Introduction
Биоактивные малые молекулы, в основном работают путем взаимодействия с и изменения функции одной или более "целевых" молекул, чаще всего белков, в клетке. Во время обнаружения наркотиков, когда активное соединение обнаруживается через фенотипического скрининга, определение молекулярной мишени (ов) этого соединения имеет решающее значение не только для понимания механизма действия и возможных побочных эффектов соединения, но и для потенциально обнаружения новая биология , лежащая в основе модели болезни и прокладывает путь для разработки новых механистических классов терапевтических средств 1. Хотя идентификация цели не требуется для лекарственного средства для использования в терапевтических целях, в последние годы наблюдается все более широкое признание, что новые кандидаты наркотиков больше шансов на успех в клинических испытаниях, и, следовательно, дают более высокую прибыль от инвестиций, если подтверждено целевой известно 2. Таким образом, наблюдается растущий интерес к методам выявления небольшоймолекулы белков-мишеней.
Классическим идентификация эксперимента мишень обычно опирается на аффинной очистки, где малая молекула представляет интерес иммобилизуют на смоле и инкубировали с лизатов целых клеток, после чего несвязанных белков вымываются , а остальные белки элюируют и идентифицированы 3. Хотя этот метод был использован для определения целей многих малых молекул 4, она непригодна в качестве универсального метода целевой ID по нескольким причинам. Во-первых, белок-мишень должен сохранять свою нативную конформацию после лизиса клеток для того, чтобы сохранить свою способность связываться с малой молекулой. Это может быть особенно проблематичным для мембранных белков, которые часто подвергаются конформационные изменения после удаления из их родной среды, или просто агрегировать и выпадать в осадок из раствора. Во-вторых, малая молекула должна быть химически модифицированы таким образом, что он может быть иммобилизован на смолу, сохраняя при этомего способность связываться белок-мишень. Поэтому глубокие связывающие карманы могут стать недоступными для небольшой молекулы, как только она крепится к смоле. В-третьих, аффинность связывания должно быть достаточно высоким, что взаимодействие поддерживается в течение этапов промывки, что делает идентификацию более низкое сродство взаимодействий сложных. В-четвертых, условия окружающей среды, таких как рН, концентрации ионов, или при наличии других эндогенных молекул могут изменяться в пространстве внутри клетки и являются иногда предпосылками наркотиков целевых взаимодействий. Таким образом, нахождение правильных условий для обеспечения и поддержания связывания вне клетки может потребовать значительного количества проб и ошибок.
Фотоаффинное мечение обходит эти проблемы, позволяя ковалентную связь маленькой молекулы и его мишенью в нативной контексте клетки. Вместо того, чтобы иммобилизацию небольшую молекулу с большой громоздкой смолой, молекула вместо химически модифицированы, чтобы установить два небольших функциональный гroups: а Фотоактивируемая фрагмент, который позволяет ковалентного сшивания с белком-мишенью при облучении с определенной длиной волны света, а репортер группа, которая позволяет целевой белок, чтобы быть обнаружены и затем выделяют. Живые клетки обрабатывают с фотоаффинной зондом, зонд связывается и ковалентно сшивает с белком-мишенью, и зонд-белковый комплекс, затем выделяют нетронутым. Специфичность зонда связывания с мишенью демонстрируется путем проведения эксперимента конкуренции параллельно, где избыток исходного соединения, который используется, чтобы конкурировать в сторону связывания зонда с белком-мишенью.
Конструкция и синтез фотоаффинной зондов сильно варьируется от одной маленькой молекулы к другой, и не будет рассматриваться в этом протоколе; Тем не менее, несколько отличных дискуссий по этому вопросу были опубликованы 5-9. Основным фактором является то, что зонд сохраняет биологическую активность исходного соединения, поэтому presumabLY привязки к той же цели (ов). Отношения структура-активность (SAR) исследования должны быть выполнены, чтобы определить, какие части молекулы могут быть изменены без потери биологической активности. Множество различных химических групп , которые были использованы в качестве сшивающих агентов фотоактивируемых, в том числе diazirine, бензофенон и арил азид, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки 10. Кроме того, есть несколько тегов репортер, которые были использованы для изоляции зонд-связывающих белков. Репортерные группы могут быть функциональными сами по себе, такие как обычно используемые биотином или флуоресцентных меток, или могут быть предшественниками , которые требуют дальнейшей функционализации после стадии фотосшивки, которые имеют преимущество быть меньше и , таким образом , менее вероятно , к компромиссу биоактивность 11.
