Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Introduction

Bioactieve kleine moleculen fundamenteel werkt door interactie met de functie van één of meer "target" moleculen, meestal proteïnen veranderen, in de cel. In drug discovery, wanneer een werkzame verbinding wordt ontdekt door fenotypische screening, identificatie van de moleculaire target (s) van die verbinding is essentieel, niet alleen voor het begrijpen van het werkingsmechanisme en de mogelijke bijwerkingen van de verbinding, maar ook potentieel ontdekken nieuwe biologie ten grondslag liggen aan de ziekte model en de weg effenen voor de ontwikkeling van nieuwe mechanistische klasse van therapeutische middelen ^1. Hoewel target identificatie is niet vereist voor een geneesmiddel om therapeutisch worden gebruikt, in de afgelopen jaren is er een toenemende erkenning dat nieuwe kandidaat-geneesmiddelen hebben meer kans om te slagen in klinische studies, en dus geven een beter rendement op de investering, als een gevalideerde doelwit is bekend ^2. Er is dus een groeiende interesse in werkwijzen voor het identificeren van kleine geweestmolecule doeleiwitten.

Een klassieke doel identificatieexperiment vertrouwt typisch op affiniteitszuivering, waarbij het ​​kleine molecuul van belang wordt geïmmobiliseerd op een hars en geïncubeerd met lysaten van gehele cellen, waarna ongebonden eiwitten weg gewassen en de resterende eiwitten worden geëlueerd en geïdentificeerd ^3. Hoewel deze techniek is gebruikt om de doelstellingen van vele kleine moleculen identificeren ^4, is ongeschikt als een universele prisma ID methode om verschillende redenen. Ten eerste moet het doeleiwit de natieve conformatie na cellyse om zijn vermogen te binden aan de kleine molecule behouden blijven. Dit kan bijzonder problematisch voor membraaneiwitten, die vaak conformatieveranderingen ondergaan na hun natieve omgeving verwijderd of gewoon aggregaat en neerslaan uit oplossing. Ten tweede moet het kleine molecuul chemisch worden gemodificeerd zodanig dat deze kan worden geïmmobiliseerd op de hars behoudhet vermogen om het doeleiwit binden. Diepe bindingsholtes kan dus niet toegankelijk voor een klein molecuul zodra het is bevestigd aan de hars. Ten derde moet de bindingsaffiniteit voldoende hoog zijn dat de interactie wordt gehandhaafd tijdens de wasstappen, waardoor identificatie van lagere affiniteit interacties uitdaging. Ten vierde, omgevingsfactoren zoals pH, ionconcentratie of de aanwezigheid van andere endogene moleculen ruimtelijk variëren binnen de cel en soms voorwaarden geneesmiddelresistente targetinteracties. Aldus vinden van de juiste voorwaarden te scheppen en handhaven binding buiten de cel kan een aanzienlijke hoeveelheid trial and error vereist.

Fotoaffiniteitslabeling omzeilt deze problemen doordat de covalente binding van een klein molecuul en het doel binnen de context van een natieve cel. In plaats van het immobiliseren van het kleine molecuul een grote volumineuze hars, wordt het molecuul in plaats chemisch gemodificeerd om twee kleine functionele g installerenroups: een fotoactiveerbare groep die covalente verknoping mogelijk maakt om het doeleiwit bij bestraling met een bepaalde golflengte van licht, en een reporter groep waarmee het doeleiwit te detecteren en vervolgens geïsoleerd. Levende cellen worden behandeld met de affiniteit probe bindt de probe en covalent verknoopt aan het doeleiwit en het probe-eiwitcomplex wordt vervolgens geïsoleerd intact. De specificiteit van de probe binden aan het doelwit wordt aangetoond door het uitvoeren van een competitie experiment in parallel, waarbij een overmaat van de moederverbinding wordt gebruikt om te concurreren weg binding van de probe aan het doelwit eiwit.

