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Immunology and Infection

Generazione di due colori Antigen microarray per la rilevazione simultanea di autoanticorpi IgG e IgM

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

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1. Diluitori antigeni e la generazione di Antigen Microarrays

  1. Diluire antigeni in PBS ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml. Stampa fino a 162 antigeni unici in duplice copia con una configurazione microarrayer a 9 pin. Includere antigeni IgG e IgM nella libreria antigene come controlli positivi. Include PBS solo come controllo negativo.
  2. Aggiungere 20 ml di ciascun antigene alla piastra fonte ben 384. Aggiungere antigeni alla piastra di origine in gruppi che rispecchiano l'impostazione della testina di stampa (ad esempio, organizzare gli antigeni in gruppi di 9 quando 9 pin sono utilizzati per la stampa).
  3. Piastra fonte di copertura con un foglio e congelamento a -80 ° C fino al momento di stampare array.
  4. Pulire perni microarrayer solidi incubandoli in un bagno sonicating con acqua deionizzata per 3 x 1 min. Posizionare i perni in cremagliera a secco e poi organizzare perni in microarray testina di stampa. Per 9 pin, utilizzare una configurazione 3 x 3.
  5. microarrayer Programma per la stampa gestito impostando perni numerici testina di stampa,numero di diapositive per la stampa, il numero di pastiglie su ogni diapositiva, e il numero di punti di repliche per ciascun antigene. In genere, utilizzare 9 pin, 70 scivoli, 2 pastiglie / scivolo, e 2 punti di repliche per ciascun antigene. microarrayer Programma per Sonicare perni in acqua tra i diversi gruppi di antigeni.
  6. Piastra fonte disgelo e la piastra poi centrifugare per 1 min a 100 x g. Mettere piatto di origine nel punto indicato in microarrayer. Rimuovere la sezione di foglio che copre il primo gruppo di antigeni da stampare.
  7. Disporre diapositive non stampati sulla superficie Arrayer e il programma di tiratura. scivoli di stampa a temperatura ambiente con umidità impostati sul Arrayer al 55 - 60% con la build umidificatore della macchina array.
  8. Dopo ogni gruppo di antigeni è stampato su tutte le diapositive, mettere in pausa il microarrayer. Coprire gli antigeni che sono stati appena stampati con un foglio (per evitare l'evaporazione) e scoprire il successivo gruppo di antigeni da stampare. Continuare programma di stampa.
  9. Dopo che tutti gli antigeni sono stati stampati, fonte di copertura plmangiato con nuovo pezzo di stagnola e congelare a -80 ° C. Mettere diapositive stampate in scatola di diapositive e tenuta di vuoto. I vetrini possono essere utilizzati il ​​giorno successivo o fino a un mese dopo.

2. Probing Antigen microarray con diluito Sera

  1. Collocare i vetrini in frame utilizzando camere di incubazione. Aggiungere 700 ml di tampone bloccante (2,5% [vol / vol] siero fetale di vitello (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 in PBS) per ciascuna superficie matrice.
  2. Mettere pellicola adesiva su telaio e posto in un contenitore sigillato con un pezzo di tessuto bagnato. Incubare O / N a 4 ° C su un agitatore meccanico.
  3. Diluire i campioni di siero 1: 100 in tampone di bloccaggio. Aspirare soluzione bloccante da array e aggiungere 500 ml di campione diluito ad ogni superficie array.
  4. Coprire con pellicola adesiva e incubare per 1 ora a 4 ° C con dondolo.
  5. Diluire anticorpi secondari in tampone di bloccaggio. Per gli studi umani, diluire un anticorpi IgG di capra Cy3 marcato anti-umano a 0,33 mg / ml e una Cy5 etichettati capra anti-Human anticorpi IgM a 0,25 mg / ml. Per gli studi di topo, diluire un Cy3 marcato anticorpi di capra anti-topo IgG a 0,38 mg / ml e Cy5 etichettato capra anti-topo IgM anticorpi a 0,7 mg / ml.
  6. Aspirare campioni di matrici e risciacquare le superfici di matrice 4 volte con tampone di lavaggio (0,1% di Tween 20 in PBS). Versare tampone su di diapositive e sfogliare rapidamente.
  7. Aggiungere 700 ml di tampone di bloccaggio per lavare ogni superficie matrice e incubare 10 minuti a temperatura ambiente con dondolo. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte.
  8. Aggiungere 500 ml di anticorpo secondario diluito ad ogni superficie di scorrimento e coprire con pellicola adesiva. Incubare 45 minuti a 4 ° C con dondolo.
  9. Aspirare miscela anticorpo secondario da diapositive e risciacquare 4 volte come sopra. Lavare i vetrini 3 volte con 700 ml di tampone di bloccaggio / diluizione come sopra.
  10. Estrarre i vetrini da cornici e posto in cremagliera scorrevole di metallo che è immerso in PBS. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente con agitazione orbitale. Mettere in nuovo contenitore di PBS e incubare un altro 20 mcon agitazione.
  11. Cremagliera scorrevole in un contenitore di acqua deionizzata 15 sec. Inserire rack in un nuovo contenitore di acqua e incubare altri 15 sec.
  12. Per diapositive a secco, la cremagliera di diapositive su un adattatore piastra ELISA in centrifuga e far girare a 220 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  13. Mettere in cassette a tenuta di luce fino pronto per la scansione.