В этом протоколе, мы использовали фотоаффинной зонд, содержащий diazirine фотосшивающих группу и терминала алкина для присоединения репортерной группы через Cu (I) -catalyzред Azide-алкине Шарплесс-Hüisgen циклоприсоединения (или щелчок) реакция 12-15. Исследования SAR, зондировать дизайн и синтез, и результаты этих исследований были опубликованы в другом месте 16-18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол был адаптирован из МакКиннон и Тонтона 10 для использования в живых клетках.
1. Получение культивируемых клеток
- Готовят стерильные 6-см чашки для культивирования клеток количества отсчетов, требуемых (см ниже).
Примечание: Одно блюдо из клеток используется в состоянии обработки, но если больше белка требуется 2 или 3 блюда могут быть приготовлены в состоянии и в сочетании после УФ-облучения.- Подготовьте по крайней мере 3 блюда клеток; Отрицательный контроль только ДМСО (D), единственным методом лечения зонд (P), и зонд + конкурент (C).
- Необязательно, подготовить 4 - е блюдо как без контроля УФ, лечиться с зондом , но не подвергнутый УФ - светом.
Примечание: Если несколько молекул конкурента должны быть испытаны, такие как различные аналоги небольшой интерес молекулы, подготовить дополнительные конкурирующие пластины по мере необходимости.
- Добавить клетки HEK293T в культуральных чашках в 4 мл культуральной среды. Используйте 3,5 млн гргезов на чашку.
Примечание: Число ячеек должны быть определены для каждого типа клеток, так что клетки почти 100% сплошности в начале эксперимента, с целью достижения максимального выхода белка. Для HUVEC, используют 0,3 миллиона клеток на чашку. Хорошее приближение 1/10 клеток в см чашку сливающийся 15. HEK293T клетки должны быть культивированы в модифицированной по способу Дульбекко орлов среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина. - Возвращение клетки в культуральную инкубатор (37 ° С, 5% СО 2) в течение ночи.
2. Обработка клеток и фотосшивающих
- На следующий день, предварительно аликвоты следующие препараты в 1,5 мл микропробирок:
- Для первой обработки, добавьте 4 мкл ДМСО до 2 пробирки и 4 мкл 10 мМ конкурента (т.е. немодифицированного исходного соединения) до 1 трубки.
- Для второй обработки, добавляют 16 мкл ДМСО в 1 пробирку и 16 мкл 50 &# 181; M фотоаффинное зонд 2 трубок.
Примечание: Оптимальная концентрация может быть различным для различных зондов (обсуждение см), но между 200-500 нмоль является хорошей отправной точкой (здесь мы используем 200 нм). Концентрация конкурента должна превышать зонда, по меньшей мере в 20 раз (в данном случае мы используем 10 мкМ). Конечная концентрация ДМСО должна быть одинаковой во всех пластинах и не должна превышать 0,5% (20 мкл объем).
- Доведите клеточные пластины в капот культуре клеток и добавить предварительно аликвоты препараты из стадии 2.1.1 следующим образом: Аспирируйте 1 мл культуральной среды, ресуспендируя предварительно аликвоты препарата в средствах массовой информации, и осторожно добавляя его обратно к падению пластины мудрым. Добавить ДМСО в (D) пластины ДМСО и зонд (P) пластины, а также добавить конкурента на конкурс (C) пластины. Возвращение пластины в культуральную инкубаторе в течение 30 мин.
- С огнями в капот культуре серым цветом, добавить предварительно аликвоты зонд с шага 2.1.2 зонд (P) и конкуренции (C) плиты и добавитьДМСО в ДМСО (D) пластины, как описано выше. Возвращение пластины в культуральную инкубаторе в течение 1 часа.
- Во время инкубации, подготовить следующие пункты; Лоток льда, который может поместиться все из пластин; ледяной буфера для лизиса (PBS [рН 8,5] + ингибитор протеазы 1x коктейль [полный EDTA-свободный, разведенным из маточного раствора 50x сделанного в воде]; 200 мкл / чашку); микроцентрифужных трубки помечены D, P или C для каждого из различных условий обработки, на льду.
- За 15 мин до конца 1 ч инкубации, установить УФ-лампы (365 нм) в холодной комнате и включите его, чтобы разогреть лампу.
