Introduction
생리 활성 소분자 근본적 셀과 상호 작용하는 하나 이상의 "대상"분자, 가장 일반적으로 단백질의 기능을 변경함으로써 작동한다. 약물 발견에 때 활성 화합물 표현형 선별을 통해 발견되고, 그 화합물의 분자량이 타겟 (들)의 식별은 작용 화합물의 잠재적 부작용의 메커니즘을 이해뿐만 아니라 대한 잠재적으로 발견되지 중요 새로운 생물학 질병 모델을 기본 및 치료제 (1)의 새로운 기계적인 클래스의 개발을위한 방법을 포장. 목표 식별이 치료에 사용하고자하는 약물이 필요하지 않지만, 최근에는 신약 후보 검증 대상이 알려진 경우보다 투자 수익률을 수득 때문에 임상 시험에 성공하고, 가능성이 있음을 점점 인식되고있다 2. 따라서, 작은 식별하는 방법에 대한 관심이 증가되고있다분자 표적 단백질.
고전 목표 식별 실험은 일반적으로 관심의 작은 분자는 수지상에 고정화 비 결합 단백질을 씻어, 나머지 단백질 용출 3를 식별 한 후, 전체 세포 용 해물과 배양 친 화성 정제에 의존한다. 이 기술은 여러 개의 작은 분자들 (4)의 타겟을 식별하기 위해 사용되었지만, 여러 가지 이유로, 범용 대상 ID 방법으로 적합하지 않다. 먼저, 표적 단백질은 작은 분자에 결합하는 능력을 유지하기 위해 세포 용해시의 기본 형태를 유지해야한다. 이것은 종종 그들의 네이티브 환경에서 제거 된 후 구조적인 변화를 거쳐, 또는 단순히 집계 및 용액으로부터 침전 막 단백질, 특히 문제가 될 수 있습니다. 유지하면서 두 번째로, 작은 분자는 화학적으로는 수지에 고정화 될 수있는 방식으로 수정해야표적 단백질에 결합 할 수있는 능력. 이 수지에 고정되면 깊은 결합 포켓 따라서 작은 분자에 액세스 할 수 없게 될 수 있습니다. 셋째, 결합 친화력은 상호 작용이 어려운 낮은 친화력 상호 작용을 확인하기가 세정 단계 동안 유지되도록 충분히 높아야한다. 등의 pH, 이온 농도, 또는 다른 내인성 분자의 존재 넷째, 환경 조건은 셀 내의 공간적으로 다양하고 때로는 약물 표적 상호 작용을 전제되어있다. 따라서, 허용 시행 착오 상당량 필요로 할 수있는 셀의 외부 결합 유지하도록 적절한 조건을 찾아 내기.
Photoaffinity 라벨링 소분자와 셀의 기본 문맥 내에서 타겟의 공유 결합을 허용함으로써 이러한 문제를 회피. 오히려 부피가 큰 수지 소분자 고정화보다 분자 대신 두 개의 작은 화학적 작용 g을 설치하도록 수정roups : 빛의 특정 파장의 조사 대상의 단백질에 공유 결합 가교를 할 수있는 광활성 부위 및 표적 단백질을 검출하고이어서 분리 할 수있는 리포터 기. 생균 프로브가 공유 결합하여 표적 단백질에 가교 및 프로브 단백질 복합체는 절연 그대로 상기 photoaffinity 프로브로 처리된다. 표적에 결합하는 프로브의 특이성은 모 화합물의 과량의 표적 단백질로 프로브의 결합 거리 경쟁하는 데 사용되는 병렬로 경쟁 실험을 수행함으로써 입증된다.
photoaffinity 프로브의 설계 및 합성은 하나의 작은 분자에서 다른 매우 다양하고,이 프로토콜에 포함되지 않습니다; 그러나, 주제에 대한 몇 가지 훌륭한 토론 5-9을 발표했다. 주요 고려 presumab 따라서, 프로브는 모 화합물의 생물학적 활성을 유지한다는 것이다LY는 동일한 타겟 (들)에 대한 결합. 구조 활성 관계 (SAR) 시험은 분자의 일부가 생체 활성의 상실없이 변형 될 수 있는지 결정하기 위해 수행되어야한다. 다른 화학 그룹이 다양한 각각의 장단점이 10 diazirine 페논, 아릴 아 지드를 포함 광활성 가교제,로서 사용되어왔다. 마찬가지로, 프로브 - 결합 단백질을 분리하는 데 사용 된 여러 리포터 태그가있다. 리포터 그룹은 일반적으로 사용되는 바이오틴 또는 형광 태그와 같은 자신의 기능 일 수 있고, 이하와 생체 활성 (11)을 손상하는 것이 어려울 수 있다는 장점을 가지고있는 광 가교 공정과, 이후 상기 작용을 필요 전구체 일 수있다.