Het ontwerp en de synthese van affiniteit probes varieert sterk van de ene klein molecuul naar de andere, en zal niet worden behandeld in dit protocol; hebben echter een aantal uitstekende discussies over het onderwerp gepubliceerd ^5-9. De belangrijkste overweging is dat de sonde blijft de biologische activiteit van de moederverbinding derhalve presumably binding aan hetzelfde doel (en). Structuur-activiteitsrelaties (SAR) studies moeten worden uitgevoerd om te bepalen welke delen van het molecuul kan worden gewijzigd zonder verlies van bioactiviteit. Een verscheidenheid van verschillende chemische groepen zijn gebruikt als fotoactiveerbare crosslinkers, zoals diazirine, benzofenon, azide en aryl, die elk voor- en nadelen ^10. Ook zijn er meerdere reporter labels die zijn gebruikt om probe bindende eiwitten te isoleren. Reportergroepen kunnen functioneel op zichzelf, zoals de algemeen gebruikte biotine of fluorescente labels, of kan precursors dat verdere functionalisering na de fotoverknoping stap, die het voordeel dat kleinere en dus minder gemakkelijk bioactiviteit ¹¹ compromis vereisen.

In dit protocol, hebben we een affiniteit probe die een diazirine fotoverknoping groep, en een terminale alkyn voor de bevestiging van een reporter-groep door een Cu (I) gebruikte -catalyzed azide-Acetyleenalkoholen Sharpless-Huisgen cycloadditie (of klik) reactie ^12-15. De SAR studies probe ontwerp en synthese, en de resultaten van deze onderzoeken zijn elders gepubliceerd ^16-18.

Protocol

LET OP: Dit protocol werd aangepast van MacKinnon en Taunton ¹⁰ voor gebruik in levende cellen.

1. Bereiding van gekweekte cellen

1. Bereid steriele 6-cm celcultuurschalen het gewenste aantal monsters (zie hieronder).
   LET OP: Een gerecht van de cellen wordt gebruikt per behandeling staat, maar als er meer eiwit nodig is 2 of 3 gerechten worden bereid per staat en gecombineerd na UV straling.
   1. Maak minstens 3 gerechten van de cellen; Negatieve controle met alleen DMSO (D), alleen Probe behandeling (P), en probe concurrent + (C).
   2. Eventueel stelt een 4 ^th schotel als geen UV controle, worden behandeld met probe maar niet blootgesteld aan UV-licht.
      Opmerking: Als er meerdere concurrerende moleculen worden getest, zoals verschillende analogen van het kleine molecuul van belang, bereiden extra concurrent Platen eventueel.
2. Voeg HEK293T cellen aan de cultuur gerechten in 4 ml kweekmedium. Gebruik 3,5 miljoen cells per plaat.
   Opmerking: Het aantal cellen moet worden bepaald voor elk celtype zodat cellen bijna 100% confluent bij het begin van het experiment, om het maximale rendement te bereiken eiwit. Voor HUVEC, gebruiken 0,3 miljoen cellen per plaat. Een goede benadering is 1/10 van de cellen in een confluente 15 cm schaal. HEK293T cellen worden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine.
3. Zet de cellen aan de incubator (37 ° C, _5% CO2) gedurende de nacht.

