Introduction
血-脑屏障分开的中枢神经系统（CNS）的1系统循环- 3。它提供了一种抑制细胞的自由流动和水溶性分子的扩散，保护从病原体和潜在的有害物质的大脑的物理屏障。除了它的屏障功能，血脑屏障能使脑实质，这确保了神经元组织的适当运作的输送氧和营养物质。血脑屏障的功能特性深受其细胞和非细胞成分调节，具有高度专业化的内皮细胞是其主要结构件。血脑屏障的内皮细胞是由紧密连接（TJ）配合，缺乏穿孔的，极低的胞饮的活性，并永久主动转运机制的存在表征。嵌入内皮细胞，星形胶质细胞最终脚=相关比肩BBB的其他组成部分的EC基底膜，周细胞与神经元和小胶质6和一起形成神经血管单元（NVU），这使得能够在CNS 7适当运作- - enchymal基底膜也有助于血脑屏障2,4开发，维护和功能9。
在多种神经性疾病，如神经变性，炎症或传染病的，血脑屏障的功能受到损害2,5,10。 TJ配合物和分子运输机制的失调导致增加的血脑屏障通透性，白细胞外渗，炎症和神经元损伤。为了研究这种病理生理条件下的BBB特性， 各种体外 BBB模型已经建立9,11,12。他们共同提供了宝贵的见解屏障的完整性，透气性以及传输机制的变化。这些模型使用人，小鼠，大鼠，猪或b的内皮细胞羊产地13 - 18;原代内皮细胞或细胞系中培养或者作为单一或一起，以便在体内 19更接近地模拟血脑屏障周细胞和/或星形胶质细胞- 25。近年来，跨内皮电阻（TEER）的测量变得评估内皮屏障性能26,27被广泛接受的工具。
TEER反映阻抗跨细胞单层的离子通量及降低提供损害内皮屏障完整性并因此增加渗透性的敏感量度。各种TEER测量系统已经开发，包括上皮Voltohmmeter（EVOM），电细胞-基底阻抗传感（ECIS），以及实时细胞分析15,28 - 30。 TEER反映至（旁路线）相邻内皮之间的离子通量的电阻和成正比的屏障的完整性。在阻抗谱27,31，复合总阻抗（Z）的测定，其提供了关于通过测量CCL的屏障完整性的其他信息。 CCL涉及通过细胞膜（跨细胞途径）的电容电流：细胞层的作用就像在等效电路的电容器，分离在膜的两侧的收费及成反比的屏障完整性。当插入渗透性增加，内皮细胞附着，增殖，扩散到微孔膜。此抵抗刀片的背景电容电流（其本身的作用就像一个电容器），并直到它到达其最低水平导致降低的电容。这之后是建立TJ的络合物密封关闭相邻内皮之间的空间。这限制了通过细胞旁路径离子通量，和TEER增加，直到它到达平台期。下炎性病症，然而，endotheli人屏障被破坏：TEER降低作为TJ络合物得到破碎和CCl增加作为插入的电容成分再次上升。
我们TEER测量采用自动化小区监控系统，32：它遵循阻抗谱的原则，并扩展了其以前的应用程序。在这里，我们描述了在体外血脑屏障模型，使阻隔性能的研究，包括与免疫细胞脑内皮的相互作用;特别是活化的T细胞。 37 -这样的病理生理条件在CNS的自身免疫疾病，如多发性硬化和其的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎33观察到。这里，一个重要的步骤是穿过BBB脑炎，髓鞘特异性T细胞的轮回。这之后是其在血管周围空间以及进入脑实质激活，在那里他们招募其他免疫细胞和箱diate炎症和随后脱髓鞘1,35,38。然而，这样的T细胞和内皮细胞之间的相互作用的分子机制，血脑屏障的主要成分，不能得到很好的理解。我们的协议旨在填补这一空白，并给予新的见解对内皮细胞（ 即屏障的完整性和渗透性）在他们的直接接触和复杂的相互作用与活化的T细胞的后果。
这里描述的协议利用主鼠标脑微血管内皮细胞，生长成与微孔膜渗透插入一个单层的。内皮细胞共培养的CD4 + T细胞，其可以预先激活或多克隆或在抗原特异性的方式。用预活化，但不幼稚T细胞MBMECs的共培养诱导的TEER降低和增加CCL，它提供了MBMEC功能障碍和屏障破坏的定量量度。该技术是非侵入性的：它使用内置代替筷子电极，其防止欧共体单层主要障碍;它可以被用于监测屏障功能，而无需使用细胞标记物的。它使得以自动方式连续测量并且使两个阻挡参数（TEER和CCL）随着时间的推移同时进行独立的评估。该方法也是不够敏感不同水平的T细胞活化的和内皮这样的T细胞的作用之间进行区分。