이 프로토콜에서, 우리는 diazirine의 광 가교기를 함유하는 photoaffinity 프로브, 및 구리 (I)을 통해 리포터 그룹의 부착 말단 알킨 -catalyz을 사용한에드 아 지드 - 알킨 샤프 - Hüisgen의 사이클로 (또는 클릭) 반응 12-15. 은 SAR 연구, 설계 및 합성을 조사하고, 이러한 연구의 결과는 다른 곳에서 16-18 발표되었다.
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Protocol
참고 :이 프로토콜은 살아있는 세포에 사용 맥키와 톤턴 (10)에서 적응했다.
배양 된 세포의 1. 준비
- (아래 참조) 원하는 샘플 수에 대한 멸균 6 cm 세포 배양 접시를 준비합니다.
주 : 셀들 중 하나 접시가 처리 조건에 따라 사용되지만, 더 많은 단백질이 2 또는 3 요리 상태별로 준비하고, UV 조사 후 결합 될 수있다 요구되는 경우.- 세포의 최소 3 요리를 준비; DMSO 만 (D) 프로브 처리 만 (P)과 프로브 + 경쟁 (C)와 음성 대조군.
- 선택적으로, 아니 UV 컨트롤로 4 번째 접시, 프로브로 치료하지만 자외선에 노출되지 할 준비를합니다.
주 : 여러 경쟁 분자는 관심 소분자 다른 유사체로서 시험 할 경우, 필요에 따라 추가로 경쟁 판을 준비한다.
- 4 ml의 배양 배지에서 배양 접시에 HEK293T 세포를 추가합니다. 350 만 C를 사용하여접시 당 ELL 학생.
주 : 셀은 실험 시작시 약 100 % 컨 플루 언트되도록 세포의 수가 최대 단백질 수율을 달성하기 위해, 각 세포 유형에 대해 결정되어야한다. HUVEC를 들어, 접시 당 0,300,000 세포를 사용합니다. 좋은 근사 합류 15cm 접시에 세포의 1/10이다. HEK293T 세포에서 배양한다 둘 베코 변형 이글스 중간 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. - 문화 인큐베이터로 세포를 반환 (37 ° C, 5 % CO 2) 하룻밤.
세포 및 광 가교 2. 치료
- 다음 날, 미리 나누어 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 다음 약물 :
- 첫 번째 치료를 위해, 2 관 1 관 10 mM의 경쟁자 (즉, 수정되지 않은 모 화합물)의 4 μL에 DMSO의 4 μl를 추가합니다.
- 두 번째 치료를 위해, 1 관 DMSO의 16 μl를 50 & 16 μl를 추가# 181; 2 관에 M의 photoaffinity 프로브.
주 : 최적 농도는 다른 프로브 (설명을 참조)에 대해 상이 할 수 있지만, 200 ~ 500 nm의 사이에서 좋은 출발점 (여기에서는 200 nm의 사용)이다. 경쟁자의 농도는 프로브 최소 20 배 (여기에 우리가 10 μM 사용)의 초과한다. DMSO의 최종 농도는 모든 판에서 동일해야하며, 0.5 % (20 μL 볼륨)를 초과하지 않아야합니다.