3. La scansione Antigen microarray ed esportazione dei dati

  1. Scansione di diapositive utilizzando uno scanner microarray in grado di rilevare i segnali fluorescenti Cy3 e Cy5. Al fine di regolare i livelli tubo fotomoltiplicatore (PMT) dallo scanner, pre-scansione di una diapositiva che è stato sondato soltanto con anticorpi secondari.
    Nota: Questa diapositiva dovrebbe avere la libreria antigene intero stampata su di esso compreso positivo (IgG e IgM) e controlli negativi (PBS). La pre-scansione è una scansione a bassa risoluzione che permette rapidamente all'utente di trovare le impostazioni ottimali PMT.
  2. Impostare i valori di PMT in modo che le caratteristiche umane IgG (sul canale Cy3) e il ronziouna funzionalità IgM (sul canale Cy5) hanno una simile intensità di fluorescenza mediana meno sfondo (MFI-B) (in genere 40.000). I livelli di PMT vengono impostati premendo il tasto "hardware". Una volta impostato, mantenere queste impostazioni PMT costante.
  3. Eseguire la scansione delle diapositive sperimentali sui due canali premendo il tasto "scan". Salvare le immagini delle diapositive (entrambi i canali) dopo ogni scansione.
  4. Caricare il vetrino da analizzare nel software microarray utilizzando il tasto "file".
  5. Caricare il file di elenco gene array (GAL) utilizzando il tasto "file". Il file GAL ha la disposizione della matrice con le identità delle caratteristiche della matrice.
  6. Posizionare il modello di matrice sopra l'immagine digitalizzata in modo che gli array caratteristiche corrispondano il più possibile il modello come.
  7. Allineare le caratteristiche di tutti i blocchi con il modello premendo il tasto "Allinea". Il programma generale, trovare il profilo delle caratteristiche circolari ma alcune regolazioni manuali può essere necessario. Queste regolazioni possono essere effettuate inserendo la modalità di funzione. Il software calcolerà un MFI-B per ciascuno degli antigeni.
  8. Utilizzare il pulsante "file" per esportare i risultati come file di testo.

4. Analisi dei dati di matrice di significato analisi dei microarray (SAM)

  1. Caricare file di testo singoli in Excel e identificare le colonne che hanno IFM-B per i canali Cy3 e Cy5.
  2. Calcolare la media per le funzioni duplicate.
  3. Per qualsiasi negazione IFM-B, sostituire il numero negativo con 10. trasformare i dati grezzi dividendo IFM-B per 100 e poi calcolando logaritmo in base 2.
  4. Analizzare log dati trasformati con un significato analisi dei microarray (SAM), come descritto in precedenza 7.
  5. Per uno studio con due gruppi (ad esempio, controlli sani vs pazienti), un gruppo di etichette "1" e il gruppo "2." Utilizzare un due classi, analisi spaiato in SAM per identificare antigeni reattività che sono significantly differente tra i due gruppi (valore q <0.05).
  6. Utilizzare il clustering e il calore-map generazione di software per rendere le immagini per la presentazione 8.