2. Behandeling van cellen en fotoverknopende

1. De volgende dag, pre-fractie de volgende geneesmiddelen in 1,5 ml microcentrifugebuizen:
   1. Voor de eerste behandeling wordt 4 pl DMSO 2 buizen en 4 ui 10 mM concurrent (dwz de ongemodificeerde moederstof) tot 1 tube.
   2. Voor de tweede behandeling, voeg 16 ul van DMSO tot 1 tube en 16 ul van 50 &# 181; M affiniteit sonde 2 tubes.
      LET OP: De optimale concentratie kan verschillend zijn voor verschillende probes (zie bespreking), maar tussen de 200-500 nm is een goed uitgangspunt (hier gebruiken we 200 nm). De concentratie van competitief hoger zijn dan dat van de probe ten minste 20 maal (hier gebruiken we 10 uM). De eindconcentratie van DMSO moet gelijk in platen bevinden en niet meer dan 0,5% (20 pi volume).
2. Breng de celplaten in de celkweek kap en voeg de pre-porties drugs uit stap 2.1.1 als volgt: Zuig 1 ml kweekmedia resuspenderen de pre-gealiquoteerde geneesmiddel in de media, en voeg dan voorzichtig terug naar de plaat druppel wijs. Voeg de DMSO aan de DMSO (D) bord en de sonde (P) plaat, en voeg de concurrent van de competitie (C) plaat. Zet de platen naar de incubator gedurende 30 minuten.
3. Met verlichting in de cultuur kap gedimd, voeg de pre-gealiquoteerde probe uit stap 2.1.2 tot sonde (P) en de concurrentie (C) borden en voeg deDMSO aan de DMSO (D) plaat, zoals hierboven. Zet de platen naar de incubator gedurende 1 uur.
4. Tijdens de incubatie, bereid de volgende artikelen; Een dienblad van ijs dat alle platen past; ijskoude lysisbuffer (PBS [pH 8,5] + 1x proteaseremmer cocktail [compleet EDTA-vrij, verdund van 50x voorraad-oplossing in water], 200 pl / plaat); microcentrifugebuizen gelabeld D, P of C voor elk van de verschillende behandelingsomstandigheden, op ijs.
5. 15 minuten voor het einde van de 1 uur incubatie, instellen van de UV-lamp (365 nm) in de koude kamer en zet hem op te warmen de lamp.
6. Na 1 uur incubatie met de sonde, plaatst gerechten op het ijs. Was de cellen voorzichtig met 5 ml ijskoude PBS (pH 7,4) om overmaat probe te verwijderen. Opnieuw omvatten de cellen met 4 ml ijskoude PBS.
7. Zet de schaal van cellen gecentreerd 3 cm onder de UV lamp bovenop een ijslaag verwarming van de lamp te minimaliseren. Bestralen gedurende 3 min. Verwijder de schotel naar de tray ijs en herhaal voor alle monsters.
8. EENN a bestraling zuig het PBS uit de cellen en voeg 200 ul van ijskoude PBS (pH 8,5) met proteaseremmers aan elke plaat. Maak de cellen van de plaat met een rubberen schraper en overdracht naar de gelabelde microcentrifugebuizen op ijs.
9. Voeg SDS tot een eindconcentratie van 0,4% (10 pl 10% SDS in 250 pl monster).
   LET OP: SDS poeder is gevaarlijk. Vermijd het inademen van SDS poeder door het dragen van een masker over de neus en mond.
10. Lyseren de cellen door sonicatie de suspensie gedurende 10 pulsen (output 1, duty cycle 30%) en incubeer op ijs gedurende 1 min voor een tweede ronde van 10 pulsen.
11. Indien nodig, verwijder 2 pl ophanging en laat onder een lichtmicroscoop te zorgen voor volledige cellysis.
12. Kook de monsters op een hete plaat die op 95 ° C gedurende 5 minuten om cellysis te voltooien en denatureren de eiwitten.
13. Meet de eiwitconcentratie in elk monster onder toepassing van een spectrofotometrische detergent compatibel eiwit assay, zoals the Dc eiwitassay ^19, volgens de instructies van de fabrikant, met een spectrofotometer ingesteld op absorptie gemeten bij 750 nm.
14. Normaliseren van de proteïne concentratie 2,5 mg / ml (of als concentraties lager dan 2,5 mg / ml, normaliseert het monster met de laagste eiwitconcentratie) door toevoeging van PBS pH 8,5 + 0,4% SDS als nodig is (bijvoorbeeld als monsters 5 mg / ml in 250 pl, voeg 250 pl PBS pH 8,5 + 0,4% SDS tot een eindconcentratie van 2,5 mg / ml te verkrijgen).

