Introduction
الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا تعمل بشكل أساسي من خلال التفاعل مع وتغيير وظيفة من جزيئات واحدة أو أكثر "الهدف"، والأكثر شيوعا البروتينات في الخلية. في اكتشاف المخدرات، عندما تم اكتشاف مركب نشط من خلال الفحص المظهري، وتحديد الهدف الجزيئي (ق) من هذا المركب أمر بالغ الأهمية، ليس فقط لفهم آلية عمل والآثار الجانبية المحتملة للمركب، ولكن أيضا بسبب احتمال اكتشاف الاحياء الجديدة التي يقوم عليها نموذج المرض ويمهد الطريق لتطوير الطبقات الآلية الجديدة من العلاجات 1. على الرغم من أن ليس مطلوبا تحديد الهدف لعقار لاستخدامها علاجيا، كان هناك اعتراف متزايد في السنوات الأخيرة أن المرشحين المخدرات الرواية هي أكثر احتمالا للنجاح في التجارب السريرية، وبالتالي يحقق عائدا أفضل على الاستثمار، وإذا كان الهدف التحقق من صحة معروف 2. وهكذا، فقد كان هناك اهتمام متزايد في طرق لتحديد صغيرةجزيء البروتين الهدف.
هدف التجربة تحديد الكلاسيكية يعتمد عادة على تنقية تقارب، حيث ثبتوا جزيء صغير من الفائدة على الراتنج وحضنت مع لست] خلية كاملة، وبعد ذلك يتم غسلها البروتينات غير منضم بعيدا ومزال البروتينات المتبقية وتحديد 3. في حين تم استخدام هذه التقنية لتحديد الأهداف من العديد من الجزيئات الصغيرة 4، فإنه غير مناسب كوسيلة معرف الهدف الشامل لعدة أسباب. أولا، يجب أن البروتين المستهدف تحتفظ التشكل الأصلي الخاص به على تحلل الخلية من أجل الحفاظ على قدرتها على ربط جزيء صغير. هذا يمكن أن يكون مشكلة خاصة بالنسبة للبروتينات الغشاء، والتي غالبا ما تخضع لتغيرات متعلق بتكوين بعد إزالة من بيئتهم المحلية، أو ببساطة مجموع المباراتين وتترسب من الحل. ثانيا، جزيء صغير يجب أن يتم تعديل كيميائيا في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن يجمد على الراتنج مع الحفاظ علىقدرته على ربط البروتين المستهدف. وبالتالي قد تصبح جيوب ملزمة عميقة غير قابلة للوصول إلى جزيء صغير مرة واحدة فهي ثابتة إلى الراتنج. ثالثا، يجب أن يكون تقارب ملزمة عالية بما فيه الكفاية أن يتم الحفاظ على التفاعل خلال خطوات الغسيل، مما يجعل تحديد أقل التفاعلات تقارب الصعبة. والظروف البيئية الرابعة مثل درجة الحموضة، تركيز أيون، أو وجود جزيئات الذاتية الأخرى يمكن أن تختلف مكانيا داخل الخلية وفي بعض الأحيان المتطلبات الأساسية لالتفاعلات الهدف المخدرات. وهكذا، وإيجاد الظروف الصحيحة للسماح والحفاظ خارج الخلية ملزمة يمكن أن تتطلب قدرا كبيرا من التجربة والخطأ.
Photoaffinity وضع العلامات تلتف هذه القضايا من خلال السماح للالتساهمية ملزم من جزيء صغير وهدفه في سياق الأصلي للخلية. بدلا من شل حركة جزيء صغير لراتنج ضخمة كبيرة، وبدلا من ذلك تعديل جزيء كيميائيا لتثبيت اثنين ز صغير عمليroups: شاردة photoactivatable الذي يسمح التساهمية يشابك للبروتين الهدف عندما المشع مع طول موجة معينة من الضوء، ومجموعة المراسل أن يسمح للبروتين الهدف ليتم الكشف عن وعزل في وقت لاحق. يتم التعامل مع الخلايا الحية مع لجنة التحقيق photoaffinity، وتحقيق الربط وتساهمي crosslinks للبروتين الهدف، ومجمع التحقيق البروتين ومن ثم معزولة سليمة. وتتجلى خصوصية التحقيق ملزم إلى الهدف عن طريق إجراء تجربة المنافسة في موازاة ذلك، حيث يتم استخدام الزيادة في المركب الأصلي للتنافس بعيدا ملزمة لجنة التحقيق للبروتين الهدف.