- 세포 배양 후드로 셀 플레이트를 가지고 다음과 같이 단계 2.1.1에서 프리 분주 약물을 추가 배양액 대기음 1ml를 상기 배지에서 미리 분주 약물을 재현 탁하고, 가볍게 플레이트 강하로 다시 추가 슬기로운. DMSO를 (D) 플레이트와 프로브 (P) 판에 DMSO를 추가하고, 경쟁 (C) 판에 참가자를 추가합니다. 30 분 동안 배양 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
- 흐리게 문화 후드에서 조명과 함께, 조사 단계 2.1.2에서 미리 분주 프로브를 추가 (P)과 경쟁 (C) 판과 추가상기와 DMSO (D) 판 DMSO. 1 시간 동안 배양 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
- 배양하는 동안, 다음 항목을 준비; 판을 모두 들어갈 수있는 얼음 트레이; 빙냉 용해 완충액 (PBS [pH를 8.5] + 1X 프로테아제 억제제 칵테일 [완전 EDTA없는 물로 이루어진 50X 원액으로부터 희석] 200 μL / 플레이트); 마이크로 원심 튜브를 얼음에, 다른 처리 조건들 각각에 대해 D, P, 또는 C로 표시.
- 1 시간 배양이 끝나기 전에 15 분, 추운 방에 UV 램프 (365 나노 미터)를 설정하고 전구를 따뜻하게 전원을 켭니다.
- 프로브와 1 시간 배양 한 후, 얼음에 요리를 놓습니다. 여분의 프로브를 제거하고 부드럽게 5 ml의 얼음처럼 차가운 PBS (PH 7.4)로 세포를 씻으십시오. 4 ml의 빙냉 PBS로 세포를 다시하면-커버.
- 램프의 발열을 최소화하기 위해 얼음 팩의 상단에 UV 램프에서 3cm를 중심으로 세포의 요리를 놓습니다. 3 분 동안 조사. 얼음 트레이에 접시를 제거하고 모든 샘플에 대해 반복합니다.
- 에이따고 조사는 세포에서 PBS를 대기음하고 각 플레이트에 단백질 분해 효소 억제제와 얼음처럼 차가운 PBS (PH 8.5)의 200 μl를 추가합니다. 얼음에 미리 라벨링 마이크로 원심 튜브 고무 스크레이퍼 및 전송을 사용하여 플레이트로부터 세포를 분리.
- (샘플 250 μL에 10 % SDS 10 μL)에 0.4 %의 최종 농도로 SDS를 추가한다.
주의 : SDS 분말은 위험합니다. 코와 입을 통해 마스크를 착용하여 SDS 분말을 흡입하지 마십시오. - 10 펄스를 Lyse (출력 1, 듀티 사이클 30 %)를위한 현탁액을 초음파 처리하고 10 펄스의 두 번째 라운드 전에 1 분 동안 얼음에 부화하여 세포.
- 필요한 경우 현탁액 2 μL를 제거하고 전체 세포 용해를 확인하기 위해 광학 현미경 검사.
- 세포 용해를 완료하고 모든 단백질 변성을 5 분 동안 95 ℃로 설정 한 핫 플레이트에 샘플을 끓인다.
- 이러한 번째로, 분광 세제 대응의 단백질 분석을 이용하여 각 샘플의 단백질 농도를 측정750 nm에서 흡광도를 측정하도록 설정된 분광 광도계 제조업체의 지시에 따라 전자 DC 단백질 분석 19.
- 필요 PBS pH를 8.5 + 0.4 % SDS를 첨가하여 2.5 ㎎ / ㎖로 단백질 농도를 정상화 (또는 농도 인 경우보다 낮은 2.5 ㎎을 / ㎖, 가장 낮은 단백질 농도 시료 정상화) (예를 들어, 샘플 5 있다면 250 μL의 ㎎ / ㎖는) 2.5 mg / ml의 최종 농도를 얻기 위해 PBS pH를 8.5 + 0.4 % SDS 250 μL를 추가한다.
레이블이 단백질의 시각화를 클릭 화학에 의한 형광 태그 3. 첨부 파일
- 새의 microcentrifuge 튜브에 세포 용 해물 및 전송의 40 μl를 제거합니다. 비오틴 - 아 지드 (4 단계)과의 반응에 대한 나머지 해물을 유지합니다.
- 순서대로 다음과 같은 시약을 추가 : 0.2 μL의 불소 - 아 지드 (DMSO의 1 mM의 원액), 0.58 μL의 TCEP (100 mM의 주식을 물에 수산화 나트륨을 첨가 4 당량, 신선한 준비), 및 3.38 μl를 TBTA (1.4 7 밀리미터 재고 : DMSO에 t- 부탄올의 1 비율). 소용돌이는 혼합한다.