3. Bevestiging van Fluorescent Tag per Klik Chemie voor Visualisatie van gelabelde eiwitten

1. Verwijder 40 pi van het cellysaat overgebracht in een nieuwe microcentrifugebuis. Houd de resterende lysaten voor reactie met azide-biotine (stap 4).
2. Voeg de volgende reagentia in deze volgorde: 0,2 ul fluor-azide (1 mM voorraad oplossing in DMSO), 0,58 pl TCEP (100 mM voorraad in water met 4 equivalenten NaOH toegevoegd, vers bereid), en 3,38 ul TBTA (1.7 mM voorraad in een 4: 1 verhouding van t-butanol DMSO). Vortex te mengen.
3. Voeg 1,14 ul _CuSO4 5H ₂ O (50 mM in water) om de reactie te starten. Kort vortexen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.
4. Voeg 50 ul 2x SDS-monsterbuffer om de reactie te blussen. Op dit moment lopen de monsters direct op een SDS-PAGE gel ²⁰ voor de beste resultaten, of op te slaan bij -20 ° C gedurende de nacht indien nodig.
5. Vries bij monsters, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C vóór het laden op de gel.
   OPMERKING: Aangezien het moleculair gewicht van het doeleiwit typisch niet in dit stadium bekend is, is het raadzaam om 2 gels met verschillende acrylamide concentraties zijn (ie 8% en 15%), of een brede moleculair gewichtsbereik gradiënt gel (dat wil zeggen, 4-15%), om volledige dekking gewicht moleculair waarborgen.
6. Als de kleurstof voor het einde van de gel bereikt, blijven draaien de gel gedurende nog 5 min om alle overmaat unreacte waarborgend fluor-azide volledig verlaten de gel.
7. Verwijder de gel een container met DDH ₂ O en incubeer gedurende 10 minuten onder zacht schudden om alle overtollige fluor-azide wegspoelen.
8. Plaats de gel op een glasplaat en scan het onder gebruikmaking van een Typhoon fluorescerende gel scanner volgens de instructies van de fabrikant.

4. Bevestiging van biotine Tag per Klik Chemie voor Affiniteit Zuivering van gelabelde eiwitten

1. Van de overige lysaten van stap 3,1, is de maximale na-eiwit normalisatie zodanig dat alle monsters hetzelfde volume (bijvoorbeeld als na normalisatie naar 2,5 mg / ml verkregen monster volumes 500, 550, en 600 pl, gebruiken 500 pl elk).
2. Vooraf duidelijk de lysaten door aan 50 gl hoge capaciteit streptavidine agarose kralen, voorgewassen 2x met PBS (pH 7,4). Incubeer 1 uur bij 4 ° C met rotatie.
3. Pellet de kralen door centrifugering bij 1000 g gedurende 3 minuten. Verwijder thij supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis op ijs en gooi de kralen.
4. Verwijder 1-2% van de DMSO monster naar een nieuwe buis label "input". Voeg een gelijk volume 2 x SDS-monsterbuffer en bewaar bij -20 ° C.
5. Per 500 pi van lysaat, voeg de volgende reagentia: 1,38 ul biotine-azide (10 mM voorraad in DMSO), 5,5 pi TCEP, en 32,5 pl TBTA. Vortex te mengen.
6. Voeg 11 ul _CuSO4 5H ₂ O per 500 ul lysaat en vortex kort. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
7. Voeg 4 monstervolumes aceton gekoeld tot -20 ° C. Vortex de monsters en incubeer overnacht bij -80 ° C volledig precipiteren eiwitten en verwijder ongereageerd biotine-azide.
8. Centrifugeer de monsters bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C om het geprecipiteerde eiwitten pelleteren.
9. Zuig het supernatant volledig en resolubilize de eiwitten door sonicatie in 150 ul PBS (pH 7,4) + 1% SDS.
10. Voeg de monsters 30 gl voorgewassen hoge capaciteit streptavidine agarose kralen en incubeer 1 uur bij 4 ° C met rotatie.
11. Pellet de kralen door centrifugering bij 1000 g gedurende 3 minuten. Zuig het supernatant die niet gebonden eiwitten en teruggooi.
12. Voeg 1 ml wasbuffer (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) aan de korrels en incubeer 5 min bij kamertemperatuur met rotatie.
13. Herhaal stap 4.12 en 4.13 3 keer.
14. Zuig het wasbuffer geheel van de bolletjes en voeg 30 ul 2x SDS-monsterbuffer.
15. Incubeer gedurende 5 min op 95 ° C hitteblok de eiwitten los van de bolletjes.
16. Centrifugeer de kralen voor 1 min bij 13.000 xg bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Op dit punt, kunnen de monsters worden bewaard bij -20 ° C tot gebruik SDS-PAGE gerund. Vries bij monsters, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C vóór gebruik.
17. Voorzichtigpipet het monster buffer bevattende eiwitten af van de kralen en laden op SDS-PAGE ²⁰ (zie hieronder belangrijke overwegingen). De korrels kunnen worden opgeslagen voor latere opkoken indien nodig.
    OPMERKING: eiwit detectie door zilverkleuring, worden betere resultaten verkregen met een 1 mm dikke gel. Indien een band buiten de zilver gekleurde gel voor massa-analyse spectrometrie (MS) te snijden, bereiden alle reagentia vers uit steriele oplossingen en laat een lege put tussen monsters op de gel. Voor elke band gesneden uit de sonde baan moet een parallelle segment worden uit de DMSO baan zodat achtergrond eiwitten kunnen worden afgetrokken. Voor de validatie van eiwit-ID van western blot, is het essentieel om de input monster uit stap 4.4 ook laden wanneer het uitvoeren van de SDS-PAGE gel.
18. Volg een standaardprotocol voor zowel ²¹ zilverkleuring of Western blot ²² aan het doeleiwit (s) te detecteren.

