlate o.

Questo protocollo generale può essere utilizzato in qualsiasi applicazione che richiede la misurazione diretta della piccola molecola vincolante per una proteina bersaglio, fino a quando una sonda può essere fatto che mantiene la bioattività del composto progenitore. Le potenziali applicazioni comprendono, ma non sono limitati a, identificare bersagli molecolari di nuovi composti, geodetici potenziale a bersagli di farmaci esistenti, confermando il legame diretto di una piccola molecola ad una particolare proteina di interesse, determinando la concorrenza di legare con altre piccole molecole in lo stesso sito di legame su una proteina, e scoprire nuovi recettori di ligandi di derivazione naturale o endogeni.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp	Spectroline	FC100	UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free	Roche Life Science	11873580001	Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Set to output 1, duty 30%.
Fluorescent gel scanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualified	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin solution	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676