- 반응을 시작합니다 1.14 μl를 -5H 2 O (물에 50 mM)을 CuSO 4를 추가합니다. 간단히 와동과 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 배양한다.
- 반응을 종결 배 SDS 샘플 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 이 시점에서 하룻밤 필요한 경우 -20 ° C에서 최상의 결과를, 또는 상점에 대한 SDS-PAGE 겔 (20)에 직접 샘플을 실행합니다.
- 샘플을 동결하면 겔 상에 로딩하기 전에 95 ℃에서 5 분 동안 가열한다.
주 : 목적 단백질의 분자량은 일반적으로이 단계에서 공지되어 있지 않기 때문에, 그것은 다른 아크릴 아마이드 농도가이 겔을 실행하는 것이 바람직하다 (즉, 8 % 및 15 %), 또는 넓은 분자량 범위 구배 겔 (즉, 4-15%)는 전체 분자량 범위를 확인합니다. - 염료 프론트 겔의 끝에 도달하면, 초과 unreacte 모두를 위해 추가로 5 분 동안 겔을 계속 실행할(D) 불소 지드 완전히 겔을 종료했다.
- DDH 2 O와 컨테이너에 젤을 제거하고 멀리 모든 초과 불소 - 아 지드를 씻어, 부드러운 교반과 함께 10 분 동안 품어.
- 유리 기판 상에 겔을 위치시키고 제조자의 지시에 따른 형광 태풍 겔 스캐너를 사용하여 겔을 검사한다.
레이블이 단백질의 선호도 정화를 클릭 화학에 의한 비오틴 태그 4. 첨부 파일
- 단계 3.1에서 나머지 해물 중에서 후 정규화 2.5 ㎎ / ㎖ 얻어진 샘플 볼륨은 500, 550, 600 μL를 있으면 모든 샘플은 (예를 들어 동일한 양이되도록 단백질 정규화 이후 최대 크기를 사용하여, (500)을 사용하여 각각의 μL).
- PBS (PH 7.4) 50 μL에 고용량 스트렙 아가 로스 비드, 예비 세척 된 배를 추가하여 용 해물을 미리 투명한. 회전 4 ° C에서 1 시간을 품어.
- 3 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 구슬을 펠렛. t을 제거그는 얼음에 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는와 구슬을 버린다.
- "입력"이라는 새로운 튜브에 DMSO 샘플의 1 ~ 2 %를 제거합니다. -20 ° C에서 2 배 SDS 샘플 버퍼와 저장소의 동등한 볼륨을 추가합니다.
- 해물의 500 μL 당, 다음과 같은 시약을 추가 : 1.38 μL 비오틴 - 아 지드 (DMSO에서 10 밀리미터 주), 5.5 μL TCEP, 32.5 μL의 TBTA합니다. 소용돌이는 혼합한다.
- 11 μl를 간단히 해물과 소용돌이의 500 μL 당 -5H 2 O CuSO 4를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
- -20 ° C로 냉각 아세톤 4 샘플 볼륨을 추가합니다. 샘플 및 -80 ° C에서 밤새 품어 소용돌이 완전히 단백질을 침전과 미 반응 비오틴 - 아 지드를 제거합니다.
- 원심 분리기는 4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에 샘플을 침전 된 단백질을 펠렛합니다.
- 완전히 뜨는을 대기음, 150 μl의 PBS (산도 7.4) + 1 % SDS에서 초음파에 의해 단백질을 resolubilize.
- 30 μl를 미리 씻어 고용량 스트렙 타비 아가로 오스 비즈에 샘플을 추가하고 회전 4 ° C에서 1 시간을 품어.
- 3 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 구슬을 펠렛. 언 바운드 단백질 및 폐기를 포함 뜨는을 대기음.
- 구슬로 세척 완충액 (400 mM의 염화나트륨, 50 mM 트리스, 0.2 % SDS, pH를 7.4) 1 ㎖를 추가하고 회전 실온에서 5 분 품어.
- 반복 4.12 및 4.13 3 번 단계를 반복합니다.
- 구슬에서 완전히 세척 버퍼를 대기음, 그리고 배 SDS 샘플 버퍼의 30 μl를 추가합니다.
- 비즈에서 단백질을 분리하기 위해 95 ° C 열 블록에 5 분 동안 품어.