Representative Results

De hier getoonde resultaten werden verkregen met een foto-affiniteit probe van het antimycoticum itraconazol, waarvan het gebruik is eerder gepubliceerd ^16. Deze resultaten demonstreren het gebruik van de foto-affiniteit labeling techniek levende cellen een belangrijke itraconazol-bindend eiwit als het 35 kDa-membraaneiwit spanningsafhankelijke anion kanaal 1 (VDAC1) met succes te identificeren.

Het bovenstaande protocol werd uitgevoerd in HEK293T-cellen met de probe voor itraconazol fotomarkering en ongemodificeerde itraconazol als concurrent molecuul. Nadat de monsters werden bereid zoals beschreven, werden ze onderworpen aan SDS-PAGE om de eiwitten te scheiden molecuulgewicht. Molecuulgewichtmerker eenheden op de linkerkant zijn in kilodalton (kDa). De eerste baan is de DMSO controle monster (D), de tweede rijstrook is de sonde monster (P), en de derde rijstrook is de competitie monster (C). bands phekel aan in de enige DMSO rijstrook worden beschouwd als achtergrond. De analyse van deze gegevens erop dat specifieke bindingseiwitten afwezig moeten in het controlemonster DMSO, aanwezig in het monster probe en verlaagd in het vergelijkend monster. In dit geval, de belangrijkste eiwitband alleen gedetecteerd in de probe monster was een band van ongeveer 35 kDa (Figuren 1 en 3), die werd geïdentificeerd door massaspectrometrie als VDAC1. De identiteit van dit eiwit werd bevestigd in figuur 5 door Western blot onder toepassing van een specifiek antilichaam VDAC1. Samengevat, deze resultaten kunnen we concluderen dat VDAC1 een belangrijke bindingsproteïne van itraconazol in deze cellen.

Figuur 1 toont de visualisatie van eiwitten na labelen met een fluorescerend label (van stap 3 in protocol); Figuur 3 toont de visualisatie van eiwitten door zilverkleuring na labeling met biotine-tag en pe rforming affiniteitszuivering (uit stap 4 in het protocol); en Figuur 5 toont de validatie van de eiwit-ID met behulp van een specifiek antilichaam voor VDAC1. figuren 2 en 4 zijn voorbeelden van wat er gebeurt als bepaalde stappen in het protocol niet correct worden uitgevoerd (opgemerkt in figuur legenden).