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Representative Results

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Gli antigeni sono disposti in una piastra ben 384 e stampati su vetrini da un microarrayer robotico come mostrato in Figura 1. La Figura 2 mostra i vetrini collocati in un telaio con camere di incubazione e uno scivolo scansionata dopo l'elaborazione. La Figura 3 mostra vetrini di controllo positivo e negativo. La slitta negativo è sondato soltanto con anticorpi secondari, ed il vetrino di controllo positivo viene sondato con siero di un paziente con lupus eritematoso sistemico. Utilizzando due anticorpi secondari marcati separatamente reattività IgG e IgM possono essere separati sulla stessa superficie di scorrimento. Figura 4 mostra l'intensità di fluorescenza di anticorpi IgM contro il DNA a singola elica (ssDNA) e IgG anticorpi contro ribosomiale P (Ribo P) su una vasta gamma di diluizioni di siero. In questo esperimento siero di controllo positivo di un paziente con lupus eritematoso sistemico con reattività nota contro Ribo P è stato utilizzato. Linrisposte auricolari sono osservati sul canale IgM su tutte le diluizioni di siero. risposte lineari sono osservati sul canale IgG fino ad un MFI-B di circa 30.000. Dopo questo punto, le risposte iniziano a saturare e aumenti di anticorpi a Ribo P non portano ad un corrispondente aumento MFI-B. Figura 5 mostra come gli array possono essere utilizzati per rilevare fattore reumatoide nel siero umano. In questo studio, è stato usato siero di un paziente con vasculite crioglobulinemica con fattore reumatoide documentato (anticorpi IgM contro IgG) di 167 UI / ml (normale <11 IU / ml). Utilizzando anticorpi secondari da solo, senza IgM reattività è visto contro l'IgG che viene avvistato sulla matrice. Al contrario, significativa reattività IgM (MFI-B di circa 5,000) viene rilevato contro IgG quando la slitta è sondata con siero dal paziente con fattore reumatoide. La Figura 6 mostra lo sviluppo di un antigene microarray due colori per l'utilizzo con siero di topo. In questa figura, mouse IgM that viene individuato sulla matrice viene rilevata solo l'anticorpo secondario anti-topo IgM e IgG mouse che è individuato sulla matrice viene rilevata solo l'anticorpo secondario anti-topo IgG. Figura 7 mostra l'allineamento di una griglia modello su un scansionata immagine matrice utilizzando software di analisi di microarray. Una volta che le caratteristiche di matrice sono stati allineati con la griglia, le caratteristiche della matrice possono essere analizzati per ottenere intensità di fluorescenza mediana meno sfondo per ogni funzione.