- 실온에서 13,000 × g으로 1 분간에 비드를 원심 분리기.
주 :이 시점에서, 샘플을 SDS-PAGE를 실행할 준비가 될 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 시료를 냉동하는 경우, 사용하기 전에 95 ℃에서 5 분 동안 가열한다. - 면밀히비드 오프 단백질을 포함하는 시료 완충액을 피펫 및 SDS-PAGE (20) 상에로드 (아래 중요한 고려 사항 참조). 비드 리 보일 필요 이상 동안 저장 될 수있다.
주 : 실버 염색에 의한 단백질의 검출을 위해, 더 나은 결과가 1 mm 두께의 겔을 사용하여 얻어진다. 밴드는 질량 분석 (MS) 분석을위한 실버 스테인드 겔에서 절단 할 경우, 멸균 솔루션에서 신선한 모든 시약을 준비하고 겔에 샘플들 사이에서 잘 빈 둡니다. 그 배경 단백질 감산 될 수 있도록, 프로브로부터 절단 차선마다 대역 병렬 슬라이스는 DMSO 차선에서 촬영한다. 웨스턴 블롯에 의해 단백질의 확인을위한 ID, 상기 SDS-PAGE 젤을 실행하는 경우에도 단계 4.4로부터의 입력 샘플을 로딩하는 것이 중요하다. - 표적 단백질 (들)을 감지하는 실버 염색 (21) 또는 웨스턴 블롯 (22) 중 하나의 표준 프로토콜을 따르십시오.
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Representative Results
여기에 표시된 결과는 이전에 16 게시 된 사용하는의 항진균제 이트라코나졸의 사진 친 화성 프로브를 얻었다. 이러한 결과는 성공적 35 kDa의 막 단백질 전압 가변 음이온 채널 1 (VDAC1)와 같은 주요 이트라코나졸 결합 단백질을 확인하기 위해 살아있는 세포 photoaffinity 라벨링 기술의 사용을 입증한다.
상기 프로토콜은 참가자 분자로서 photolabeling 및 변성 이트라코나졸 용 프로브를 사용하여 이트라코나졸 HEK293T 세포에서 수행 하였다. 설명 된 바와 같이 샘플을 제조 하였다 후, 이들은 분자량 단백질을 분리하기 위하여 SDS-PAGE를 실시 하였다. 왼쪽 분자량 마커 단위는 킬로 달톤 (kDa의)에있다. 첫 차선은 DMSO 제어 시료 (D)이며, 두 번째는 레인 프로브 샘플 (P)이고, 상기 제 차선 대전 샘플 (C)이다. 밴드 페이지DMSO를 전용 차선에 분개는 배경으로 간주됩니다. 이러한 데이터를 분석에서는 특정 바인딩 단백질 프로브 샘플에 존재의 DMSO 제어 샘플에 존재해야한다주의와 경쟁 샘플에서 감소했다. 이 경우, 주요 단백질 밴드가 프로브의 샘플은 약 35 kDa의 밴드를 하였다 (도 1 및 3) VDAC1 같은 질량 분석에 의해 확인 된 경우에만 검출. 이 단백질의 ID는 특정 VDAC1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해도 5에서 확인되었다. 함께 찍은, 이러한 결과는 우리가 VDAC1이 세포에서 이트라코나졸의 주요 결합 단백질 인 결론을 내릴 수 있습니다.
그림 1은 형광 태그를 표시 한 후 단백질의 시각화를 보여줍니다 (프로토콜의 3 단계에서)도 3은 비오틴 태그와 체육에 표시 한 후 실버 얼룩에 의해 단백질의 시각화를 보여줍니다 (프로토콜의 4 단계에서) 친 화성 정제를 rforming; 도 5는. VDAC1에 대한 특정 항체를 이용하여 단백질 ID의 유효성을 보여줍니다 2, 4 프로토콜의 특정 단계 (그림 전설에서 언급)이 제대로 수행되지 않은 경우 발생하는 예시도.