Figuur 1. Een representatieve fluorescentie gescand SDS-PAGE gel (van stap 3 in protocol) D = DMSO alleen.; P = probe alleen (200 nM); C = concurrentie (10 pm). Molecuulgewichtmerker eenheden op de linkerkant zijn in kilodalton (kDa). De pijl wijst naar de grote photolabeled eiwit band bij ongeveer 35 kDa dat specifiek aanwezig in de sonde rijstrook en wordt verwijderd door een teveel ouderlijke verbinding concurreerden, wat aangeeft dat het om een ​​specifiek bindend eiwit.529 / 54529fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Een fluorescentie gescand gel. De overmaat fluor-azide niet volledig verwijderd uit de gel (stappen 3,6 en 3,7), waardoor grote zwarte vlekken verschijnen onder in de gel. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Figuur 3. Een vertegenwoordiger zilver gekleurde SDS-PAGE gel na biotine pull-down (uit stap 4 in protocol). De pijl wijst naar dezelfde band die werd gevisualiseerd in figuur 1, waarbij werd vervolgens uitgesnedenuit de gel en onderworpen aan MS analyse voor proteïne-identificatie. Marker eenheden op de linkerkant zijn in kilodalton (kDa). Let op de lege ruimte in-tussen elke baan, met het oog op kruisbesmetting van de monsters tijdens de gel het laden en band uitsnijding te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Silver kleuring. Een zilver gekleurde gel met een zeer hoge achtergrondkleuring, vanwege onvoldoende pre-vrijgave van de lysaten (stap 4.2) en / of wassen van de bolletjes (stap 4.13). Let ook op het gebrek aan ruimte tussen de rijstroken. Marker eenheden op de linkerkant zijn in kilodalton (kDa). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Western blot van de photolabeled 35-kDa eiwit, die door MS als VDAC1 na biotine pull-down (uit stap 4 in protocol). Het signaal is aanwezig in de probe baan en verminderd in de competitie baan, zoals in figuren 1 en 3 bevestigt de identiteit van het eiwit als VDAC1. Het is belangrijk dat de inputfractie (uit stap 4.4) wordt uitgevoerd langs de pull-down monsters, zodat het antilichaam werkt en het eiwit van belang kan worden gedetecteerd in het lysaat. Een lichte stijging van het molecuulgewicht kan worden waargenomen in de pull-down monsters door de toegevoegde grootte van de covalent gebonden probe. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Verschillende benaderingen voor het identificeren van de doelen van kleine moleculen kunnen grofweg in twee categorieën: bovenaf, waarbij het cellulaire fenotype van het geneesmiddel wordt gebruikt om een ​​beperking van de potentiële doelen gebaseerd op hun bekende functies of bottom-up, waarbij het doelwit direct geïdentificeerd door chemische of genetische middelen ^3. Top-down of fenotypische studies kan bepaalde cellulaire processen beïnvloed door het geneesmiddel te identificeren (bijvoorbeeld, transcriptie / translatie / DNA-synthese, celcyclus blokkeren, signaleringsroute activatie / inhibitie, etc.) dat de uiteindelijke fenotype van het kleine molecuul kan ten grondslag liggen, die helpt een beperking van de lijst van mogelijke doelwitten voor eiwitten die betrokken zijn bij deze processen. Echter, een belangrijk nadeel van de top-down benadering is doordat het op wat reeds bekend is over deze processen en daarom voorgespannen tegen doelen waarvan de functies niet gekarakteriseerd of niet eerder beschreven betrokkenin een bepaald proces.

De bottom-up benadering omzeilt dit probleem door het identificeren van de doelgroep direct op onpartijdige wijze. Dit kan worden bewerkstelligd door genetische middelen; bijvoorbeeld door het screenen van een shRNA library voor knockdown cellijnen die resistentie verlenen of overgevoeligheid voor het geneesmiddel of door het isoleren resistente cellijnen en via genoom sequentie te bepalen welke genen bevatten mutaties ^1. Dit soort experimenten kunnen belangrijke eiwitten of trajecten met betrekking tot de activiteit van het geneesmiddel te identificeren, maar niet noodzakelijk blijken directe binding aan de geïdentificeerde eiwitten. Chemische benaderingen, anderzijds, gewoonlijk gepaard met het gebruik van een chemische probe direct naar doeleiwit binden en laten de isolatie en identificatie. Het ontwerpen van een sonde die het vermogen ervan te binden aan het doeleiwit behoudt vereist het gebruik van SAR studies naar een positie te identificeren op het molecuul dat zonder significant verlies van activiteit kan worden gewijzigd. Het ALSo vereist dat de sonde kunnen de doelwit ofwel covalent of met voldoende hoge affiniteit dat kan worden geïsoleerd uit andere cellulaire eiwitten (dat wil zeggen, affiniteit gezuiverde) binden, en dat deze eiwitten behouden hun vermogen om de kleine molecule buiten hun natieve binden cellulaire omgeving. Deze eis kan problematisch zijn voor bepaalde doelen zijn; bijvoorbeeld, integrale membraaneiwitten vereisen vaak een specifieke lipide omgeving van hun actieve conformatie behouden en kunnen geaggregeerde of onjuist georiënteerd voor ligandbinding wanneer cellen worden gelyseerd worden. De werkwijze in dit manuscript beschreven vermijdt deze valkuilen van affiniteitszuivering doordat de covalente modificatie van het doeleiwit in de natieve cellulaire omgeving, zodat latere manipulaties geneesmiddel-target interactie ¹⁰ niet kan onderbreken.