تصميم وتركيب المجسات photoaffinity يختلف كثيرا عن جزيء صغير واحد إلى آخر، وسوف لا تكون مشمولة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، فقد تم نشر عدة مناقشات ممتازة على هذا الموضوع 5-9. والاعتبار الرئيسي هو أن لجنة التحقيق يحتفظ النشاط الحيوي للمركب الأصلي، وبالتالي presumabلاي ملزمة لنفس الهدف (ق). يجب أن يؤديها العلاقة بين الهيكل والنشاط (SAR) دراسات لتحديد أي أجزاء من جزيء يمكن تعديلها دون فقدان النشاط الحيوي. وقد استخدمت مجموعة متنوعة من مجموعات كيميائية مختلفة كما crosslinkers photoactivatable، بما في ذلك diazirine، بينزفينون، وأزيد أريل، ولكل منهما مزاياه وعيوبه 10. وبالمثل، هناك علامات مراسل المتعددة التي استخدمت لعزل البروتينات ملزم التحقيق. قد تكون الجماعات مراسل وظيفية من تلقاء نفسها، مثل البيوتين التي يشيع استخدامها أو العلامات الفلورية، أو قد تكون السلائف التي تتطلب مزيدا من functionalization لاحق إلى الخطوة photocrosslinking، التي لديها ميزة كونها أصغر حجما وبالتالي أقل احتمالا لتقديم تنازلات النشاط الحيوي 11.
في هذا البروتوكول، ونحن قد استخدمت التحقيق photoaffinity تحتوي على مجموعة diazirine photocrosslinking، وآلكاين محطة للمرفق مجموعة مراسل من خلال النحاس (I) -catalyzإد أزيد-آلكاين شاربلس-Hüisgen cycloaddition (أو انقر) رد فعل 12-15. الدراسات ريال، تسبر تصميم وتركيب، وقد تم نشر نتائج هذه الدراسات في أماكن أخرى 16-18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من ماكينون وتونتون 10 للاستخدام في الخلايا الحية.
1. إعداد الخلايا المستزرعة
- إعداد 6 سم أطباق زراعة الخلايا معقمة لعدد العينات المطلوبة (أنظر أدناه).
ملاحظة: يتم استخدام طبق واحد من الخلايا في حالة العلاج، ولكن إذا كان مطلوبا المزيد من البروتين 2 أو 3 أطباق يمكن إعداد في حالة والجمع بعد اشعة فوق البنفسجية.- إعداد لا يقل عن 3 أطباق من الخلايا. السيطرة السلبية مع DMSO فقط (D)، والعلاج التحقيق فقط (P)، ومسبار + منافس (C).
- اختياريا، وإعداد طبق ال 4 كما لا سيطرة للأشعة فوق البنفسجية، إلى أن تعامل مع التحقيقات ولكنه لم يتعرض للأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: إذا متعددة الجزيئات منافس هي لفحصها، مثل النظير مختلفة من جزيء صغير من الفائدة، وإعداد لوحات منافس إضافية عند الضرورة.
- إضافة خلايا HEK293T إلى أطباق الثقافة في 4 وسائل الإعلام ثقافة مل. استخدام 3.5 مليون جملتعلمي اللغة اإلنكليزية لكل لوحة.
ملاحظة: يجب أن يتم تحديد عدد الخلايا لكل نوع من الخلايا بحيث الخلايا هي ما يقرب من 100٪ متكدسة في بداية التجربة، من أجل تحقيق أقصى قدر من العائد من البروتين. لHUVEC، استخدم 0.3 مليون خلية لكل لوحة. والتقريب الجيد هو 1/10 من الخلايا في سم طبق متموجة 15. يجب مثقف خلايا HEK293T في Dulbecco لتعديل النسور تستكمل المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين. - عودة إلى الخلايا الحاضنة الثقافة (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2) بين عشية وضحاها.
2. علاج الخلايا وPhotocrosslinking
- في اليوم التالي، قبل قسامة الأدوية التالية إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge:
- في المعالجة الأولى، إضافة 4 ميكرولتر من DMSO إلى 2 الأنابيب و 4 ميكرولتر من 10 ملي منافس (أي المركب الأصلي الغير معدلة) إلى 1 أنبوب.
- لعلاج الثانية، إضافة 16 ميكرولتر من DMSO إلى 1 أنبوب و 16 ميكرولتر من 50 &# 181؛ M photoaffinity التحقيق إلى 2 الأنابيب.
ملاحظة: تركيز الأمثل قد تكون مختلفة عن تحقيقات مختلفة (انظر المناقشة)، ولكن بين 200-500 نانومتر هو نقطة انطلاق جيدة (هنا نستخدم 200 نانومتر). يجب أن يتجاوز تركيز منافس أن لجنة التحقيق لا يقل عن 20 أضعاف (وهنا نستخدم 10 ميكرومتر). يجب أن يكون تركيز النهائي من DMSO على قدم المساواة في جميع لوحات ويجب أن لا تتجاوز 0.5٪ (20 حجم ميكرولتر).
