Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Introduction

Bioaktive små molekyler fundamentalt arbejde ved at interagere med og ændre funktionen af ​​en eller flere "target" molekyler, mest almindeligt proteiner, i cellen. I lægemiddelforskning, når en aktiv forbindelse er opdaget gennem fænotypisk screening, identifikation af det molekylære mål (r) af denne forbindelse er afgørende, ikke kun for at forstå virkningsmekanisme og potentielle bivirkninger af forbindelsen, men også for potentielt at opdage ny biologi ligger til grund for sygdommen model og bane vejen for udvikling af nye mekanistiske klasser af lægemidler ^1. Selvom identifikation mål ikke er nødvendig for et lægemiddel, der skal anvendes terapeutisk, i de senere år har der været en stigende erkendelse af, at nye lægemiddelkandidater er mere tilbøjelige til at lykkes i kliniske forsøg, og derfor giver bedre afkast på investeringer, hvis en valideret target er kendt ^2. Der har således været en stigende interesse for fremgangsmåder til identifikation af småmolekyle målproteiner.

En klassisk target identifikation Eksperimentet afhænger typisk af affinitetsoprensning, hvor den lille molekyle af interesse immobiliseres på en harpiks og inkuberet med helcellelysater, hvorefter ubundne proteiner vaskes bort, og de ​​resterende proteiner elueres og identificeres ^3. Mens denne teknik er blevet anvendt til at identificere målene for mange små molekyler ^4, den er uegnet som en universel target ID metode af flere grunde. For det første skal målproteinet bevare sin native konformation ved cellelyse, for at bevare sin evne til at binde til den lille molekyle. Dette kan være særligt problematisk for membranproteiner, som ofte undergår konformationelle ændringer efter at være blevet fjernet fra deres native miljø, eller blot aggregat og udfældes fra opløsningen. For det andet skal den lille molekyle modificeres kemisk på en sådan måde, at det kan immobiliseres på harpiksen under opretholdelsedets evne til at binde målproteinet. Dybe bindingslommer kan derfor blive utilgængelige for et lille molekyle, når den er fastgjort til harpiksen. For det tredje skal bindingsaffiniteten være tilstrækkelig høj, at interaktionen opretholdes under vasketrinene, hvilket gør identifikation af lavere affinitet interaktioner udfordrende. Fjerde, miljøforhold såsom pH, ion koncentration, eller tilstedeværelsen af ​​andre endogene molekyler kan variere rumligt inden i cellen, og til tider er forudsætninger for lægemiddel-target interaktioner. Således, at finde de korrekte betingelser til at tillade og vedligeholde bindende ydersiden af ​​cellen kan kræve en betydelig mængde af trial and error.

Fotoaffinitetsmærkning omgår disse problemer ved at tillade kovalent binding af et lille molekyle og dets mål inden den native forbindelse med en celle. Snarere end at immobilisere det lille molekyle til en stor voluminøs harpiks, er molekylet i stedet kemisk modificeret til at installere to små funktionelle groups: en fotoaktiverbart del, der tillader kovalent tværbinding til målproteinet ved bestråling med en bestemt bølgelængde af lys, og en reportergruppe, der tillader at målproteinet blive opdaget og efterfølgende isoleret. Levende celler behandles med fotoaffinitets probe, proben binder og kovalent tværbinder til målproteinet, og proben-proteinkomplekset isoleres derefter intakt. Specificiteten af ​​proben binding til målet påvises ved at udføre en konkurrence eksperiment parallelt, hvor et overskud af stamforbindelsen anvendes til at konkurrere væk binding af proben til målproteinet.