Succesvolle implementatie van het beschreven protocol hangt af van verschillende factoren. Het is belangrijk dat de tarGebruik eiwit van de kleine moleculen voldoende overvloedig in het celtype gekozen fotomarkering. Het celtype meest krachtig belemmerd door de kleine molecuul kan een goede startplaats, maar kan het nodig zijn meerdere verschillende celtypes testen om een ​​hoge opbrengst doeleiwit vinden. Als alternatief kan de verrijking van verschillende eiwitten bevolkingsgroepen door subcellulaire fractionering het doel de opbrengst te verhogen terwijl het verminderen van achtergrond labeling. Detectie van fluorescent gelabelde eiwitten in het algemeen veel gevoeliger dan eiwit detectie door zilverkleuring; daarom kan bands gedetecteerd door fluorescentie niet waarneembaar door zilverkleuring na de biotine pull-down zijn. Het opschalen van het experiment met behulp van meerdere gerechten van cellen per behandeling conditie kan helpen om deze detectie probleem op te lossen. Het verhogen van de concentratie van probe kan ook helpen om pull-down opbrengsten te verbeteren. Specifieke banden kunnen ook worden gestoord door hoge achtergrond, waarbij strengere wassen, verschillende pre-clearing stappen of het gebruik van korrels van een andere samenstelling (bijvoorbeeld magnetische korrels in plaats van agarose) van nut zijn. Indien het doeleiwit te laag in overvloed kan het niet mogelijk zijn om te detecteren door zilverkleuring. Bovendien, als het doelwit eiwit niet als een scherpe band op SDS-PAGE heeft migreren (zoals zwaar geglycosyleerde eiwitten) zal het ook moeilijker te visualiseren zijn. Verdere wijziging van het protocol kan worden gedaan om deze problemen, zoals het uitvoeren hele monster proteomics of SILAC (stabiele isotopen van aminozuren in celculturen) te overwinnen om gemerkte eiwitten te identificeren na pull-down, waardoor de noodzaak om een ​​band uitgesneden een zilver gekleurde gel.

Een andere belangrijke overweging is de concentratie van de probe worden gebruikt in het experiment. Idealiter zou de laagste hoeveelheid probe die een detecteerbaar signaal produceert worden gebruikt. Hogere concentraties hoger signaal, maar ook hoger achtergrond etikettering, en een keer alles te geven of de binding sites op het hoogste doel affiniteit verzadigd raken er mogelijk extra lagere affiniteit targets die beginnen te detecteren. De optimale concentratie derhalve empirisch worden bepaald door te beginnen met een relatief hoge concentratie (1-2 uM) en titratie terug tot slechts één of twee eiwitten worden gemerkt en de concurrentie is duidelijk.

De sterkte van de probe kan rekening worden gehouden bij het kiezen van de uitgangsconcentratie; Afhankelijk van de beoogde omvang en de wijze van remming, kan er geen goede correlatie tussen de probe activiteit en target detectie (bijvoorbeeld een probe met lage nanomolaire remming niet noodzakelijkerwijs afbreken voldoende eiwitten bij lage nanomolaire concentraties detecteerbaar zijn ). Aldus heeft het de voorkeur de meest geschikte concentratie empirisch middels detectie van gelabelde eiwitten als uitlezing bepalen. De concentratie van de concurrent die hoger zijn dan dat van de probe tentenminste 20-voudig, maar zorg moet worden genomen de oplosbaarheidsgrens van de deelnemer niet te overschrijden.