- Через 1 ч инкубации с зондом, поместите посуду на лед. Промывают клетки осторожно с помощью 5 мл охлажденного льдом PBS (рН 7,4) для удаления избытка зонда. Повторно покрывают клетки с 4 мл охлажденного льдом PBS.
- Поместите блюдо клеток, сосредоточенных на 3 см под УФ-лампой на верхней части рукавицей, чтобы минимизировать нагрев от лампы. Облучают в течение 3 мин. Удалить блюдо в лоток льда и повторить для всех образцов.
- осле облучение, аспирация PBS от клеток и добавляют 200 мкл охлажденного льдом PBS (рН 8,5) с ингибиторами протеазы к каждой пластине. Открепления клеток от пластины с помощью резинового скребка и передачи на предварительно меченных микропробирок на льду.
- Добавить SDS до конечной концентрации 0,4% (10 мкл 10% SDS в 250 мкл образца).
ВНИМАНИЕ: SDS порошок является опасным. Избегайте вдыхания порошка SDS, надев маску на нос и рот. - Лизировать клетки путем обработки ультразвуком суспензии в течение 10 импульсов (выход 1, рабочий цикл 30%) и инкубировать на льду в течение 1 мин до второго раунда 10 импульсов.
- При необходимости удалить 2 мкл суспензии, и проверить под световым микроскопом, чтобы обеспечить полный лизис клеток.
- Кипение образцы на горячей плите, установленной на 95 & deg; С в течение 5 мин для завершения клеточного лизиса и денатурации все белки.
- Измерение концентрации белка в каждом образце с использованием спектрофотометрического моюще-совместимого анализа белка, такие как гое Dc анализ протеина по 19, в соответствии с инструкциями производителя, с помощью спектрофотометра , установленного для измерения оптической плотности при 750 нм.
- Нормализация концентрации белка до 2,5 мг / мл (или, если концентрации ниже, чем 2,5 мг / мл, нормализуют к пробе с низкой концентрацией белка) добавлением PBS, рН 8,5 + 0,4% ДСН, при необходимости (например, если образцы 5 мг / мл в 250 мкл, добавляют 250 мкл PBS с рН 8,5 + 0,4% SDS, чтобы получить конечную концентрацию 2,5 мг / мл).
3. Присоединение флуоресцентной метки с помощью Click химии для визуализации меченых белков
- Удалить 40 мкл лизата и переноса клеток в новую пробирку микроцентрифужных. Хранить оставшиеся лизатов для реакции с биотин-азид (этап 4).
- Добавьте следующие реагенты в следующем порядке: 0,2 мкл плавиковый азид (1 мМ маточного раствора в ДМСО), 0,58 мкл ТСЕР (100 мМ запас в воде с 4 экв добавили раствор NaOH, приготовленный свежий), и 3,38 мкл TBTA (1.7 мМ запас в соотношении 4: 1 трет-бутанола в ДМСО). Vortex перемешать.
- Добавить 1,14 мкл CuSO 4 -5Н 2 O (50 мМ в воде) , чтобы начать реакцию. Vortex кратко и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
- Добавляют 50 мкл 2x SDS буфера для образца для гашения реакции. На данный момент, запустить образцы непосредственно на SDS-PAGE геле 20 для достижения наилучших результатов, или в магазине в течение ночи при необходимости -20 ° C.
- Если замораживать образцы, разогревать в течение 5 мин при 95 ° С перед загрузкой в гель.
Примечание: Так как молекулярная масса белка - мишени , как правило , не известно , на данном этапе, то целесообразно , чтобы запустить 2 гелей с различной концентрацией акриламида (т.е., 8% и 15%), или широкий гель градиента диапазон молекулярной массы (то есть, 4-15%), чтобы обеспечить полный охват молекулярной массы. - Когда фронт красителя достиг конца геля, продолжать работать гель еще в течение 5 мин, чтобы гарантировать, что все избыточного unreacted плавиковый азид полностью вышла из геля.
- Удалите гель в контейнер с DDH 2 O и инкубировать в течение 10 мин при осторожном перемешивании, чтобы смыть все излишки плавиковый азид.
- Поместите гель на стеклянную пластинку и сканирования геля с использованием Typhoon флуоресцентного сканера геля в соответствии с инструкциями изготовителя.