Den design og syntese af fotoaffinitet sonder varierer meget fra den ene lille molekyle til et andet, og vil ikke blive dækket i denne protokol; har dog flere gode diskussioner om emnet blevet offentliggjort ^5-9. Den væsentligste overvejelse er, at sonden bevarer bioaktivitet af stamforbindelsen, derfor presumably binding til det samme target (s). Struktur-aktivitetsforhold (SAR) -undersøgelser skal udføres for at bestemme, hvilke dele af molekylet kan modificeres uden tab af bioaktivitet. En række forskellige kemiske grupper er blevet anvendt som fotoaktiverbare tværbindere, herunder diazirine, benzophenon, og aryl azid, som hver har fordele og ulemper ^10. Ligeledes er der flere reporter tags, der er blevet anvendt til at isolere probe-bindende proteiner. Reportergrupper kan være funktionel på egen hånd, såsom den almindeligt anvendte biotin eller fluorescerende mærker, eller kan være forstadier, der kræver yderligere funktionalisering efter fototværbindingen trin, som har den fordel at være mindre og dermed mindre tilbøjelige til at gå på kompromis bioaktivitet ^11.

I denne protokol, har vi brugt en fotoaffinitet sonde, der indeholder en diazirine fototværbinding gruppe, og en terminal alkyn til fastgørelse af en reporter gruppen gennem en Cu (I) -catalyzed azid-Alkyn Sharpless-Huisgen cycloaddition (eller klik) reaktion ^12-15. SAR studier, probe design og syntese, og resultaterne af disse undersøgelser er blevet offentliggjort andre steder ^16-18.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol blev tilpasset fra MacKinnon og Taunton ¹⁰ til brug i levende celler.

1. Fremstilling af dyrkede celler

1. Fremstille sterile 6-cm cellekulturskåle for antallet af prøver ønskede (se nedenfor).
   BEMÆRK: En skål af celler anvendes per behandling tilstand, men hvis mere protein er påkrævet 2 eller 3 retter kan fremstilles pr tilstand og kombineres efter UV-bestråling.
   1. Forbered mindst 3 retter af celler; Negativ kontrol med DMSO alene (D), kun Probe behandling (P), og probe + konkurrent (C).
   2. Eventuelt fremstilles en 4 ^th skålen som en ingen UV kontrol, der skal behandles med probe, men ikke udsat for UV-lys.
      BEMÆRK: Hvis flere konkurrerende molekyler, der skal testes, såsom forskellige analoger af det lille molekyle af interesse, fremstilling af yderligere konkurrerende plader efter behov.
2. Tilføj HEK293T celler til dyrkningsskåle i 4 ml dyrkningsmedier. Brug 3,5 millioner calen per plade.
   BEMÆRK: bør bestemmes antallet af celler for hver celletype, så celler er næsten 100% konfluente ved begyndelsen af ​​forsøget, for at opnå den maksimale proteinudbytte. For HUVEC, bruge 0,3 millioner celler pr plade. En god tilnærmelse er 1/10 af cellerne i en konfluent 15 cm skål. HEK293T celler bør dyrkes i Dulbeccos modificerede Eagles medium suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
3. Retur cellerne til kulturen inkubator (37 ° C, _5% CO2) natten over.