Figura 1
Figura 1. Generazione di Antigen microarray. Gli antigeni prima immissione nella piastra di origine. Nella piastra di sorgente indicata in figura, gli antigeni sono disposti in gruppi di 9, corrispondente layout 3 x 3 dei perni della testina di stampa. La piastra di origine viene quindi collocato nella microarrayer robotica e gli antigeni sono poi avvistato sulle diapositive. In questo esempio, 2-pad Slides FAST are utilizzato, consentendo per gli array identici a essere individuato sulle superfici 2 nitrocellulosa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Trattamento di Antigen microarray. I vetrini sono collocati in cornici VELOCI utilizzando camere di incubazione e sono trattati con l'aggiunta di campioni e quindi anticorpi secondari. reattività Antigen vengono rivelati con uno scanner in grado di rilevare segnali fluorescenti. L'immagine digitalizzata di una scorrimento veloce 2-pad è mostrata. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3 <br /> Figura 3. Due colori Antigen microarray ottimizzato per l'utilizzo con i sieri umani. (A) IgG, IgM e IgG Fc vengono rilevati sulla matrice sondato soltanto con anticorpi secondari. Questi tre antigeni sono controlli positivi per dimostrare la specificità degli anticorpi secondari. fluorescenza rossa (canale IgM) indica legame dell'anticorpo secondario IgM anti-umano. fluorescenza verde (canale IgG) indica legame dell'anticorpo secondario IgG anti-umano. L'antigene IgG Fc è bianco a causa di sovrasaturazione. (B) Molti altri reattività vengono rilevati sulla matrice sondato con siero di controllo positivo di un paziente con lupus eritematoso sistemico con reattività nota a Ribo P antigene. Le caselle indicano le posizioni in cui sono stati disposti DNA e Ribo P antigeni. (C) Quantificazione delle intensità di fluorescenza nel siero di controllo positivo rivela che la maggioranza delle reattività di anticorpi contro antigeni di DNA sono di IgM isotipo. (D) Quantificazione delle intensità di fluorescenza nel siero di controllo positivo rivela che la maggioranza delle reattività di anticorpi contro antigeni Ribo P sono di isotipo IgG. funzioni di array sono macchiati in duplice copia e sono circa 500 micron di diametro. I grafici mostrano media ± SD per le funzioni di array. dsDNA, DNA a doppio filamento; ssDNA, DNA a singolo filamento; MFI-B, intensità di fluorescenza mediana meno sfondo; Ribo P, ribosomiale P. prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. fluorescenza intensità vs siero Fattore di diluizione. (A) MFI-B su una vasta gamma di diluizioni di siero viene mostrato per IgM contro ssDNA e IgG contro Ribo P. Per questeesperimenti, è stato utilizzato siero di controllo positivo con reattività IgG noto contro Ribo P e ssDNA. MFI-B viene saturato ad un valore di circa 65.000. (B) log2 trasformazione dei dati MFI-B rivela risposte lineari su entrambi i canali IgG e IgM su una vasta gamma di reattività antigene. Oltre un MFI-B 30.000, il segnale IgG inizia a saturare e perde linearità. Caratteristiche Array sono stati avvistati in 6 repliche. I grafici mostrano media ± SD per le funzioni di array. ssDNA, DNA a singolo filamento; MFI-B, intensità di fluorescenza mediana meno sfondo; Ribo P, ribosomiale P. prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Individuazione del fattore reumatoide con due colori Antigen microarray. (B) Array sondato con siero di un paziente con vasculite crioglobulinemica con un alto fattore reumatoide. La funzione di IgG è verde-giallo dovuto al legame di IgM nel siero del paziente immobilizzato IgG. È interessante notare che questo paziente ha anche anticorpi IgG contro IgM come la caratteristica IgM appare arancione. Il paziente ha anche una storia di malattia cardiaca congenita ed è nota per avere alta reattività alla proteina cardiaca troponina C. (C) Quantificazione delle IgG e IgM caratteristiche sulla matrice sondato soltanto con anticorpi secondari dimostra che gli anticorpi secondari non hanno qualsiasi crossreattività. (D) Quantificazionedelle caratteristiche IgG e IgM sull'array sondato con siero del paziente conferma la presenza del fattore reumatoide. Caratteristiche sono macchiati in duplice copia e sono circa 500 micron di diametro. I grafici mostrano media ± SD per le funzioni di array. MFI-B, intensità di fluorescenza mediana meno sfondo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Sviluppo di array a due colori per il profilo del mouse siero Anticorpi. (A) Array sondato soltanto con anticorpi secondari. fluorescenza rossa indica legame dell'anticorpo secondario anti-topo IgM. Fluorescenza verde indica legame dell'anticorpo secondario anti-topo IgG. Il IgG del mouse che viene avvistato sopra la matrice viene rilevato solo dal anti-mouSE IgG anticorpo secondario, e il topo IgM che viene avvistato viene rilevato solo dal anticorpo secondario anti-topo IgM. Le altre caratteristiche sulle matrici che vengono rilevati dagli anticorpi secondari sono anticorpi di cattura nei confronti di IgG del mouse o il mouse IgM. (B) Array sondato con un mouse IgG anticorpo monoclonale contro il tag istidina. Su questa matrice, l'antigene Ribo P (proteina ricombinante His-tagged) è di colore verde, indicando che è rilevato solo dal anticorpo secondario anti-topo IgG. Questo è previsto dato che l'anticorpo monoclonale è di isotipo IgG. L'antigene Ribo P non viene rilevato quando gli array vengono sondati con anticorpi secondari da solo (Orange Box). (C) Quantificazione di IgG, IgM, e Ribo P presenta sulla matrice sondato con un anticorpo monoclonale di topo IgG contro tag istidina. funzioni di array sono macchiati in sei repliche e sono circa 500 micron di diametro. I grafici mostrano media ± SD per le funzioni di array. MFI-B, mediano Fluorescence intensità meno sfondo; Ribo P, ribosomiale P. prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. L'allineamento di una griglia modello su un array Immagine. In questa immagine, una griglia di modello, che è stato generato da un file Gal, era allineato con un microarray antigeni acquisita in precedenza. L'array è stato sondato con siero di un paziente con lupus eritematoso sistemico e un disturbo della coagulazione del sangue che aveva molti reattività autoanticorpi. Verde di fluorescenza rappresenta legame di anticorpi IgG e fluorescenza rossa rappresenta legame di anticorpi IgM. Le caratteristiche stampate da perni solidi sono quasi circolare e sono facilmente delineati dal software microarray (GenePix). Una volta che l'allineamento della griglia è completa, il software in grado di calcolare l'intensità di fluorescenza mediana meno di fondo (su entrambi i canali Cy3 e Cy5) per ciascuna delle caratteristiche di matrice. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il protocollo qui descritto consente la quantificazione di anticorpi con la tecnica dell'antigene microarray. microarrays Antigen offrono diversi vantaggi rispetto ELISA convenzionale nello screening per autoanticorpi. Prima di tutto, una varietà di antigeni inclusi acidi nucleici, proteine, peptidi e lisati cellulari sono schierati sui vetrini nitrocellulosa rivestite, permettendo così lo screening multiplex di autoanticorpi. Inoltre, solo microgrammi di antigene sono necessari per generare le matrici dal nanolitri di antigene vengono trasferite su ciascun vetrino. Gli array richiedono anche campione molto piccolo paziente, come è necessario solo 5 ml di siero per sondare una superficie array per 1: 100 dei campioni. Infine, gli array avvistati su nitrocellulosa hanno dimostrato di essere più sensibile rispetto ELISA convenzionale allo screening per autoanticorpi 9.