- تقديم لوحات الخلية إلى الخلية هود الثقافة وإضافة المخدرات aliquoted قبل من الخطوة 2.1.1 على النحو التالي: نضح 1 مل من وسائل الإعلام والثقافة، وإعادة التعليق على المخدرات قبل aliquoted في وسائل الإعلام، وإضافة بلطف مرة أخرى إلى الانخفاض لوحة الحكمة. إضافة DMSO إلى (D) لوحة DMSO و(P) لوحة التحقيق، وإضافة منافس إلى (C) لوحة المنافسة. العودة لوحات لحاضنة الثقافة لمدة 30 دقيقة.
- مع أضواء في غطاء الثقافة خافتة، إضافة التحقيق قبل aliquoted من الخطوة 2.1.2 للتحقيق (P) والمنافسة لوحات (C) وإضافةDMSO إلى لوحة DMSO (D)، على النحو الوارد أعلاه. العودة لوحات لحاضنة الثقافة لمدة 1 ساعة.
- أثناء الحضانة، واعداد العناصر التالية: صينية من الجليد التي يمكن أن تناسب جميع لوحات. تحلل العازلة الجليد الباردة (PBS [الرقم الهيدروجيني 8.5] + 1X مثبط البروتياز كوكتيل [كاملة خالية من EDTA، مخففة من حل 50X الأسهم المحرز في الماء]، 200 ميكرولتر / لوحة)؛ أنابيب microcentrifuge وصفت D، P، أو C لكل الشروط معاملة مختلفة، على الجليد.
- 15 دقيقة قبل نهاية الحضانة 1 ساعة، أقامت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) في غرفة باردة وتحويله إلى الاحماء لمبة.
- بعد 1 ساعة حضانة مع لجنة التحقيق، ووضع الأطباق على الجليد. غسل الخلايا برفق مع 5 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) لإزالة التحقيق الزائد. إعادة تغطية الخلايا مع 4 PBS مل الجليد الباردة.
- وضع طبق من الخلايا تركز 3 سم تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية على أعلى وضع كيس من الثلج للحد من التدفئة من المصباح. أشرق لمدة 3 دقائق. إزالة الطبق إلى علبة الجليد وأكرر لجميع العينات.
- اfter التشعيع، نضح في برنامج تلفزيوني من الخلايا وإضافة 200 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 8.5) مع مثبطات الأنزيم البروتيني إلى كل لوحة. فصل الخلايا من لوحة باستخدام مكشطة المطاط ونقل إلى أنابيب microcentrifuge وصفت مسبقا على الجليد.
- إضافة SDS إلى تركيز النهائي من 0.4٪ (10 ميكرولتر من 10٪ SDS إلى 250 ميكرولتر من العينة).
تنبيه: مسحوق SDS خطرة. تجنب استنشاق مسحوق SDS من خلال ارتداء قناع على الأنف والفم. - ليز الخلايا عن طريق sonicating تعليق لمدة 10 البقول (الناتج 1، دورة العمل 30٪)، واحتضان على الجليد لمدة 1 دقيقة قبل جولة ثانية من 10 البقول.
- إذا لزم الأمر، وإزالة 2 ميكرولتر من تعليق وتحقق تحت المجهر الضوئي لضمان تحلل الخلية كاملة.
- تغلي العينات على طبق ساخن لتعيين 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لاستكمال تحلل الخلايا وتفسد كل البروتينات.
- قياس تركيز البروتين في كل عينة باستخدام المنظفات متوافق الطيفي البروتين الفحص، مثل الالبريد العاصمة البروتين مقايسة 19، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع معمل المقرر أن قياس الامتصاصية في 750 نانومتر.
- تطبيع تركيز البروتين إلى 2.5 ملغ / مل (أو إذا التركيزات أقل من 2.5 ملغ / مل، وتطبيع للعينة مع أقل تركيز البروتين) وذلك بإضافة برنامج تلفزيوني درجة الحموضة 8.5 + 0.4٪ SDS حسب الحاجة (على سبيل المثال، إذا العينات 5 ملغم / لتر في 250 ميكرولتر، إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني درجة الحموضة 8.5 + 0.4٪ SDS للحصول على التركيز النهائي من 2.5 ملغ / مل).
3. مرفق من العلامات الفلورية التي كتبها انقر الكيمياء لتصور البروتينات إعتبر
- إزالة 40 ميكرولتر من المحللة الخلية ونقل إلى أنبوب microcentrifuge جديد. إبقاء لست] المتبقية لرد فعل مع البيوتين أزيد (الخطوة 4).
- إضافة الكواشف التالية بالترتيب: 0.2 ميكرولتر فلور-أزيد (1 ملي حل الأسهم في DMSO)، 0.58 ميكرولتر TCEP (100 ملي الأسهم في الماء مع 4 حكمه وأضاف هيدروكسيد الصوديوم، الذي أعد الطازجة)، و3.38 ميكرولتر TBTA (1.7 الاسهم ملي في نسبة 4: 1 ر بيوتانول إلى DMSO). دوامة لخلط.