2. Behandling af celler og fototværbinding

1. Den næste dag, præ-alikvot følgende narkotika til 1,5 ml mikrocentrifugerør:
   1. For første behandling, tilsættes 4 pi DMSO til 2 rør og 4 pi 10 mM konkurrent (dvs. den umodificerede oprindelige forbindelse) til 1 rør.
   2. For anden behandling, tilsættes 16 ul DMSO til 1 rør og 16 pi 50 &# 181; M fotoaffinitets sonde til 2 rør.
      BEMÆRK: Den optimale koncentration kan være forskellige for forskellige prober (se diskussionen), men mellem 200-500 nM er et godt udgangspunkt (her bruger vi 200 nM). Koncentrationen af ​​kompetitor bør overstige den for proben mindst 20 gange (her anvender vi 10 uM). Slutkoncentrationen af ​​DMSO bør være lig i alle plader og bør ikke overstige 0,5% (20 pi volumen).
2. Bring cellepladerne i cellekulturen hætte og tilføje de forud alikvoteret narkotika fra trin 2.1.1 som følger: Aspirer 1 ml dyrkningsmedier, resuspendering pre-alikvoteret lægemiddel i medierne, og forsigtigt at tilsætte det tilbage til pladen dråbe klog. Tilsæt DMSO til DMSO (D) plade og proben (P) -plade, og tilsæt konkurrent til konkurrencen (C) plade. Retur pladerne til kulturen inkubator i 30 min.
3. Med lys i kultur hætte nedtonet, tilføje pre-alikvoteret sonde fra trin 2.1.2 til sonde (P) og konkurrence (C) plader og tilsætDMSO til DMSO (D) plade, som ovenfor. Retur pladerne til kulturen inkubator i 1 time.
4. Under inkubationen forberede følgende punkter; En bakke af is, der kan passe alle pladerne; iskold lysepuffer (PBS [pH 8,5] + 1x protease inhibitor cocktail [komplet EDTA-fri, fortyndet fra 50x stamopløsning fremstillet i vand] 200 pl / plade); mikrocentrifugerør mærket D, P eller C for hver af de forskellige behandlingsbetingelser, på is.
5. 15 min inden udgangen af ​​1 times inkubation, oprette UV-lampen (365 nm) i kølerum og tænde den for at varme op pæren.
6. Efter 1 times inkubering med proben, placere retter på is. Vask cellerne forsigtigt med 5 ml iskold PBS (pH 7,4) til fjernelse af overskydende probe. Re-dække cellerne med 4 ml iskold PBS.
7. Skålen anbringes af celler centreret 3 cm under UV-lampen på toppen af ​​en is pack at minimere opvarmning fra lampen. Bestråle i 3 min. Fjern fadet til bakken af ​​is og gentag for alle prøver.
8. ENfter bestråling, aspireres PBS fra cellerne, og der tilsættes 200 pi af den iskolde PBS (pH 8,5) med proteaseinhibitorer til hver plade. Frigør cellerne fra pladen under anvendelse af en gummiskraber og overføres til de præ-mærkede mikrocentrifugerør på is.
9. Tilføj SDS til en slutkoncentration på 0,4% (10 pi 10% SDS i 250 pi prøve).
   ADVARSEL: SDS pulver er farligt. Undgå indånding SDS pulver ved at bære en maske over næse og mund.
10. Lyse cellerne ved sonikering af suspensionen i 10 pulser (output 1, duty cycle 30%) og inkuberes på is i 1 min før en anden runde af 10 impulser.
11. Hvis det er nødvendigt, fjerne 2 pi suspension og kontrollere under et lysmikroskop for at sikre fuldstændig cellelyse.
12. Kog prøverne på en varmeplade indstillet til 95 ° C i 5 min for at fuldføre cellelyse og denaturere alle proteinerne.
13. Måle proteinkoncentrationen i hver prøve ved anvendelse af en spektrofotometrisk detergentforligeligt proteinanalyse, såsom the Dc proteinassayet ^19, ifølge producentens instruktioner, med et spektrofotometer indstillet til at måle absorbans ved 750 nm.
14. Normalisere proteinkoncentrationen til 2,5 mg / ml (eller hvis koncentrationer er lavere end 2,5 mg / ml, omsætter til prøven med den laveste proteinkoncentration) ved tilsætning PBS pH 8,5 + 0,4% SDS efter behov (for eksempel hvis prøverne er 5 mg / ml i 250 pi, tilsættes 250 pi PBS pH 8,5 + 0,4% SDS til opnåelse af en slutkoncentration på 2,5 mg / ml).