4. Вложение биотина Tag с помощью Click Химия для аффинной очистки меченых белков
- Из оставшихся лизатах из шага 3.1, используйте максимальное количество после того, как белка нормализации таким образом, что все образцы имеют такой же объем (например, если после нормализации до 2,5 мг / мл в результате объемы проб 500, 550 и 600 мкл, использовать 500 мкл каждого).
- Предварительно очистить лизаты путем добавления к 50 мкл высокой емкости стрептавидин агарозном бисером, предварительно промытой 2x с PBS (рН 7,4). Инкубируют 1 час при 4 ° С с вращением.
- Гранул шарики центрифугированием при 1000 мкг в течение 3 мин. Удалить тон супернатант в новую пробирку микроцентрифужных на льду и выбросить шарики.
- Удалить 1-2% образца ДМСО в новую пробирку с надписью "вход". Добавьте эквивалентный объем 2x SDS буфера образца и хранят при -20 ° С.
- На 500 мкл лизата, добавьте следующие реагенты: 1,38 мкл биотин-азид (10 мМ исходного раствора в ДМСО), 5,5 мкл ТСЕР, и 32,5 мкл ТБТА. Vortex перемешать.
- Добавить 11 мкл CuSO 4 -5H 2 O в 500 мкл лизата и вихрем кратко. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Добавляют 4 объемов образцов ацетона, охлажденной до -20 ° С. Вихревой образцы и инкубируют в течение ночи при температуре -80 ° С, чтобы полностью осадить белки и удаления непрореагировавшего биотин-азида.
- Центрифуга образцов при 17000 х г в течение 15 мин при 4 ° С для осаждения осажденных белков.
- Аспирируйте супернатант полностью, и resolubilize белки путем обработки ультразвуком в 150 мкл PBS (рН 7,4) + 1% SDS.
- Добавьте образцы к 30 мкл предварительно промытой высокой емкости стрептавидин агарозном бисером и инкубировать 1 час при 4 ° С с вращением.
- Гранул шарики центрифугированием при 1000 мкг в течение 3 мин. Аспирируйте супернатант, содержащий несвязанных белков и выбросьте.
- Добавить 1 мл промывочного буфера (400 мМ NaCl, 50 мМ Трис, 0,2% SDS, рН 7,4) с бортами и инкубировать 5 мин при комнатной температуре с вращением.
- Повторите шаги 4.12 и 4.13 3 раза.
- Аспирируйте промывочный буфер полностью из бисера, и добавить 30 мкл 2x SDS буфера для образца.
- Выдержите в течение 5 мин на C тепла блока 95 °, чтобы освободить белки из бисера.
- Центрифуга бусин в течение 1 мин при 13000 х г при комнатной температуре.
Примечание: На данный момент, образцы можно хранить при температуре от -20 ° С до готовности для запуска SDS-PAGE. Если замораживать образцы, разогревать в течение 5 мин при 95 ° С перед использованием. - Внимательнопипетки буфера для образцов , содержащих белки прочь гранул, и загружают на SDS-PAGE 20 (см важные соображения ниже). Шарики могут быть сохранены для позже, если дополнительного испарения необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения белка серебром пятна, лучшие результаты получаются при использовании густой гель 1 мм. Если группа должна быть вырезаны из серебряной окрашивали гель для масс-спектрометрии (МС) анализа, подготовить все реагенты свежие из стерильных растворов и оставить пустой хорошо между образцами на геле. Для каждой группы вырезаны из зонда полосу, параллельный срез должен быть взят из ДМСО полосу таким образом, что фоновые белки могут быть вычтены. Для проверки достоверности белка ID Вестерн-блот, очень важно также загрузить образец входного сигнала с шагом 4.4 при работе гель SDS-PAGE. - Выполните стандартный протокол либо окрашиванием серебром 21 или Вестерн - блот - 22 для обнаружения целевой белок (белки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты , представленные здесь , были получены с помощью фотографического сродства зонда противогрибкового лекарственного итраконазол, использование которых ранее было опубликовано 16. Эти результаты демонстрируют использование живых клеток методом фотоаффинное маркировки, чтобы успешно идентифицировать главную итраконазол-связывающий белок, как 35 кДа мембранный белок зависимые от напряжения Анион канала 1 (VDAC1).