- إضافة 1.14 ميكرولتر كبريتات النحاس 4 -5H 2 O (50 ملم في الماء) لبدء التفاعل. دوامة احتضان لفترة وجيزة وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- إضافة 50 ميكرولتر من عينة العازلة 2X SDS لإرواء رد الفعل. عند هذه النقطة، تشغيل عينات مباشرة على هلام SDS-PAGE 20 حصول على أفضل النتائج، أو تخزينها في -20 درجة مئوية خلال الليل إذا لزم الأمر.
- إذا تجميد العينات، يسخن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية قبل تحميلها على هلام.
ملاحظة: بما أن عادة لا يعرف الوزن الجزيئي للبروتين الهدف في هذه المرحلة، فإنه من المستحسن لتشغيل 2 المواد الهلامية مع تركيزات مادة الأكريلاميد مختلفة (أي 8٪ و 15٪)، أو هلام التدرج الجزيئي وزن مدى واسع (أي، 4-15٪)، لضمان تغطية كاملة الوزن الجزيئي. - عندما الجبهة صبغ وصلت الى نهاية هلام، متابعة تشغيل هلام لمدة 5 دقائق إضافية لضمان كل من unreacte الزائدةد فلوري-أزيد قد خرجت تماما هلام.
- إزالة هلام إلى وعاء مع ده 2 O، واحتضان لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف، ليغسل كل الزائد فلور-أزيد.
- وضع الجل على طبق من ذهب الزجاج ومسح الجل باستخدام الماسح الضوئي هلام الفلورسنت الاعصار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
4. إرفاق البيوتين العلامات من قبل انقر الكيمياء للتقارب تنقية البروتينات إعتبر
- من لست] المتبقية من الخطوة 3.1، استخدام الحد الأقصى للمبلغ بعد تطبيع البروتين مثل أن جميع العينات هي نفس الحجم (على سبيل المثال، إذا كان بعد تطبيع إلى 2.5 ملغ / مل أحجام العينة الناتجة هي 500، 550، و 600 ميكرولتر، استخدم 500 ميكرولتر من كل منهما).
- قبل مسح لست] بإضافة 50 ميكرولتر ذات قدرة عالية الخرز streptavidin الاغاروز، 2X قبل غسلها مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). احتضان 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع دوران.
- بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة رانه طاف لأنبوب microcentrifuge جديد على الجليد والتخلص من الخرز.
- إزالة 1-2٪ من العينة DMSO إلى أنبوب جديد المسمى "المدخلات". إضافة ما يعادل حجم عينة العازلة 2X SDS ومخزن في -20 درجة مئوية.
- لكل 500 ميكرولتر من المحللة، إضافة الكواشف التالية: 1.38 ميكرولتر البيوتين أزيد (10 ملي الأسهم في DMSO)، 5.5 ميكرولتر TCEP، و 32.5 TBTA ميكرولتر. دوامة لخلط.
- إضافة 11 ميكرولتر كبريتات النحاس 4 -5H 2 O لكل 500 ميكرولتر من المحللة ودوامة لفترة وجيزة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 4 مجلدات عينة من الأسيتون المبردة إلى -20 درجة مئوية. دوامة العينات واحتضان بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية لترسيب تماما البروتينات وإزالة غير المتفاعل البيوتين أزيد.
- الطرد المركزي العينات في 17000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير البروتينات عجل.
- نضح طاف تماما، وresolubilize البروتينات صوتنة في 150 ميكرولتر PBS (درجة الحموضة 7.4) + 1٪ SDS.
- إضافة العينات إلى 30 ميكرولتر قبل غسلها ذات قدرة عالية streptavidin الخرز الاغاروز واحتضان 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع دوران.
- بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 دقائق. نضح طاف تحتوي على بروتينات غير منضم وتجاهل.
- إضافة 1 مل من غسل العازلة (400 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، 0.2٪ SDS، ودرجة الحموضة 7.4) إلى الخرز واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع دوران.
- كرر الخطوات من 4.12 و 4.13 3 مرات.
- نضح غسل العازلة تماما من الخرز، وإضافة 30 ميكرولتر من عينة العازلة 2X SDS.
- احتضان لمدة 5 دقائق على كتلة C الحرارة 95 درجة للافراج عن البروتينات من الخرز.
- أجهزة الطرد المركزي حبات لمدة 1 دقيقة في 13000 x ج في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للتشغيل SDS-PAGE. إذا تجميد العينات، يسخن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية قبل الاستخدام. - بعنايةماصة عينة العازلة التي تحتوي على البروتينات الخروج من الخرز، وتحميل على SDS-PAGE 20 (انظر الاعتبارات الهامة أدناه). يمكن حفظ حبات لreboiling في وقت لاحق إذا لزم الأمر.