3. Montering af Fluorescent Tag af Click kemi for Visualisering af mærkede proteiner

1. Fjern 40 pi cellelysatet og overflytning til et nyt mikrocentrifugeglas. Hold de resterende lysater til reaktion med biotin-azid (trin 4).
2. Tilføj følgende reagenser i rækkefølge: 0,2 pi fluor-azid (1 mM stamopløsning i DMSO), 0,58 pi TCEP (100 mM lager i vand med 4 ækvivalenter NaOH tilføjet, forberedt friske), og 3,38 pi TBTA (1.7 mM stamopløsning i et 4: 1-forhold af t-butanol til DMSO). Vortex at blande.
3. Tilføj 1,14 pi _CuSO4 5H ₂ O (50 mM i vand) for at starte reaktionen. Vortex kort og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke.
4. Der tilsættes 50 pi 2x SDS-prøvebuffer for at standse reaktionen. På dette tidspunkt, at køre prøverne direkte på en SDS-PAGE-gel ²⁰ for de bedste resultater, eller opbevares ved -20 ° C natten over hvis det er nødvendigt.
5. Hvis frysning prøver, genopvarme i 5 min ved 95 ° C før de anbringes på gelen.
   BEMÆRK: Da molekylvægten af målproteinet typisk ikke kendt på nuværende tidspunkt, er det tilrådeligt at køre 2 geler med forskellige acrylamidkoncentrationer (dvs. 8% og 15%), eller en bred molekylvægtområde gradientgel (dvs. 4-15%), for at sikre fuldstændig molekylvægt dækning.
6. Når farvefronten har nået enden af ​​gelen, fortsætte med at køre gelen i yderligere 5 min for at sikre alle de overskydende unreacted fluor-azid helt har forladt gelen.
7. Fjern gelen til en beholder med Hedeselskabet ₂ O og inkuberes i 10 minutter med forsigtig omrøring, til at vaske væk al overskydende fluor-azid.
8. Gelen anbringes på en glasplade og scanne gelen under anvendelse af en Typhoon fluorescerende gel scanner ifølge producentens anvisninger.

4. Montering af biotin Tag af Click kemi for Affinity Rensning af mærkede proteiner

1. Af de resterende lysater fra trin 3.1, skal du bruge det maksimale beløb efter protein normalisering således at alle prøver er de samme volumen (for eksempel, hvis efter normalisering til 2,5 mg / ml de resulterende prøvevolumen er 500, 550, og 600 pi, bruge 500 pi af hver).
2. Pre-rydde lysaterne ved tilsætning til 50 pi høj kapacitet streptavidin agaroseperler, forvasket 2x med PBS (pH 7,4). Inkuber 1 time ved 4 ° C med rotation.
3. Pelletere perlerne ved centrifugering ved 1000 x g i 3 min. Fjern than supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør på is og kassér perlerne.
4. Fjern 1-2% af DMSO prøven til et nyt rør mærket "input". Tilføj et tilsvarende volumen af ​​2x SDS prøve buffer og opbevares ved -20 ° C.
5. Per 500 pi lysat, tilføje følgende reagenser: 1,38 pi biotin-azid (10 mM lager i DMSO), 5,5 pi TCEP, og 32,5 pi TBTA. Vortex at blande.
6. Tilføj 11 pi _CuSO4 5H ₂ O pr 500 pi lysat og vortex kortvarigt. Der inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
7. Tilsæt 4 prøvevolumener acetone afkølet til -20 ° C. Vortex prøverne og inkuberes natten over ved -80 ° C til fuldstændig udfældning af proteinerne og fjerne uomsat biotin-azid.
8. Centrifuger prøverne ved 17.000 xg i 15 min ved 4 ° C for at pelletere de udfældede proteiner.
9. Aspirere supernatanten fuldstændigt, og genopløse proteinerne ved lydbehandling i 150 pi PBS (pH 7,4) + 1% SDS.
10. Tilføj prøverne til 30 pi forvaskede høj kapacitet streptavidin agaroseperler og inkuberes 1 time ved 4 ° C med rotation.
11. Pelletere perlerne ved centrifugering ved 1000 x g i 3 min. Aspirere supernatanten indeholdende ubundne proteiner og udsmid.
12. Der tilsættes 1 ml vaskebuffer (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) til perlerne og inkuberes 5 minutter ved stuetemperatur med rotation.
13. Gentag trin 4.12 og 4.13 3 gange.
14. Aspirere vaskepufferen fuldstændigt fra perlerne, og der tilsættes 30 pi 2x SDS-prøvebuffer.
15. Der inkuberes i 5 minutter på en 95 ° C varmeblok at frigøre proteinerne fra perlerne.
16. Centrifuger perlerne i 1 min ved 13.000 xg ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøverne opbevares ved -20 ° C indtil den er klar til at køre SDS-PAGE. Hvis frysning prøver, opvarm den i 5 minutter ved 95 ° C før brug.
17. omhyggeligtpipette prøven buffer indeholdende proteiner ud af perlerne, og indlæse på SDS-PAGE ²⁰ (se vigtige overvejelser herunder). Perlerne kan gemmes til genopkogning senere, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: protein detektion med sølvfarve, opnås bedre resultater ved anvendelse af en 1 mm tyk gel. Hvis et band der skal skæres ud af sølv-farvet gel til massespektrometri (MS) analyse, forberede alle reagenser frisk fra sterile opløsninger og efterlade en tom godt i mellem prøver på gelen. For hvert bånd skåret fra proben vognbane, bør en parallel skive tages fra DMSO lane så denne baggrund proteiner kan trækkes. For validering af protein ID ved Western blot, er det vigtigt at også indlæse input prøve fra trin 4.4, når du kører SDS-PAGE-gel.
18. Følge en standardprotokol for enten sølvfarvning ²¹ eller Western blot ²² at detektere target protein (er).