In het geval dat meerdere eiwitten door de sonde worden getrokken, identificatie van het functioneel relevante proteïne wordt ingewikkelder. Echter, er zijn verschillende manieren om te helpen een beperking van de potentieel doelwit eiwitten. Zoals hierboven vermeld, titreren terug de probe concentratie Om tot betere specificiteit etikettering. Als de concentratie van probe druppels moeten hogere affiniteit bindende eiwitten hun signaalintensiteit behouden terwijl lagere affiniteit eiwitten verdwijnen. Deconvolutie van meerdere potentiële doelwitten kan ook worden geholpen door het gebruik van chemische analogen van de moederverbinding met een verschillende mate van activiteit. In theorie, een functioneel relevant doel, moet er een correlatie tussen binding aan het doelwit en de activiteit van de analoog zijn. Bijvoorbeeld, kan de concurrentie door inactieve analogen van de oorspronkelijke verbinding worden gebruikt om uit te sluiten bindende proteins die niet betrokken zijn bij de fenotypische effecten van de verbinding. Evenzo actieve analogen of andere kleine moleculen die hetzelfde fenotype te induceren als de oorspronkelijke verbinding, kan worden gebruikt voor regeling van relevante bindende eiwitten helpen. In dezelfde lijn, kunnen gebruik maken van een inactieve of structureel niet-verwante affiniteit sonde helpen uitsluiten irrelevante eiwitten.

Validatie van het doeleiwit vereist eerste controle van de proteïne die door MS. Dit kan eenvoudig worden bereikt door western blot na biotine pull-down, uitgaande van een hoge kwaliteit antilichaam voor het doeleiwit beschikbaar. Echter, bij het werken met een onbekend eiwit is het gemakkelijk om veel tijd en geld op slechte antilichamen. Het is daarom van groot belang dat het antilichaam worden bevestigd en dat het een specifieke band in het lysaat van de cellen gedetecteerd wordt gebruikt voor labeling (dwz het ingangsmonster). Bovendien, omdat het eiwit opbrengst na pull-down laag kan zijn, de mieribody is zeer gevoelig, en afhankelijk van het antilichaam hoge concentraties nodig zijn (tot 1: 100 verdunning in sommige gevallen). Om deze problemen te voorkomen, kan een gelabelde versie van het eiwit tot expressie worden gebracht in de cellen vóór fotomarkering, en de tag kan vervolgens worden gebruikt om het eiwit na pull-down detecteren.

Zodra het eiwit ID wordt bevestigd, kan validatie van het doelwit worden bewerkstelligd door genetische en / of farmacologische manipulaties of functionele testen van het doelwit van belang aan te tonen dat de activiteit van het doelwit wordt beïnvloed door kleine moleculen binden. De bindingsplaats kan worden gebracht door het identificeren van de aminozuursequentie gemodificeerd door de probe of het bepalen van de 3-dimensionale structuur van het gebonden kleine moleculen door röntgen kristallografie en NMR spectroscopie. Idealiter, als een mutant kan worden vastgesteld dat het vermogen om de kleine molecule bindt verliest, moet hij in staat de activiteit van de kleinmoleculige heffen wanneer tot expressie gebracht in plaats van het wild-type proTein. Het kan ook gewenst zijn om de specificiteit van binding aan het doelwit ten opzichte van andere structureel verwante of "off-target" eiwitten tonen.

Deze algemene protocol kan worden gebruikt in elke toepassing waar directe meting van kleine molecule-binding aan een doelwit eiwit, zolang als een probe kan worden gemaakt dat de biologische activiteit van de moederverbinding behoudt. Mogelijke toepassingen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, identificatie van moleculaire doelwitten van nieuwe verbindingen, het onderzoeken potentiële off-targets van bestaande geneesmiddelen, hetgeen de directe binding van een klein molecuul aan een bepaald eiwit van interesse, het bepalen competitie van binding door andere kleine moleculen aan dezelfde bindingsplaats op een eiwit, en het ontdekken van nieuwe receptoren van natuurlijk verkregen of endogene liganden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20 °C.
Copper Sulfate (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature.
Biotin-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20 °C.
365 nm UV lamp	Spectroline	FC100	UV-blocking glasses should be worn while operating.
Protease inhibitor tablets, EDTA-free	Roche Life Science	11873580001	Prepare 50x solution in water and store at -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Set to output 1, duty 30%.
Fluorescent gel scanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use red laser to detect Alexa-fluor 647.
Detergent-compatible Dc protein assay kit	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidin Agarose beads	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualified	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicillin/Streptomycin solution	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676