그림 1. (프로토콜의 3 단계에서) 대표 형광 검사 SDS-PAGE 겔 D = DMSO 만.; P = 프로브 만 (200 ㎚); C = 대회 (10 μM). 왼쪽 분자량 마커 단위는 킬로 달톤 (kDa의)에있다. 프로브 차선에서 구체적으로 존재하고 특이 적 결합 단백질 인 것을 나타내는, 멀리 초과 모 화합물에 의한 경쟁하는 주요 photolabeled 단백질 밴드에서 약 35 kDa의 화살표를 가리 킵니다.529 / 54529fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 형광 검사 젤. 과량의 불소 - 아 지드 완전히 겔에서 제거되지 않은, 겔의 하단에 표시 큰 검은 얼룩의 원인 (3.6 및 3.7 단계). 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.
그림 3. (프로토콜의 4 단계에서) 비오틴 풀다운 후 대표적인 실버 묻은 SDS-PAGE 겔. 그림 1에서 가시화 된 동일 대역에 화살표 점은, 그 후 적출 된겔로부터 단백질 식별 MS 분석을 실시한. 왼쪽에있는 마커 단위는 킬로 달톤 (kDa의)에 있습니다. 빈 공간의 사이 각 레인, 젤로드 밴드 절단시 시료의 교차 오염을 방지하기 위해 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 실버 염색. 매우 높은 배경 염색 실버 묻은 젤 인해 구슬 (단계 4.13)의 부족 해물의 사전 청산 (단계 4.2) 및 / 또는 세척한다. 또한 차선 사이의 공간의 부족을 확인합니다. 왼쪽에있는 마커 단위는 킬로 달톤 (kDa의)에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(프로토콜의 단계 4)에서 비오틴 풀다운 후 VDAC1로 MS에 의해 식별 photolabeled 35 kDa 단백질의도 5 웨스턴 블롯.이 신호는도 1에서와 같이, 프로브 레인 내에 존재하고 경쟁 차선 감소 3, VDAC1 같은 단백질의 신원을 확인하기. (단계 4.4) 입력 분획 항체 일 관심있는 단백질 분해물에서 검출 될 수 있도록하기 위해, 풀다운 샘플을 함께 실행하는 것이 중요하다. 분자량에 약간의 증가로 인해 공유 부착 된 프로브의 추가 크기로 풀다운 샘플에서 관찰 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
약물의 세포 표현형가 알려진 기능에 따라 잠재적 인 대상을 좁힐하는 데 사용되는 하향식, 또는 상향식 (bottom-up), 대상 : 작은 분자의 목표를 확인하는 다른 방법은 크게 두 가지 범주로 분류 할 수 있습니다 화학 물질 또는 유전 적 수단 (3)에 의해 직접적으로 식별됩니다. 하향식 또는 표현형 연구 약물의 영향을 특정 세포 프로세스를 식별 할 수있다 (예를 들면, 전사 / 번역 / DNA 합성, 세포주기 블록 통로 활성화 / 금지 등 시그널링) 소분자의 궁극적 인 표현형을 기초 수도있는 그 과정에 관여하는 단백질에 대한 잠재적 대상 목록을 좁히는 데 도움이됩니다. 그러나, 하향식 접근법의 주요 단점은 이미 이러한 프로세스에 대해 알려진에 의존하므로, 그 기능 특징되지 않았거나 이전에 관여하는 것으로 설명되지 않은 표적에 대해 가압된다는 점이다주어진 프로세스이다.
상향식 접근 방식은 공정한 방식으로 직접 대상을 식별하여이 문제를 우회. 이것은 유전 적 수단에 의해 달성 될 수있다; 예를 들어, 약물 내성 세포주를 분리 및 유전자가 돌연변이를 함유 한 결정하는 게놈 시퀀싱을 이용하여 약물에 대한 내성을 부여하거나 과민성 최저 세포주 shRNA를위한 라이브러리를 스크리닝. 이런 종류의 실험은 약물의 활성에 관련된 주요 단백질 또는 경로를 식별 할 수 있지만, 반드시 상기 식별 된 단백질에 결합하는 직접 증명하지 않는다. 화학적 방법은, 다른 한편으로는, 일반적으로 직접적으로 표적 단백질에 결합 및 분리 및 식별을 허용하는 화학 프로브의 사용을 포함한다. 표적 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 프로브를 설계하는 것은 활성의 상당한 손실없이 변형 될 수있는 분자에 대한 위치를 식별하기 위해 SAR 연구의 사용을 필요로한다. 이 루게릭 병O는 프로브 중 공유 결합 또는 다른 세포 단백질 (즉, 친 화성 정제)로부터 분리 될 수 있다는 것을 충분히 높은 친화 목표 결합 할 수 있어야하고, 이들 단백질은 그 나라의 외부 소분자에 결합하는 능력을 보유한다는 셀룰러 환경을 제공합니다. 이 요구 사항은 특정 대상에 대해 문제가 될 수있다; 예를 들면, 세포막 단백질은 종종 활성 형태를 유지하기 위해 특정 지질 환경을 요구하고, 응집 또는 부적절한 세포 용균 후 결합 리간드에 대해 배향 될 수있다. 이후의 조작은 약물 표적의 상호 작용 (10)을 방해 할 수 없도록이 논문에 기재된 방법은, 기본 세포 환경 내 표적 단백질의 공유 적 변형을 허용하여 친 화성 정제 잠재적 함정을 피한다.