它可以在很宽范围的官能试验中使用：在炎症过程中涉及不同的细胞因子和/或趋化因子可以添加到MBMECs和T细胞的共培养;针对关于EC或T细胞侧粘附分子阻断抗体可以使用;并且可以在T细胞引发或它们的共培养内皮细胞的过程中加入的T细胞的活化标记物或它们的溶细胞性的抑制剂。该法还对T细胞轮回有用测定法，因为它可以作为前加入T细胞的MBMEC单层完整性的质量控制。这一切都使得这种方法的灵活和可靠的工具来研究BBB 体外 ，重点是激活的T细胞对EC单层完整性的影响。这是特别重要的对于理解血脑屏障破坏的机制在自体免疫疾病，如MS和其动物模型EAE，其中自反应，致脑炎的T细胞穿过BBB和引起炎症和神经元损伤的发病机理。
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Protocol
对于所有的实验中，小鼠按照动物保健德国准则，孕育和在明斯特大学中心动物设施无特定病原体条件下维持。所有实验均根据动物实验伦理委员会的指导方针进行，北莱茵 - 威斯特法伦州，德国（LANUV，AZ 84-02.05.20.12.217）地方当局的批准。
1. MBMEC分离与培养
注意：如前面详细14进行了以下修改所述隔离MBMECs：
- 牺牲20只成年C57BL / 6小鼠（6-8周龄）用CO 2吸入并通过确定呼吸心跳骤停确认他们的死亡。
- 冲洗，用70％的乙醇鼠标和用剪刀斩首它;删除使用镊子和剪刀头皮。使头骨的左侧和右侧切口，从枕骨大孔开始。从尾侧，德抬起头颅Ë出用镊子大脑。
- 下在层流罩中，使用无菌镊子放置脑在培养皿并取出脑干，小脑和丘脑，只保留皮层。
注：显微镜使用是没有必要的任何步骤。 - 放置皮质到一张无菌Western印迹纸中，用钳子轻轻摇动，直到脑膜不再可见。
- 机械和酶消化（以下协议14）后，通过使用一个长的，无菌针头和5ml的柱塞收集从密度梯度内皮细胞。内皮细胞显示为红色的戒指上面红细胞一个阴暗层。这层转移20-25毫升到一个新的价值5000毫升离心管;顶部与DMEM管。
- 两轮洗涤14后，悬浮在6ml含有嘌呤霉素（4微克/毫升）MBMEC介质的细胞和种子它们到一个24孔板六个涂布的孔;让他们在组织在37℃和5％CO 2培养箱中（称为从这里“孵化器”）三天。
注：有关MBMEC涂液的详细信息，请参阅材料表 。 - 通过加入1ml新鲜MBMEC培养基的每孔中，而不嘌呤霉素改变介质;放板背面，在37℃和5％CO 2的两天。
2.收获MBMECs
- 后MBMEC隔离5天与MBMEC涂布溶液预涂可渗透刀片：添加80微升的每个刀片溶液并让它们在37℃和5％CO 2的3小时。
- 仔细吸取出来的涂布溶液，并让刀片风干30分钟。加入2室温毫升（RT）的PBS中至每个孔的板，采用MBMECs洗介质;重复此步骤。添加0.05％胰蛋白酶-EDTA（每孔300微升）和留在培养箱板5-10分钟。
- 2毫升MBMEC培养基添加到每个孔中，以阻止胰蛋白酶。传送收集的细胞到15毫升离心管中并在4℃下以700 xg离心离心他们8分钟。弃上清，重悬细胞于1ml MBMEC介质的无嘌呤霉素。
- 计数细胞;用0.04％台盼蓝的90微升（10倍稀释的细胞）混合10微升细胞悬浮液。移取10微升的玻璃盖和细胞计数室（血球）之间的混合。算在该腔室（N）的所有四个象限锥虫蓝 - 自由细胞和确定计数的细胞（N'）的平均数目如下：N'= N / 4。
- 计算细胞浓度（以10 6个细胞/ ml）使用下面的公式：C = N'×10 4×10，其中10 4由血球的尺寸定和10是从步骤2.4的稀释因子。