Oltre a utilizzare microarray di antigeni per lo screening per autoanticorpi, le matrici possono essere utilizzatid per rilevare reattività contro le proteine ​​non-self (ad esempio, proteine ​​virali), per definire la specificità degli anticorpi monoclonali, e per misurare i livelli di anticorpi non-HLA nel trapianto come descritto in precedenza 9-12. microarray Antigen possono essere utilizzati anche per effettuare esperimenti di mappatura dettagliata epitopi in cui si sovrappongono peptidi di una singola proteina sono disposti su un vetrino. Un recente studio ha utilizzato questo approccio per definire epitopi della proteina U1-70K che sono bersaglio di autoanticorpi nel lupus eritematoso sistemico 13.

Utilizzando il protocollo qui descritto, la rilevazione di reattività IgG e IgM è lineare in una vasta gamma di diluizioni di siero. Questi studi sono stati eseguiti utilizzando siero di controllo positivo di un paziente con lupus eritematoso sistemico con reattività nota a ribosomiale P antigene e ssDNA. IgM reattività ssDNA è lineare a diluizioni di siero di 1 125 a 1: 32.000, corrispondente alla MFI-B di 17.000 a 50. reattività IgG diRibo P è lineare a diluizioni di siero di 1: 4000 a 1: 512.000, corrispondente al MFI-B di 32.000 a 200. Al diluizioni inferiori a 1: 4.000 (e IFM-B superiore a 32.000), la curva di rilevamento di IgG appiattisce reattività e non è più lineare. Nel lavoro con il trapianto di cuore, il siero è abitualmente diluito a 1: 100 come IFM-B per gli antigeni raramente supera i 10.000 a questa diluizione. Per gli studi con pazienti affetti da malattia autoimmune con autoanticorpi ad alto titolo, possono avere bisogno di campioni dei pazienti essere ulteriormente diluiti per garantire che la maggior parte dei reattività autoanticorpi rientrano nel range lineare del test.