ملاحظة: للكشف عن البروتين بواسطة وصمة عار الفضة، ويتم الحصول على نتائج أفضل باستخدام هلام سميكة 1 مم. إذا كان الفرقة هو أن يكون قطعت من هلام الملطخة الفضة لتحليل الكتلة الطيفي (MS)، وإعداد جميع الكواشف جديدة من حلول عقيمة وترك بئر فارغة في بين العينات على هلام. لكل فرقة من قطع الممر التحقيق، ينبغي أن تؤخذ شريحة موازية من حارة DMSO بحيث يمكن طرح أن البروتينات الخلفية. للتأكد من صحة هوية البروتين لطخة غربية، فمن الأهمية بمكان لتحميل أيضا إدخال عينة من الخطوة 4.4 عند تشغيل هلام SDS-PAGE. - اتباع بروتوكول قياسي لأي الفضة تلطيخ 21 أو الغربية لطخة 22 للكشف عن البروتين الهدف (ق).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الحصول على النتائج الموضحة هنا مع التحقيق الذي تجريه الصور تقارب من يتراكونازول المخدرات مضاد للفطريات، واستخدام والتي تم نشرها سابقا 16. هذه النتائج تثبت استخدام الخلية الحية photoaffinity وضع العلامات تقنية لتحديد بنجاح بروتين رئيسي ملزم يتراكونازول مثل 35 كيلو دالتون بروتين الغشاء الجهد التي تعتمد على قناة أنيون 1 (VDAC1).
تم تنفيذ البروتوكول المذكور أعلاه في الخلايا HEK293T باستخدام مسبار يتراكونازول لphotolabeling ويتراكونازول معدلة كما جزيء منافس. بعد أن تم إعداد العينات كما هو موضح، أنهم تعرضوا للSDS-PAGE من أجل فصل البروتينات عن طريق الوزن الجزيئي. الجزيئية وحدات الوزن علامة على اليسار هي في kilodaltons (كيلو دالتون). المسار الأول هو عينة السيطرة DMSO (D)، والمسار الثاني هو عينة التحقيق (P)، والخط الثالث هو عينة المنافسة (C). العصابات صتستاء في الممر الوحيد DMSO تعتبر الخلفية. في تحليل هذه البيانات، لاحظ أن محددة البروتينات ملزمة يجب أن يكون غائبا في العينة الضابطة DMSO والحاضر في العينة التحقيق وانخفاض في العينة المنافسة. في هذه الحالة، اكتشفت الفرقة البروتين الرئيسية فقط في كانت عينة التحقيق عصابة من ما يقرب من 35 كيلو دالتون (الشكلان 1 و 3)، والتي تم تحديد الطيف الكتلي كما VDAC1. تم تأكيد هوية هذا البروتين في الشكل (5) من لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة VDAC1 محددة. مجتمعة، تسمح هذه النتائج بنا إلى استنتاج أن VDAC1 هو بروتين ملزمة كبير من يتراكونازول في هذه الخلايا.
الشكل 1 يوضح التصور من البروتينات بعد وضع العلامات مع علامة فلوري (من الخطوة 3 في البروتوكول)؛ الرقم 3 يدل على التصور من البروتينات بواسطة وصمة عار الفضية بعد وضع العلامات مع العلامة البيوتين والمؤسسة العامة rforming تنقية تقارب (من الخطوة 4 في البروتوكول)؛ والشكل (5) يدل على التحقق من هوية البروتين باستخدام الأجسام المضادة المحددة لVDAC1. أرقام 2 و 4 تجسد ما يحدث إذا لم يتم تنفيذ بعض الخطوات في البروتوكول بشكل صحيح (لوحظ في الأساطير الشكل).