Representative Results

Resultaterne vist her blev opnået med et foto-affinitet-proben af det antifungale lægemiddel itraconazol, hvis anvendelse tidligere er blevet publiceret ^16.. Disse resultater viser anvendelsen af ​​den levende celle teknik fotoaffinitetsmærkning til at identificere en større itraconazol-bindende protein som den 35 kDa membranprotein spændingsafhængige Anion kanal 1 (VDAC1).

Den ovennævnte protokol blev udført i HEK293T celler under anvendelse af itraconazol probe til photolabeling og umodificeret itraconazol som konkurrent molekyle. Efter at prøverne blev fremstillet som beskrevet, blev de underkastet SDS-PAGE for at adskille proteinerne efter molekylvægt. Molekylvægtmarkør enheder til venstre er i kilodalton (kDa). Den første bane er DMSO kontrolprøven (D), den anden bane er sonden prøve (P), og den tredje bane er konkurrencen prøve (C). Bands pharmes i det eneste DMSO lane betragtes baggrund. I analysen af ​​disse data, opmærksom på, at specifikke bindende proteiner bør være fraværende i DMSO kontrolprøven, til stede i sonden prøve og faldt i konkurrencen prøven. I dette tilfælde er den vigtigste proteinbånd påvises kun i sonden prøve var et bånd på ca. 35 kDa (figur 1 og 3), som blev identificeret ved massespektrometri som VDAC1. Identiteten af dette protein blev bekræftet i figur 5 ved Western blot under anvendelse af en specifik VDAC1 antistof. Samlet set viser disse resultater kan det konkluderes, at VDAC1 er et stort bindingsprotein af itraconazol i disse celler.

Figur 1 viser visualisering af proteiner efter mærkning med en fluorescerende tag (fra trin 3 i protokollen) Figur 3 viser visualisering af proteiner ved sølvfarvning efter mærkning med biotin-tag og pe rforming affinitetsoprensning (fra trin 4 i protokol); og Figur 5 viser valideringen af proteinet ID ved hjælp af en specifik antistof til VDAC1. Figur 2 og 4 eksemplificerer, hvad der sker, hvis visse trin i protokollen ikke er udført korrekt (noteret i figur legender).