- 种子2×10 4个细胞中的每个刀片260微升的体积。添加810微升MBMEC介质的每个的下部隔室以及。将与在孵化器，直到准备插入板第4条继续。
注：上下舱的体积为插入特定的，并不为所有24孔格式。
3. CD4 + T细胞分离和刺激
- CD4 + T细胞分离
- 通过CO 2吸入牺牲我一个成年小鼠（6-8周龄），并确定呼吸心跳骤停确认其死亡。
- 放置在其上的清洁夹层板背面的小鼠并用70％的乙醇冲洗;用消毒剪刀和镊子，打开腹膜并取出脾和淋巴结（腹股沟，腋窝，肱动脉和颈部）;最后，转移的组织到含有上冰上放置5毫升的PBS 15毫升离心管中。
- 下的层流罩，通过与组织滗PBS与在顶部的70微米的细胞过滤的50ml离心管中传送组织;均质所述组织通过与通过过滤器1毫升活塞加压它。
- 在500 XG加入30毫升流式细胞仪缓冲液和离心机它的在4℃5分钟。弃上清，悬浮细胞在10毫升FACS缓冲。通过40微米的细胞滤网过滤悬浮液，另外20毫升流式细胞仪缓冲液添加到管中。
- 离心它在500 xg离心在4℃下5分钟。弃上清，悬浮细胞在500微升FACS缓冲。
- 加入20微升小鼠CD4磁珠的，拌匀孵育在4℃下15分钟。在500 XG加入25毫升流式细胞仪缓冲液和离心机它的在4℃5分钟。
- 在此期间，将一个LS分离塔进磁铁并用3ml FACS缓冲冲洗。弃上清，悬浮细胞在3ml FACS缓冲。
- 添加细胞到柱上。用3ml FACS洗柱缓冲液三次。从磁铁取出柱，并将其放置到一个新的15毫升CENTRIfugation管。添加5毫升流式细胞仪缓冲液中，冲洗出标记的细胞与列柱塞和离心机它在500×g离心5分钟4℃。
- 弃上清，悬浮细胞在3毫升的T细胞培养基。计数细胞在2.4和种子1×10 5个细胞在100μl培养基中每孔中描述。
- CD4 + T细胞刺激
- 多克隆CD4 + T细胞刺激
- 预涂层圆底96孔板用纯化的抗小鼠CD3抗体（克隆145-2C11）在PBS中，在所希望的最终浓度。例如，预涂层的完整板与α-CD3在1微克/毫升，用5毫升PBS，涡旋混合抗体的10微升（原料浓度为0.5毫克/毫升）并添加混合50微升至每个孔用多道移液器。
- 留在孵化该板3小时。分离的T细胞后，用PBS洗预涂板两次。添加纯化的抗CD28抗体（克隆37.51），以在所希望的最终浓度分离的T细胞（ 例如，在1微克/毫升）;拌匀。种子的T细胞和它们留在培养箱中两到三天。
- 用树突细胞（DC）的抗原特异性CD4 + T细胞刺激
注意：如果域控制器被用作抗原呈递细胞（APC），遵循T细胞隔离协议，与这些例外情况：- 均质脾之前，用1毫升胶原酶IA型PBS中的注入它以0.5毫克/毫升，并转移到15毫升离心管中。
- 孵育在水浴在37℃下15分钟。用PBS洗涤后，重悬在FACS缓冲液中的颗粒和添加20微升小鼠的CD11c磁微珠的，而不是CD4微珠。
- 使用MS分离柱和合适的卷：冲洗用1ml FACS缓冲液的柱;于1ml FACS缓冲液中重悬细胞用1ml FACS缓冲液三次洗柱。
- 广告选择d的抗原的DCs（ 例如 ，髓鞘少突胶质糖蛋白（MOG）氨基酸35-55在20微克/毫升），搅拌均匀，每个种子5×10 4个细胞在100μl的T细胞培养基的96圆自下而上好。
- 加1×10 5个 T细胞在100μl的T细胞的培养基的每96圆底井底，如在协议对于T细胞的分离描述。
- 抗原特异性CD4 + T细胞刺激的B细胞
注：如果B细胞作为装甲运兵车，跟着T细胞隔离协议，与这些例外情况：- 从转基因小鼠，其B细胞抗原特异性（ 例如，的IgH MOG（TH）的小鼠，其B细胞特异性识别MOG 35-55）使用脾脏。
- 使用抗原特异性T细胞（ 例如 ，从TCR MOG（2D2）小鼠）。加入20微升鼠标CD19磁珠，而不是CD4微珠。