기술 된 프로토콜의 성공적인 구현은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 그것은 따 중요하다소분자의 rget 단백질 photolabeling 위해 선택된 세포 유형에 충분히 풍부 할. 가장 강력하게 소분자의 영향 세포 형 좋은 출발점이 될 수 있지만, 높은 표적 단백질의 수율을 찾기 위해 여러 다른 유형의 세포를 시험 할 필요가있다. 배경 표시를 감소시키면서 또한, 세포 내 분류에 의해 서로 다른 단백질 인구의 농축은 목표 수율을 증가시킬 수있다. 검출의 형광에 실버 얼룩에 의해 단백질 검출보다 일반적으로 훨씬 더 민감 단백질 태그; 따라서, 형광 검출 밴드는 비오틴 풀다운 후 실버 염색을 감지 할 수 없습니다. 처리 조건에 따라 셀의 다수의 요리를 사용하여 실험을 스케일링이 검출 문제를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 프로브의 농도를 증가 시키면 또한 풀다운 수율을 개선하는데 도움이 될 수있다. 특정 밴드도, 높은 배경에 의해 가려 될 수있는 경우 더 엄격한 세척, 여러 사전에단계, 또는 (예 : 대신 아가로 오스의 자석 구슬 같은) 다른 성분의 구슬의 사용을 삭제하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 표적 단백질이 풍부하게 너무 낮 으면 그러나, 실버 염색에 의해 검출하는 것이 가능하지 않을 수있다. 표적 단백질 (예 : 많이 당화 단백질로) SDS-PAGE에 날카로운 밴드로 이주하지 않는 경우 또한, 또한 시각화하는 것이 더 어려울 것이다. 프로토콜에 추가 수정 아웃 밴드를 절단 할 필요가 없어, 풀다운 후 표지 단백질을 확인하는 등 (세포 배양에서 아미노산에 의해 안정 동위 원소 표지) 전체 샘플 프로테오믹스 또는 SILAC 수행 이러한 문제점을 극복 할 수있다 실버 스테인드 젤.
또 다른 중요한 고려 사항은 실험에 이용되는 프로브의 농도이다. 이상적으로, 검출 가능한 신호를 생성 프로브의 낮은 양이 사용되어야한다. 높은 농도는 오 번 모두 높은 신호뿐만 아니라 높은 배경 라벨 등을 제공합니다가 가장 높은 선호도 대상의 결합 부위가 포화 f를 감지하기 시작 추가 낮은 선호도 대상이있을 수 있습니다. 최적 농도에 따라서 실험적으로 비교적 높은 농도 (1-2 μM)에서 시작하여 다시 적정 하나 또는 두 개의 단백질 표지 및 경쟁 명백되어까지 결정되어야한다.
프로브의 효능은 출발 농도를 선택할 때 고려 될 수있다; 그러나, 상기 타겟 풍부 및 억제 방식에 따라 프로브 활성 및 타겟 검출 사이의 상관 관계가 없을 수있다 (예를 들어, 낮은 나노 몰 억제와 프로브는 반드시 검출 될 낮은 나노 몰 농도에서 충분한 단백질 풀다운되지 ). 따라서, 경험적으로 판독으로 표시 단백질의 검출을 통해 가장 적합한 농도를 결정하는 것이 바람직하다. 사용 경쟁자의 농도에 의해 프로브의 그것을 초과한다적어도 20 배이지만 치료는 참가자의 용해도 제한을 초과하지 않도록주의해야한다.