الشكل 1. A-الممسوحة ضوئيا مضان هلام SDS-PAGE تمثيلي (من الخطوة 3 في البروتوكول) D = DMSO فقط؛ P = التحقيق فقط (200 نيوتن متر). C = المنافسة (10 ميكرومتر). الجزيئية وحدات الوزن علامة على اليسار هي في kilodaltons (كيلو دالتون). يشير السهم إلى الرئيسية الفرقة البروتين photolabeled في ما يقرب من 35 كيلو دالتون التي موجود تحديدا في حارة التحقيق وتنافس بعيدا عن المركب الأصلي الزائد، مشيرا إلى أنه هو بروتين ملزمة محددة.529 / 54529fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. هلام الممسوحة ضوئيا مضان. لم تمت إزالة الزائد فلور-أزيد تماما من هلام (الخطوات 3.6 و 3.7)، مما تسبب في مسحات كبيرة سوداء تظهر في الجزء السفلي من هلام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. جل SDS-PAGE الملطخة الفضة التمثيلي بعد البيوتين المنسدلة (من الخطوة 4 في البروتوكول). ويشير السهم لنفس الفرقة التي كانت تصور في الشكل رقم 1، الذي تم رفعه في وقت لاحقمن الجل وتعرض لتحليل MS لتحديد البروتين. وحدات علامة على اليسار هي في kilodaltons (كيلو دالتون). لاحظ المساحة الفارغة في الفترات الفاصلة بين كل حارة، من أجل تجنب انتقال التلوث من العينات أثناء التحميل هلام والفرقة الختان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الفضة تلطيخ. جل الملطخة الفضة مع تلوين الخلفية عالية جدا، نظرا لعدم كفاية ما قبل المقاصة من لست] (الخطوة 4.2) و / أو غسل حبات (الخطوة 4.13). نلاحظ أيضا عدم وجود مساحة بين الممرات. وحدات علامة على اليسار هي في kilodaltons (كيلو دالتون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. وصمة عار الغربية من photolabeled بروتين 35 كيلو دالتون، التي حددها MS كما VDAC1 بعد البيوتين المنسدلة (من الخطوة 4 في البروتوكول). إشارة موجودة في حارة التحقيق وانخفضت في حارة المنافسة، كما في الشكلين 1 و3، مما يؤكد هوية البروتين كما VDAC1. من المهم أن يتم تشغيل جزء الإدخال (من الخطوة 4.4) جنبا إلى جنب مع عينات المنسدلة، للتأكد من أن أعمال الأجسام المضادة والبروتين من الفائدة يمكن أن يتم الكشف في المحللة. يمكن ملاحظة زيادة طفيفة في الوزن الجزيئي في العينات المنسدلة نظرا لحجم وأضاف لجنة التحقيق تعلق تساهمي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أساليب مختلفة لتحديد الأهداف من جزيئات صغيرة يمكن تصنيفها إلى فئتين: من أعلى إلى أسفل، حيث يتم استخدام النمط الظاهري الخلوية من المخدرات لتضييق أهدافها المحتملة بناء على وظائفها المعروفة، أو من أسفل إلى أعلى، حيث الهدف يتم التعرف مباشرة بوسائل كيميائية أو وراثية 3. من أعلى إلى أسفل أو دراسات المظهرية يمكن تحديد بعض العمليات الخلوية تتأثر المخدرات (على سبيل المثال، النسخ / الترجمة / توليف الحمض النووي، وكتلة دورة الخلية، مما يشير إلى تنشيط مسار / تثبيط، الخ) التي قد تكمن وراء النمط الظاهري النهائي للجزيء صغير، والذي يساعد تضييق قائمة الأهداف المحتملة للبروتينات المشاركة في تلك العمليات. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي للنهج من أعلى إلى أسفل هو أنه يعتمد على ما هو معروف بالفعل عن هذه العمليات، وبالتالي منحازة ضد أهداف التي لم تتميز وظائف أو لم يتم وصفها من قبل أن تشاركفي عملية معينة.
نهج من أسفل إلى أعلى تلتف هذه المشكلة عن طريق تحديد الهدف مباشرة بطريقة غير متحيزة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق الجينية؛ على سبيل المثال، عن طريق فحص مكتبة shRNA للخطوط الخلايا ضربة قاضية التي تمنح مقاومة أو فرط الحساسية للدواء، أو من خلال عزل خطوط الخلايا المقاومة للأدوية واستخدام التسلسل الجيني لتحديد الجينات التي تحتوي على الطفرات 1. هذه الأنواع من التجارب يمكن تحديد البروتينات الرئيسية أو مسارات تتعلق النشاط من المخدرات، ولكن لا يثبت بالضرورة ملزمة للبروتين التي تم تحديدها مباشرة. النهج الكيميائية، من ناحية أخرى، وعادة ما تشمل استخدام مجس كيميائي لربط البروتين الهدف مباشرة والسماح عزلتها وتحديد الهوية. تصميم التحقيق أن يحتفظ بقدرته على ربط البروتين الهدف يتطلب استخدام دراسات ريال لتحديد موقف من جزيء التي يمكن تعديلها دون خسائر كبيرة في النشاط. ذلك المرضس يتطلب أن التحقيق يكون قادرا على ربط هدفها إما تساهمي أو مع قابلية عالية بما فيه الكفاية أنه يمكن عزله عن البروتينات الخلوية الأخرى (أي تقارب تنقيته)، وأن هذه البروتينات تحتفظ قدرتها على ربط جزيء صغير خارج من مواليد بهم البيئة الخلوية. هذا الشرط يمكن أن يكون مشكلة بالنسبة لأهداف معينة. على سبيل المثال، بروتينات الغشاء لا يتجزأ غالبا ما تتطلب بيئة الدهون محددة للحفاظ على التشكل بصورة نشطة، ويمكن أن تصبح مجمعة أو بشكل غير صحيح الموجهة ليجند ملزمة بمجرد هي lysed الخلايا. الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة يتجنب هذه المزالق المحتملة لتنقية تقارب من خلال السماح للتعديل التساهمية من البروتين الهدف في البيئة الخلوية المحلية، بحيث التلاعب اللاحقة لا يمكن أن يقطع التفاعل المستهدفة المخدرات 10.