Figur 1. Et repræsentativt fluorescens-scannet SDS-PAGE-gel (fra trin 3 i protokol) D = DMSO alene.; P = probe kun (200 nM); C = konkurrence (10 uM). Molekylvægtmarkør enheder til venstre er i kilodalton (kDa). Pilen peger på den store photolabeled protein bånd ved ca. 35 kDa, der er specifikt til stede i sonden vognbane og konkurrerede væk af overskydende oprindelige forbindelse, hvilket indikerer, at det er et specifikt bindende protein.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. En fluorescens-scannet gel. Den overskydende fluor-azid er ikke blevet helt fjernet fra gelen (trin 3.6 og 3.7), der forårsager store sorte udstrygninger skal vises i bunden af gelen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Et repræsentativt sølv-farvede SDS-PAGE-gel efter biotin pull-down (fra trin 4 i protokol). Pilen peger på det samme bånd, som blev visualiseret i figur 1, som efterfølgende blev fjernetfra gelen og underkastet MS-analyse til identifikation protein. Marker enheder til venstre er i kilodalton (kDa). Bemærk den tomme plads i-mellem hver bane, for at undgå krydskontaminering af prøver under gel lastning og band excision. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Sølvfarvning. En sølvfarvet gel med meget høj baggrundsfarvning, på grund af utilstrækkelig pre-clearing af lysaterne (trin 4.2) og / eller vask af perlerne (trin 4.13). Bemærk også den manglende mellemrum mellem banerne. Marker enheder til venstre er i kilodalton (kDa). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Western-blot af den photolabeled 35-kDa protein, der er konstateret ved MS som VDAC1 efter biotin pull-down (fra trin 4 i protokol). Signalet er til stede i sonden lane og faldt i konkurrencen lane, som i figur 1 og 3, hvilket bekræfter identiteten af proteinet som VDAC1. Det er vigtigt, at input fraktion (fra trin 4.4) køres sideløbende pull-down prøver, for at sikre, der kan detekteres antistof værker og proteinet af interesse i lysatet. En lille stigning i molekylvægt kan observeres i pull-down prøver på grund af den ekstra størrelse af kovalent bundet probe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Forskellige tilgange til at identificere målene i små molekyler kan groft inddeles i to kategorier: top-down, hvor den cellulære fænotype af lægemidlet bruges til at indsnævre sine potentielle mål baseret på deres kendte funktioner, eller bottom-up, hvor målet identificeres direkte ved kemisk eller genetisk middel ^3. Top-down eller fænotypiske undersøgelser kan identificere visse cellulære processer, der berøres af lægemidlet (fx transkription / translation / DNA-syntese, cellecyklus blok, signalvejen aktivering / inhibering, etc.), der kan ligge til grund den ultimative fænotype af det lille molekyle, som hjælper indsnævre listen over potentielle mål for proteiner involveret i disse processer. En stor ulempe ved top-down tilgang er, at den bygger på, hvad der allerede er kendt om disse processer, og derfor forudindtaget mod mål, hvis funktioner er ikke blevet karakteriseret eller ikke tidligere blevet beskrevet at være involvereti en given proces.

Bottom-up tilgang omgår dette problem ved at identificere målet direkte på en saglig måde. Dette kan opnås ved genetiske midler; for eksempel ved screening af et shRNA bibliotek for Knockdown cellelinjer, som giver resistens eller overfølsomhed over for lægemidlet, eller ved at isolere lægemiddelresistente cellelinier og anvendelse af genomisk sekventering for at bestemme, hvilke gener indeholder mutationer ^1. Disse typer af eksperimenter kan identificere centrale proteiner eller veje i forbindelse med aktiviteten af ​​lægemidlet, men ikke nødvendigvis vise sig direkte binding til den identificerede protein. Kemiske metoder, på den anden side, involverer typisk anvendelse af en kemisk probe til at binde til målproteinet direkte og tillade dens isolation og identifikation. Udformning af en probe, der bevarer sin evne til at binde til målproteinet kræver brug af SAR undersøgelser for at identificere en position på molekylet, der kan modificeres uden væsentligt tab af aktivitet. Det also kræver, at sonden kan binde dets mål enten kovalent eller med høj nok affinitet, at det kan isoleres fra andre cellulære proteiner (dvs. affinitetsoprenset), og at disse proteiner bevarer deres evne til at binde den lille molekyle uden for deres oprindelige cellulære miljø. Dette krav kan være problematisk for visse mål; for eksempel integrerede membranproteiner kræver ofte en specifik lipid miljø for at bevare deres aktive konformation, og kan blive aggregeret eller forkert orienteret for ligandbinding når cellerne lyseres. Den i dette manuskript metode undgår disse potentielle faldgruber affinitetsoprensning ved at tillade kovalent modifikation af målproteinet indenfor det native cellulære miljø, således at efterfølgende manipulationer ikke kan afbryde den lægemiddel-target interaktion ^10.