- 选择的抗原添加到B CELLS（ 例如 ，MOG 35-55，在20微克/毫升），搅拌均匀和种子5×10 4个细胞在100μl的B细胞培养基每96圆底井。
- 在100μl的T细胞培养液中加入1×10 5个 T细胞每96圆底井，作为协议对于T细胞的分离中所描述。
- 多克隆CD4 + T细胞刺激
4.设置和执行测量TEER
- 放置TEER仪器的24孔模块层流罩下。在使用镊子仪器MBMECs取下盖子和地方插入。
- 吸管810微升新鲜培养基到模块井的下部隔室：小心添加它的插入物和模块的壁阱之间。
- 关闭盖子，然后将仪器在孵化器。将仪器连接到它的计算机;打开仪器控制器上，并打开软件。
- 选择在弹出的窗口中“新的测量”。车CK“显示TEER'和'秀CCL'盒;然后按“启动”。在完成第一次测量后，选择“检查所有井”中的“结果”标签，查看所有TEER和CCL值。
- 保存文件：文件>另存为>“文件的名称”。
注：由于TEER和CCl以自动方式被连续地测量，监视在一段三到五天它们的值。更换培养基是没有必要的，除非细胞活力是次优的，由于缺乏在TEER增加作为可视化。 - 选择的时间点共同培养与T细胞MBMECs时CCL是稳定且小于1 F / cm 2，并且TEER已达到其最大水平。
- 仔细检查绝对TEER和CCL的价值观和排除在MBMECs没有通过取消这种井开发的汇合单层足够的井。
- 集团井的其余部分：一个良好单击鼠标右键，选择“添加以及对新孔平均值”。南Ë它，在弹出的窗口;做同样进行分组所有单个井。
- 检查所有井平均以确认他们都有共同培养前相同的初始条件。如果一些有显著不同的绝对TEER值或TEER倾斜，或标准误差太大，重做分组。
注意：井的最佳分组提供TEER值的变化最小，无论是在和实验组之间。 - 在“实验”选项卡，按'暂停'，断开仪器取出孵化器。在层流罩下取下盖子。
- 制备预活化和/或幼稚T细胞，有或没有特定的细胞因子，抗体或其他物质，根据需要：用制备Ť拌匀纯化NA / LE大鼠抗小鼠IFN-γ抗体（克隆XGM1.2）：例如细胞，在每TEER仪器的井20微克/毫升。
注意：如果使用物质如颗粒酶B抑制剂，它们是一dded T细胞培养在T细胞刺激的开头： 例如 ，颗粒酶B抑制剂II（Calbiochem公司）与分离的T细胞以在DMSO 10微米的最终浓度混合。详细信息请参见材料和设备。 - 删除一些从插入介质（上井室）的： 例如 ，认真吸取了150微升（删除所有媒体应该避免，因为它可能扰乱MBMEC单层）。
- 添加T细胞MBMECs通过仔细吸取150微升含有2×10 5个细胞/插入物培养基。
注：在收获前激活的T细胞，只计算爆破，无台盼蓝细胞。 - 关闭盖子，并把乐器回孵化器。重新连接仪器，然后按“恢复测量”。 24小时后，按“停”在“实验”标签，并保存文件（文件>保存）。
5.数据导出和统计分析
- 通过选择文件>导出的结果。
- 在弹出窗口的“设置”选项卡，选择在“字段分隔符”选项，在“小数点分隔符”选项“.DOT”和“制表”。
- 在“导出结果”选项卡中，命名该文件，检查所有出口的油井，并勾选“TEER”和“CCL”盒子中的“选择数据”选项。
- 按“导出数据，”打开导出的文件，并将数据复制到电子表格。
- 正常化导出的数据（由每个重复排序，对每个运行（测量给出TEER和CCL值））：共培养之前的最后时间点的设置TEER和CCl值至100％，并相应地改变它的值对于所有其它运行时，相对于“100％”的运行。
- 规范化的数据复制到所选择的软件生成的曲线图，使用各个井和显示所述平均值的标准误差为每个治疗组。
- Perform双向ANOVA统计检验用Bonferroni校正多重比较，使用所选择的统计软件。
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Representative Results