Вышеуказанный протокол проводили в клетках HEK293T с использованием итраконазола зонд для photolabeling и немодифицированной итраконазола в качестве конкурентной молекулы. После того, как образцы были получены, как описано, они были подвергнуты SDS-PAGE, с тем, чтобы отделить белки по молекулярной массе. Маркер молекулярного веса единицы на левой стороне находятся в килодальтон (кД). Первая полоса является контрольный образец ДМСО (D), вторая полоса является пробоотборник (Р), а третья полоса является образцом конкуренции (С). Полосы рвозмущаются в ДМСО только полосе считаются фоном. При анализе этих данных, обратите внимание, что специфические связывающие белки должны отсутствовать в контрольном образце ДМСО, присутствующего в образце, зонда и снижение в образце конкуренции. В этом случае основной полосы белка обнаружены только в Пробозаборное была группа из приблизительно 35 кДа (фиг.1 и 3), который был идентифицирован с помощью масс - спектрометрии , как VDAC1. Идентичность этого белка была подтверждена на рисунке 5 с помощью Вестерн - блоттинга с использованием конкретного VDAC1 антитела. Взятые вместе, эти результаты позволяют сделать вывод о том, что VDAC1 является одним из основных связывающий белок итраконазола в этих клетках.
Рисунок 1 демонстрирует визуализацию протеинов после мечения с флуоресцентной меткой (начиная с шага 3 в протоколе); Рисунок 3 демонстрирует визуализацию протеинов серебром пятна после мечения с биотин тегом и ре rforming аффинной очистки (со стадии 4 в протоколе); и Рисунок 5 демонстрирует проверку белка ID с использованием специфических антител для VDAC1. На рисунках 2 и 4 иллюстрируют то , что произойдет , если определенные шаги в протоколе не выполняются правильно (отмечено в рисункам).
Рисунок 1. Представитель флуоресценция-сканированное SDS-PAGE гель (от стадии 3 протокола) D = ДМСО только. P = зонд только (200 нМ); С = конкуренция (10 мкМ). Маркер молекулярного веса единицы на левой стороне находятся в килодальтон (кД). Стрелка указывает на основной photolabeled полосы белка приблизительно в 35 кДа, который специфически присутствует в зонде полосе и состязано прочь от избытка исходного соединения, что указывает, что он представляет собой специфический связывающий белок.529 / 54529fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. флюоресцентный-сканированное гель. Избыток плавиковый азид не была полностью удалена из геля (шаги 3.6 и 3.7), что вызывает большие черные мазки появляться в нижней части геля. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель серебра окрашивали гель SDS-PAGE после того, как биотин спуском (со стадии 4 в протоколе). Стрелка указывает на той же полосе , что визуализировали на рисунке 1, который впоследствии был вырезаниз геля и подвергали анализу MS для идентификации белков. Маркер единиц на левой стороне находятся в килодальтон (кД). Обратите внимание на пустое пространство в промежутке между каждой полосой для того, чтобы избежать перекрестного загрязнения образцов во время гель нагрузки и зоны иссечения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Окрашивание серебром. Серебро-гель , окрашенный с очень высоким фоновое окрашивание, из - за недостаточной предварительной очистки лизатов (этап 4.2) и / или промывки гранул (этап 4.13). Также обратите внимание на отсутствие пространства между дорожками. Маркер единиц на левой стороне находятся в килодальтон (кД). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры,
Рисунок 5. Вестерн - блот из photolabeled белка 35-кДа, идентифицированного с помощью МС , как VDAC1 после того, как биотин спуском (со стадии 4 в протоколе). Сигнал присутствует в зонде полосе и уменьшается в конкурентной полосе, как показано на рисунках 1 и 3, что подтверждает идентичность белка как VDAC1. Важно, что входной фракции (с шага 4.4) работать параллельно с образцами ниспадающих, чтобы гарантировать, что работы антител и интересующий белок может быть обнаружен в лизате. Небольшое увеличение молекулярной массы может наблюдаться в образцах выпадающие из - за добавленного размера ковалентно связанного зонда. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Различные подходы к определению целевых малых молекул могут быть широко сгруппированы в две категории: сверху вниз, где клеточный фенотип препарат используется, чтобы сузить свои потенциальные цели на основе их известных функций, или снизу вверх, где целевая идентифицируется непосредственно с помощью химического или генетического средства 3. Сверху вниз или фенотипические исследования могут идентифицировать определенные клеточные процессы , пострадавших от препарата (например, транскрипции / трансляции / синтез ДНК, блок клеточного цикла, сигнализации пути активации / торможения и т.д.) , которые могут лежать в основе конечной фенотип маленькой молекулы, которая помогает сузить список потенциальных мишеней для белков, участвующих в этих процессах. Тем не менее, основным недостатком сверху вниз подхода заключается в том, что он опирается на то, что уже известно об этих процессах, и поэтому смещена по целям, чьи функции не были охарактеризованы или не были описаны ранее участвоватьв данном процессе.