En vellykket gennemførelse af den beskrevne protokol afhænger af flere faktorer. Det er vigtigt, at tarFå protein ifølge den lille molekyle være tilstrækkeligt rigelige i celletypen udvalgt til photolabeling. Celletypen mest kraftigt påvirket af den lille molekyle kan være et godt udgangspunkt sted, men det kan være nødvendigt at teste flere forskellige celletyper for at finde én med høj målprotein udbytter. Alternativt kan berigelse af forskellige protein befolkninger ved subcellulær fraktionering øge målet udbyttet mens faldende mærkning baggrund. Detektion af fluorescens-mærkede proteiner er generelt meget mere følsomme end protein detektering ved sølvfarvning; derfor kan bands detekteret ved fluorescens ikke være påviseligt ved sølvfarvning efter biotin pull-down. Opskalering eksperimentet ved hjælp af flere retter af celler pr behandlingsbetingelse kan bidrage til at overvinde dette påvisning problem. Forøgelse af koncentrationen af ​​probe kan også bidrage til at forbedre pull-down udbytter. Specifikke bånd kan også skjules af høj baggrund, i hvilket tilfælde strengere vask, flere præ-clearing trin eller anvendelse af perler af en anden sammensætning (såsom magnetiske perler i stedet for agarose) kan være nyttige. Men hvis målproteinet er for lav i overflod kan det ikke være muligt at påvise ved sølvfarvning. Desuden, hvis målproteinet ikke migrerer som et skarpt bånd på SDS-PAGE (såsom stærkt glycosylerede proteiner), vil det også være vanskeligere at visualisere. Yderligere ændringer af protokollen kunne gøres for at overvinde disse problemer, såsom at udføre hel-sample proteomics eller SILAC (stabile isotoper Mærkning af aminosyrer i celle kultur) for at identificere mærkede proteiner efter pull-down, hvilket eliminerer behovet for at skære et band ud af en sølvfarvet gel.

En anden vigtig overvejelse er koncentrationen af ​​sonden, der skal anvendes i eksperimentet. Ideelt set bør den laveste mængde probe, der frembringer et påviseligt signal anvendes. Højere koncentrationer vil give højere signal, men også højere mærkning baggrund, og når alle of bindingsstederne på det højeste mål affinitet bliver mættet, kan der være yderligere lavere affinitet mål, som begynder at blive detekteret. Den optimale koncentration bør derfor bestemmes empirisk ved at starte med en relativt høj koncentration (1-2 uM) og titrering tilbage indtil kun en eller to proteiner er mærket og konkurrencen er indlysende.

Styrken af ​​sonden kan tages i betragtning ved valg af startkoncentrationen; dog afhængigt af målet overflod og tilstanden af ​​inhibering, kan der ikke være en god korrelation mellem proben aktivitet og måldetektering (fx en probe med lav nanomolær inhibering vil ikke nødvendigvis trække ned nok protein ved lave koncentrationer nanomolære er detekterbar ). Det er således foretrukket at bestemme den mest passende koncentration empirisk under anvendelse påvisning af mærkede proteiner som en udlæsning. Koncentrationen af ​​konkurrent anvendes, bør overstige den probe ved påmindst 20 gange, men man bør også tages ikke at overskride opløselighedsgrænsen for konkurrenten.