Mentre MFI-B può essere utile confrontare reattività di autoanticorpi tra gruppi di pazienti, può anche essere utile per convertire questo valore in una misura più quantitativa dei livelli di autoanticorpi. Questo può essere ottenuto individuando più noto diluizioni purificata IgG e IgM sui vetrini per generare una curva standard. Utilizzando questa curva, MFI-B può quindi essere transformata in un livello di autoanticorpi per ciascun antigene.

Nel protocollo presentato qui, sono stati utilizzati 2-pad diapositive nitrocellulosa rivestite. Su queste diapositive, due array identici, che può essere sondato con due campioni di siero separati, vengono stampate su ciascun vetrino. Questo permette a due campioni dello stesso paziente (ad esempio pre e post-trattamento) da confrontare sulla stessa slitta, che riduce al minimo la variabilità interslide. Trentadue diapositive con 64 singoli campioni dei pazienti sono regolarmente trattati allo stesso tempo in un giorno. La matrice più recente viene stampato con 9 pin, consentendo di 162 antigeni da stampare in duplice copia (ogni pin viene stampato un sottoarray 36 caratteristica che equivale a 18 antigeni stampati in duplice copia).

I microarray di antigeni generati in questo protocollo sono state stampate con perni microarrayer solidi. Stampa con perni solidi richiede più tempo rispetto alla stampa con i perni di stile penna dal momento che il microarrayer deve ri-dip nella piastra di origine dopo ogni time che i perni toccare la superficie di scorrimento. Pin solid state usate come producono altamente riproducibili, caratteristiche di matrice quasi circolari (circa 500 micron di diametro). Queste caratteristiche possono essere facilmente individuati e delineati dal software dello scanner, e sono necessarie regolazioni manuali minimi di quantificare le caratteristiche di matrice. Pin solid consentono anche di lisati cellulari da stampare, che può essere difficile da stampare con perni d'oca a causa della loro maggiore viscosità. A causa dei tempi di stampa lunghi coinvolti con perni solidi (a volte 10 - 11 ore per stampare 70 diapositive), gli antigeni che non vengono stampati nella piastra di origine sono coperti con un foglio per evitare l'evaporazione.

Il protocollo qui descritto presenta un metodo per separare reattività IgG e IgM sulla stessa superficie di scorrimento. Gli array sono stati ottimizzati per lo screening per entrambi gli anticorpi umani e topo utilizzando coppie di anticorpi secondari marcati con diversi fluorofori. Fondamentale per questo approccio a due colori è l'identificazione secoanticorpi ndary che sono altamente specifici sia per isotipi IgG o IgM. Gli anticorpi secondari utilizzati riconoscono la porzione Fc di IgG o IgM e non cross-reagiscono con l'altro. Separare i segnali IgG e IgM è importante date le diverse funzioni di questi anticorpi in risposte immunitarie. Ad esempio, IgM viene prodotto a livelli superiori dalle cellule B1 ed è tipicamente un marcatore di una risposta immunitaria precoce. D'altra parte, IgG è un marcatore di una risposta immunitaria in seguito, che si sviluppa a seguito del passaggio di classe 14. Rilevando i segnali IgG e IgM separatamente, è anche possibile identificare IgM fattori reumatoidi in campioni di pazienti (cioè, immunoglobuline IgM che si legano a IgG che è stato macchiato sulla matrice). Individuando diverse porzioni di anticorpi (ad esempio, Fc contro Fab), legame del fattore reumatoide per differenti epitopi di anticorpi IgG può essere quantificato. Con la disponibilità di scanner con più di due laser, secondo ulteriorianticorpi ary potrebbero essere aggiunti alla coppia anticorpo secondario corrente per identificare vincolante di IgA, IgD e IgE anticorpi. anticorpi secondari potrebbero anche essere identificati che permetterebbe l'identificazione delle sottoclassi di IgG separati (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) legati agli antigeni su un singolo array.

In conclusione, la tecnica dell'antigene microarray è una tecnologia robusta permettendo la caratterizzazione ad elevata capacità di autoanticorpi. Questa tecnica è altamente personalizzabile e sensibile. Il sistema di rilevazione fluorescente a base è stata ottimizzata per gli studi sia umane e di topo e consente la rilevazione simultanea di anticorpi IgG e IgM.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

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References

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Generazione di due colori Antigen microarray per la rilevazione simultanea di autoanticorpi IgG e IgM
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Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

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