Подход снизу вверх обходит эту проблему путем определения цели непосредственно беспристрастно. Это может быть достигнуто с помощью генетических средств; например, путем скрининга библиотеки shRNA для нокдаун клеточных линий , которые придают устойчивость или повышенная чувствительность к препарату, или путем выделения клеточных линий с лекарственной устойчивостью и с использованием геномной последовательности , чтобы определить , какие гены содержат мутации 1. Эти типы экспериментов можно идентифицировать ключевые белки или путей, связанных с активностью препарата, но не обязательно доказать прямое связывание с идентифицированным белком. Химические подходы, с другой стороны, как правило, предусматривают использование химического зонда для связывания с белком-мишенью непосредственно и позволить его выделению и идентификации. Проектирование зонд, который сохраняет свою способность связываться с белком-мишенью требует использования исследований SAR, чтобы определить позицию на молекулы, которые могут быть изменены без значительной потери активности. Это ALSO требует , чтобы зонд быть в состоянии связать свою цель либо ковалентно , либо с достаточно высокой степенью сродства , что она может быть изолирована от других клеточных белков (т.е. аффинно очищенного), и что эти белки сохраняют способность связывать малую молекулу за пределами их родной клеточной среде. Это требование может быть проблематичным для определенных целей; например, интегральными мембранными белками часто требуют определенной липидной среде для поддержания их активной конформации, и может стать агрегированными или неправильно ориентированной на связывание лиганда, как только клетки лизируют. Описанный в этой рукописи метод позволяет избежать этих потенциальных ловушек аффинной очистки, позволяя ковалентной модификации белка - мишени в нативной клеточной среде, так что последующие манипуляции не могут прерывать наркотиков функциональное взаимодействие 10.
Успешная реализация описанного протокола зависит от нескольких факторов. Важно, что в таrget белок малой молекулы достаточно многочисленны в типе клеток, выбранной для photolabeling. Тип клеток наиболее сильнодействующий пострадавших от маленькой молекулы может быть хорошей отправной точкой, но это может быть необходимо протестировать несколько различных типов клеток, чтобы найти один с выходом белка высокой мишени. В качестве альтернативы, обогащение различных популяций белков с помощью внутриклеточного фракционирования может увеличить целевой выход при одновременном снижении фоновой маркировки. Обнаружение флуоресцентно меченных белков в целом гораздо более чувствительны, чем обнаружение белка серебром пятна; следовательно, полосы, обнаруженные с помощью флуоресценции не может быть детектируемый путем окрашивания серебром после биотина спуском. Расширение масштабов эксперимента с помощью нескольких блюд клеток на каждое условие обработки может помочь преодолеть эту проблему обнаружения. Повышение концентрации зонда может также помочь улучшить спускающее урожайности. Конкретные группы также могут быть затенен высоким фоном, и в этом случае более жесткие стирки, множественный пред-клиринговых шаги, или использование гранул разного состава (например, магнитные шарики вместо агарозы), может быть полезным. Тем не менее, если целевой белок является слишком низким, в изобилии это не может быть возможно обнаружить серебром. Кроме того, если целевой белок не мигрирует в виде острого полосы на SDS-PAGE (например, сильно гликозилированных белков), она также будет более трудно визуализировать. Дальнейшие модификации протокола можно было бы сделать, чтобы преодолеть эти проблемы, такие как выполнение целого образца протеомики или SILAC (стабильный изотоп маркировки аминокислотами в клеточной культуре) для идентификации меченых белков после того, как спуском, избавляя от необходимости вырезать полосу из серебряной пятнах геля.
Еще одним важным фактором является концентрация зонда для использования в эксперименте. В идеале следует использовать наименьшее количество зонда, который производит обнаруживаемый сигнал. Более высокие концентрации будут давать более высокий сигнал, но и более высокий фоновый маркировку, и как только все ое сайты связывания на самой высокой цели сродства насыщаются могут быть дополнительные цели более низкое сродство, которые начинают быть обнаружены. Таким образом, оптимальная концентрация должна быть определена эмпирически, начиная с относительно высокой концентрацией (1-2 мкм) и титруют обратно до тех пор, только один или два белка маркированы и конкуренция очевидна.