I tilfælde af at flere proteiner trækkes ned af sonden, identifikation af funktionelt relevante protein bliver mere kompliceret. Men der er flere måder at hjælpe med at indsnævre de potentielle målproteiner. Som nævnt ovenfor kan titrere tilbage sonden koncentrationen bidrage til at forbedre specificiteten af ​​mærkning. Efterhånden som koncentrationen af ​​probe dråber, bør højere affinitetsbinding proteiner bevarer deres signalintensitet mens lavere affinitet proteiner skulle forsvinde. Udfoldning af flere potentielle mål kan også hjælpes ved anvendelse af kemiske analoger af moderforbindelsen med varierende grader af aktivitet. I teorien for en funktionelt relevant mål, der bør være en korrelation mellem binding til målet og aktiviteten af ​​analogen. For eksempel kan konkurrence ved inaktive analoger af den oprindelige forbindelse bruges til at udelukke bindende proteins, der ikke er involveret i de fænotypiske virkninger af forbindelsen. Ligeledes aktive analoger eller andre små molekyler, der inducerer den samme fænotype som stamforbindelsen, kan bruges til at hjælpe regel i relevante proteiner. På samme måde, kan brug af en inaktiv eller strukturelt ubeslægtet fotoaffinitet sonde hjælpe udelukke irrelevante proteiner.

Validering af målproteinet kræver første verifikation af proteinet identificeres ved MS. Dette kan let opnås ved western blot efter biotin pull-down, antagelse af en høj kvalitet antistof til målproteinet er til rådighed. Men når man arbejder med et ukendt protein er det let at spilde en betydelig mængde tid og penge på dårlige antistoffer. Det er derfor afgørende, at antistoffet valideres, og at den detekterer et bestemt frekvensbånd i lysatet af cellerne, der anvendes til mærkning (dvs. input prøven). Hertil kommer, fordi proteinet udbytte efter pull-down kan være lav, myreniBody må være meget følsomme, og afhængigt af antistoffet kan være nødvendigt høje koncentrationer (op til 1: 100 fortynding i nogle tilfælde). For at undgå disse problemer, kan et tagget version af proteinet udtrykkes i cellerne før photolabeling, og mærket kan derefter anvendes til at detektere proteinet efter pull-down.

Når proteinet ID bekræftes, kan funktionel validering af målet opnås ved genetiske og / eller farmakologiske manipulationer eller funktionelle assays af målet af interesse, for at vise, at aktiviteten af ​​målet påvirkes af lille molekyle-binding. Bindingsstedet kan kortlægges ved at identificere aminosyren modificeret af proben, eller bestemmelse af 3-dimensionelle struktur af det bundne lille molekyle ved røntgenkrystallografi eller NMR-spektroskopi. Ideelt set, hvis en mutant kan findes, som mister sin evne til at binde den lille molekyle, bør det være i stand til at ophæve virkningen af ​​den lille molekyle når det udtrykkes i stedet for vildtype-proTEIN. Det kan også være ønskeligt at vise specificiteten af ​​binding til målet i forhold til andre strukturelt beslægtede eller "off-target" proteiner.

Denne generelle protokol kan bruges i enhver anvendelse, som kræver direkte måling af lille molekyle-binding til et protein target, så længe som en probe kan fremstilles som bevarer bioaktiviteten af ​​stamforbindelsen. Potentielle anvendelser indbefatter, men er ikke begrænset til, identificere molekylære mål af nye forbindelser, landmåling potentiale off-mål af eksisterende lægemidler, hvilket bekræfter direkte binding af et lille molekyle til et særligt protein af interesse, bestemme konkurrence af binding af andre små molekyler ved det samme bindingssted på et protein, og opdager nye receptorer af naturligt afledte eller endogene ligander.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp	Spectroline	FC100	UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free	Roche Life Science	11873580001	Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Set to output 1, duty 30%.
Fluorescent gel scanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualified	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin solution	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676