يعتمد النجاح في تنفيذ بروتوكول صفها على عدة عوامل. من المهم أن تاالبروتين r يمكنك الحصول على جزيء صغير وفيرة بما فيه الكفاية في نوع من الخلايا المختارة لphotolabeling. نوع من الخلايا الأكثر تأثرا بشكل فعال من خلال جزيء صغير يمكن أن يكون نقطة بداية جيدة، ولكن قد يكون من الضروري اختبار عدة أنواع مختلفة من الخلايا إلى العثور على واحد مع عوائد البروتين المستهدف عالية. بدلا من ذلك، والإثراء من السكان بروتين مختلف عن طريق تجزئة التحت خلوية قد يزيد من العائد المستهدف، بينما تتناقص وضع العلامات الخلفية. كشف علامة على من fluorescently البروتينات في عام بكثير أكثر حساسية من الكشف عن البروتين بواسطة وصمة عار الفضة. وبالتالي، والعصابات الكشف عنها من قبل مضان قد لا تكون اكتشافها من قبل تلطيخ الفضة بعد البيوتين المنسدلة. ويمكن التوسع في التجربة باستخدام أطباق متعددة من الخلايا في حالة العلاج يساعد على التغلب على هذه المشكلة الكشف. يمكن زيادة تركيز التحقيق أيضا تساعد على تحسين المحاصيل المنسدلة. ويمكن أيضا أن تحجب العصابات محددة خلفية عالية، في هذه الحالة غسل أكثر صرامة، ما قبل متعددةتطهير الخطوات، أو استخدام حبات من تكوين مختلف (مثل حبات مغناطيسية بدلا من الاغاروز) قد يكون مفيدا. ومع ذلك، إذا كان البروتين المستهدف منخفض جدا في وفرة أنه قد لا يكون من الممكن للكشف بواسطة وصمة عار الفضة. بالإضافة إلى ذلك، إذا لم البروتين المستهدف الهجرة والفرقة حادة على SDS-PAGE (مثل البروتينات الغليكوزيلاتي بشكل كبير) سيكون أيضا من الصعب تصور. يمكن إجراء مزيد من التعديلات على بروتوكول للتغلب على هذه المشاكل، مثل أداء البروتينات كلها عينة أو SILAC (مستقر النظائر وصفها من قبل الأحماض الأمينية في خلية ثقافة) لتحديد البروتينات المسمى بعد المنسدلة، مما يلغي الحاجة لقطع الفرقة خارج من هلام الملطخة الفضة.
اعتبار آخر مهم هو تركيز لجنة التحقيق لاستخدامها في التجربة. من الناحية المثالية، يجب استخدام أقل كمية من التحقيق التي تنتج إشارة يمكن كشفها. سوف تركيزات أعلى تعطي أعلى إشارة لكن أيضا أعلى العلامات الخلفية، ومرة واحدة كل سو مواقع الربط على أعلى الهدف تقارب تصبح مشبعة قد يكون هناك أهداف أخرى أقل النسب التي تبدأ في الكشف عنها. ولذلك ينبغي تحديد تركيز الأمثل تجريبيا من خلال البدء مع تركيز عال نسبيا (1-2 ميكرومتر) والمعايرة مرة أخرى حتى وصفت واحد فقط أو اثنين من البروتينات والمنافسة واضحة.
يمكن أن تؤخذ على سلطة التحقيق بعين الاعتبار في اختيار تركيز انطلاق؛ ومع ذلك، اعتمادا على وفرة الهدف وطريقة كبت، قد لا تكون هناك علاقة جيدة بين النشاط التحقيق والكشف عن الهدف (على سبيل المثال، التحقيق مع انخفاض تثبيط nanomolar لن تنسحب بالضرورة أسفل ما يكفي من البروتين في تركيزات nanomolar منخفضة لتكون كشفها ). وبالتالي، فمن الأفضل لتحديد تركيز الأنسب تجريبيا باستخدام الكشف عن البروتينات وصفت بأنها قراءات. يجب أن يتجاوز تركيز منافس المستخدمة أن لجنة التحقيق التي كتبها فيوينبغي أيضا أن تؤخذ الأقل 20 أضعاف، ولكن الحرص على عدم تجاوز حد الذوبان للمنافس.