Эффективность зонда может быть принято во внимание при выборе исходной концентрации; Тем не менее, в зависимости от целевого изобилию и режим торможения, может не быть хорошая корреляция между активностью зонда и обнаружения целей (например, зонд с низким ингибированием наномолярной не обязательно тянуть вниз достаточное количество белка при низких концентрациях наномолярными быть обнаружены ). Таким образом, предпочтительно, чтобы определить наиболее подходящий концентрацию эмпирически с использованием функции обнаружения меченых белков, как считыванием. Концентрация конкурента используется должна превышать зонда по крайнейне менее 20 раз, но уход также должны быть приняты, чтобы не превышать предел растворимости конкурента.
В случае, когда несколько белков разобрано зондом, идентификация функционально соответствующего белка становится более сложным. Тем не менее, есть несколько способов, чтобы помочь сузить потенциальные целевые белки. Как было упомянуто выше, титрованием обратно концентрацию зонда может помочь улучшить специфичность маркировки. По мере того как концентрация зонда капли, более высокое сродство связывания белков должны сохранять интенсивность сигнала в то время как низшие белки сродства должны исчезнуть. Деконволюции множества потенциальных мишеней также может быть облегчено использованием химических аналогов исходного соединения с различной степенью активности. Теоретически, для функционально соответствующей цели, должна быть корреляция между связывания с мишенью и активность аналога. Например, конкуренция неактивными аналогами исходного соединения, может быть использован, чтобы исключить связывания рroteins, которые не участвуют в фенотипических эффектов соединения. Подобным же образом, активные аналоги или другие малые молекулы, которые индуцируют один и тот же фенотип, что и исходное соединение, может быть использован, чтобы помочь правило в соответствующих связывающих белков. В том же ключе, использование неактивного или структурно неродственного фотоаффинной зонда может помочь исключить нерелевантные белки.
Проверка целевого белка первого требует проверки белка, идентифицированного МС. Это может быть легко достигнуто с помощью Вестерн-блоттинга после биотина спуском, предполагая высокого качества антитела для целевого белка доступен. Тем не менее, при работе с незнакомой белка легко тратить значительное время и деньги на плохих антител. Поэтому крайне важно, чтобы антитела быть подтверждено, и что он обнаруживает определенную полосу в лизате клеток, используемых для маркировки (то есть, входной образец). Кроме того, так как выход белка после того, как спуском может быть низким, муравейibody должен быть очень чувствительным, и в зависимости от антитела, высокие концентрации могут быть необходимы (до 1: 100 разбавлении в некоторых случаях). Чтобы избежать этих проблем, помеченный вариант белка может быть выражена в клетках, прежде чем photolabeling, а тег затем может быть использован для обнаружения белка после спуском.
После того, как белок ID подтверждается, функциональная проверка мишени может быть достигнуто с помощью генетических и / или фармакологические манипуляций или функциональных анализов мишени интереса, чтобы показать, что активность мишени зависит от связывания малой молекулой. Сайт связывания может быть сопоставлен с идентификации аминокислоту, модифицированную зондом, или определения 3-мерную структуру связанного малой молекулы с помощью рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии. В идеале, если мутант может быть обнаружено, что теряет способность связывать малую молекулу, она должна быть в состоянии отменить активность малой молекулы при экспрессии вместо дикого типа проТейн. Кроме того, может быть желательным, чтобы показать специфичность связывания с мишенью по сравнению с другими структурно родственными или "вне цели" белков.
Этот общий протокол может быть использован в любых применений, требующих непосредственного измерения малой молекулы-связывания с белком-мишенью, до тех пор, в качестве зонда, может быть сделано, который сохраняет биологическую активность исходного соединения. Потенциальные области применения включают в себя, но не ограничиваются ими, определение молекулярных мишеней новых соединений, геодезия потенциал вне целей существующих лекарственных средств, что подтверждает прямое связывание небольшой молекулы к конкретному белка, представляющего интерес, определения конкуренции связывания другими малыми молекулами в тот же сайт связывания на белке, и открытие новых рецепторов природного происхождения или эндогенных лигандов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C. |
| Copper Sulfate (CuSO4•5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20 °C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2x) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
- Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
- Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
- Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
- Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
- Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
- Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
- Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
- Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
- Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
- Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
- Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