다수의 단백질이 상기 프로브로 내려 오게되는 경우, 기능적으로 관련된 단백질의 확인은 더 복잡해진다. 그러나, 잠재적 인 표적 단백질을 좁힐 수 있도록 여러 가지 방법이 있습니다. 전술 한 바와 같이, 상기 프로브의 농도를 적정하여 다시 표지의 특이성을 향상시킬 수있다. 프로브의 농도가 떨어짐에 따라 낮은 선호도 단백질이 사라집니다 동안 높은 친 화성 결합 단백질은 신호 강도를 유지해야한다. 다수의 잠재적 인 타겟 컨벌루션은 활성 다양한 수준으로 모 화합물의 화학적 유사체의 사용에 의해 도움을받을 수있다. 이론적으로, 기능적으로 중요한 타겟 아날로그의 타겟과 결합 활성 사이의 상관 관계가 있어야한다. 예를 들어, 모 화합물의 불활성 유사체하여 경쟁 결합 P 배제하는데 사용될 수있다화합물의 효과 표현형에 관여하지 roteins. 마찬가지로, 모 화합물과 동일한 표현형을 유도 활성 유사체 또는 다른 작은 분자가 결합 단백질에 관련 규칙을 돕기 위해 사용될 수있다. 같은 맥락에서, 비활성 또는 구조적으로 관련이없는 photoaffinity 프로브의 사용은 관련이없는 단백질을 배제 할 수 있습니다.
표적 단백질의 검증 먼저 MS에 의해 식별 단백질의 확인이 필요합니다. 이것은 쉽게 표적 단백질을 사용할위한 고품질 항체 가정 비오틴 풀다운 다음 웨스턴 블롯에 의해 달성 될 수있다. 낯선 단백질 작업 그러나 나쁜 항체에 상당한 시간과 비용을 낭비하기 쉽다. 이는 항체가 확인하는 것이 중요하므로, 그것은 세포의 용 해물에서 특정 밴드를 검출한다는 표시 (즉, 입력 샘플)을 위해 사용된다. 또한, 풀다운 후의 단백질 수율이 낮을 수 있기 때문에, 앤트ibody 고감도이어야하고, 항체에 따라 고농도 필요할 수있다 (최대 1 : 일부 경우에 100 희석). 이러한 문제를 피하기 위해, 단백질 태그 버전 photolabeling 전에 세포에서 발현 될 수 있고, 태그는 다음 풀다운 후의 단백질을 검출 할 수있다.
단백질 ID가 확인되면, 대상의 기능 검증 대상의 활성이 작은 분자 결합에 의해 영향을받는 것을 보여주기 위해, 유전 및 / 또는 약물 조작, 또는 관심 대상의 기능 분석에 의해 달성 될 수있다. 결합 부위가 프로브에 의해 변형 아미노산을 식별하거나, X 선 결정학 또는 NMR 분광기에 의해 바인딩 된 작은 분자의 3 차원 구조를 결정하여 매핑 될 수있다. 돌연변이는 작은 분자에 결합하는 능력을 상실 것을 발견 할 수있는 경우 야생형 친 대신에 표현 될 때 이상적으로, 상기 저분자 활성을 폐지 할 수 있어야TEIN. 또 다른 구조적으로 관련된 또는 "오프 - 표적"단백질 위에 표적에 결합 특이성을 표시하는 것이 바람직 할 수있다.
이러한 일반적인 프로토콜 프로브 모 화합물의 생물학적 활성을 보유한다는 이루어질 수만큼, 소분자 결합 단백질 타겟에의 직접 측정을 필요로하는 임의의 응용에서 사용될 수있다. 잠재적 인 응용은 새로운 화합물의 분자 표적을 식별 오프 타겟 기존 약물의 가능성을 조사, 관심있는 특정 단백질에 대한 소형 분자의 직접적인 결합을 확인에서, 다른 작은 분자가 결합 경쟁을 결정하는 단계를 포함하지만 이에 한정되지 않는다 자연스럽게 유도 또는 내인성 리간드의 새로운 수용체를 발견 같은 결합 단백질에 위치합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C. |
| Copper Sulfate (CuSO4•5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20 °C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2x) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
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