في حالة أن يتم سحبها بروتينات متعددة أسفل قبل لجنة التحقيق، وتحديد البروتين ذات الصلة وظيفيا يصبح أكثر تعقيدا. ومع ذلك، هناك عدة طرق للمساعدة في تضييق البروتينات المستهدفة المحتملة. وكما ذكر أعلاه، المعايرة إعادة تركيز التحقيق يمكن أن تساعد في تحسين خصوصية وضع العلامات. كما تركز التحقيق قطرات، يجب أن البروتينات ملزمة أعلى النسب تحتفظ كثافة إشارة، بينما أقل البروتينات تقارب يجب أن تختفي. Deconvolution من الأهداف المحتملة متعددة ويمكن أيضا بمساعدة من استخدام النظير الكيميائية للمركب الأصلي مع درجات متفاوتة من النشاط. من الناحية النظرية، من أجل هدف ذات الصلة وظيفيا، يجب أن تكون هناك علاقة بين ملزما للهدف ونشاط التناظرية. على سبيل المثال، والمنافسة من قبل النظير غير نشطة من المركب الأصلي يمكن أن تستخدم لاستبعاد ص ملزمةroteins التي لا تشترك في آثار المظهري للمجمع. وبالمثل، النظير النشطة، أو غيرها من الجزيئات الصغيرة التي تحفز على نفس النمط الظاهري كما المركب الأصلي، ويمكن استخدامها للمساعدة حكم في البروتينات ملزمة ذات الصلة. وعلى نفس المنوال، واستخدام مسبار photoaffinity غير نشط أو غير ذات صلة هيكليا يمكن أن تساعد في استبعاد البروتينات غير ذات صلة.
المصادقة على البروتين الهدف يتطلب التحقق من البروتين التي حددها MS أولا. ويمكن تحقيق ذلك بسهولة عن طريق طخة غربية بعد البيوتين المنسدلة، على افتراض الأجسام المضادة ذات جودة عالية للبروتين الهدف هو متاح. ومع ذلك، عند العمل مع بروتين غير مألوف فمن السهل أن نضيع الوقت والمال كبير على الأجسام المضادة سيئة. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن يتم التحقق من صحة الأجسام المضادة، والتي تم اكتشافها عصابة معينة في المحللة من الخلايا المستخدمة لوضع العلامات (أي إدخال عينة). وبالإضافة إلى ذلك، لأن العائد من البروتين بعد المنسدلة يمكن أن تكون منخفضة، والنملibody أن تكون حساسة للغاية، وهذا يتوقف على الضد تركيزات عالية قد تكون ضرورية (تصل إلى 1: 100 التخفيف في بعض الحالات). لتجنب هذه القضايا، ويمكن التعبير عن نسخة الموسومة البروتين في الخلايا قبل photolabeling، ويمكن بعد ذلك علامة أن تستخدم للكشف عن البروتين بعد المنسدلة.
مرة واحدة يتم تأكيد هوية البروتين، والتحقق من صحة وظيفية للهدف يمكن تحقيقه عن طريق التلاعب الجيني و / أو الدوائية، أو المقايسات الفنية للهدف من الاهتمام، لإظهار أن هذا النشاط للهدف يتأثر جزيء صغير ملزمة. يمكن تعيين موقع ملزم بتحديد الأحماض الأمينية تعديلها من قبل لجنة التحقيق، أو تحديد هيكل 3-الأبعاد للجزيء صغير ملزمة البلورات بالأشعة السينية أو الرنين المغناطيسي الطيفي. من الناحية المثالية، إذا متحولة يمكن جدت أن يفقد قدرته على ربط جزيء صغير، ينبغي أن يكون قادرا على إلغاء نشاط جزيء صغير عندما أعرب بدلا من النوع البري المواليةالبروتين. قد يكون من المستحسن أيضا لإظهار خصوصية الربط إلى الهدف على البروتينات الأخرى ذات الصلة هيكليا أو "بعيدا عن الهدف".
هذا البروتوكول عام يمكن استخدامها في أي تطبيق يتطلب القياس المباشر من جزيء ملزمة صغيرة إلى هدف البروتين، ما دام تحقيق ويمكن إجراء ذلك يحتفظ النشاط الحيوي للمركب الأصلي. وتشمل التطبيقات المحتملة، ولكن لا تقتصر على تحديد الأهداف الجزيئية للمركبات جديدة، والمسح إمكانات خارج أهداف الأدوية الموجودة، مؤكدا الربط المباشر من جزيء صغير لبروتين معين من الاهتمام، وتحديد المنافسة ملزمة من قبل الجزيئات الصغيرة الأخرى في الموقع نفسه ملزما على البروتين، واكتشاف مستقبلات جديدة بروابط المستمدة طبيعيا أو الذاتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C. |
| Copper Sulfate (CuSO4•5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20 °C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2x) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
- Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
- Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
- Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
- Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
- Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
- Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
- Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
- Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
- Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
- Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
- Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