图1提供了用于研究的T细胞和内皮细胞之间的相互作用的体外血脑屏障模型的一般概述。该实验包括三个主要步骤。第一步是从大脑皮质原MBMECs的隔离，和它们的五天培养。当它们在细胞培养板达到汇合，MBMECs胰蛋白酶化并重新接种到可渗透插入，然后将其放置在TEER仪器。该TEER和MBMECs覆铜板连续测量和监控一段三至五天。在此期间，T细胞是分离的，刺激的（步骤2），以及用于2至5天，类型和刺激的强度进行培养。在步骤3中，T细胞被加入并与MBMECs共培养时CCL是在稳定的低级别和TEER处于其最大电平。选择用于当TEER仍然处于其高原共培养该时间点是为成功的关键的整个测量。因此，它是对T细胞的分离和刺激的时间点是经过精心选择的极其重要的，这样的T细胞达到活化可以通过除了内皮细胞时的期望的水平。加入T细胞后，测量被恢复为多一天和结果进行了分析。
最初的5天的培养后，MBMECs轻易地显示特性纺锤形的形态（ 图2A，左图）和表达的内皮细胞特异性标志物例如PECAM-1和紧密连接蛋白5（ 图2A，中间和右面板）。但是，这本身并不能提供其完整的融合和适当的屏障的完整性的充分证据。阻抗谱，另一方面，给出了单层完整性的良好估计，并作为一个功能测定法的性能之前以及每一个质量控制。在图2B中 ，大部分的孔包含MBMECs的CCL值分别为稳定和低，其TEER值达到平台期。这些孔用于随后共培养实验。它们以这样的方式组内和组间的方差加入T细胞（ 图2C）之前最少进行分组。井的TEER值从静止（如在图2B中所示的蓝色曲线）显著差异都没有使用，因为它们将导致不明确的结果或数据的误解。
前提是MBMEC文化和T细胞刺激最初的需求得到了满足，阻抗谱能够提供有价值的见解T细胞-EC互动。 TEER测定可以作为这种相互作用的初级读出和的T细胞介导EC功能障碍的量度， 如图3A和3B。在这种情况下，MBMECs生长在刀片与微孔0.4微米的直径，这不允许T细胞通过插入膜。 图3A示出了仅刺激，但不幼稚T细胞能够诱导EC功能障碍，如由在TEER降低和增加CCL确定。从而幼稚T细胞可作为阴性对照，因为TEER和CCl共培养与幼稚T细胞留在其初始水平期间。唯一的例外是在共培养引起的处理工具的最开始的峰（提起盖子，添加新的培养基，可以具有略微不同的温度和pH值的单元，和关闭盖子）。这神器出现各种TEER测量和分析过程中被忽略。在加入促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α（在100-500单位/毫升），这是已知的能够诱导EC炎症的，可被用作阳性对照。在图3A中 ，MOG 35-55特异性的CD4
为了研究所述MBMEC单层中断的机制，可以使用各种方法。结果在图3C表明刺激的T细胞，而不是他们的上清液造成对MBMECs实质性损伤，表明T细胞和MBMECs之间的直接接触是用于屏障破坏的关键。此外，除了一个中和α-I的TEER的测量过程中的FN-γ抗体仅略有改善MBMEC阻隔性能，这表明IFN-γ的可能不是这种破坏的主要原因。另一方面，加入颗粒酶B抑制剂II T细胞培养物（ 图3D）恢复MBMEC完整性在更大程度上，指向该溶细胞分子如造成MBMEC损伤和TEER随后下降的重要参与者。
除了其作为对于EC单层完整性的T细胞的作用的主读出的使用，TEER测定也可以作为先于其它测定法，如T细胞轮回测定屏障完整性的质量控制。在这种情况下，插入具有直径为3微米的微孔被使用。在图3E中，TEER测定为了进行以确保MBMEC单层在所有孔中的完整性的相同水平的加成T细胞用于随后transmigratio之前ñ检测。其次从仪器孔中的下隔室的T细胞的收获，染色T细胞α-CD4抗体和流式细胞术分析，使用细胞计数珠测定transmigrated T细胞的绝对数量; 如图3E中所示，中间和右）。需要注意的是刺激用于轮回没有造成TEER大幅下降的T细胞，尽管它们被预先激活如图3A。这可能反映了跨细胞路径轮回期间的免疫细胞可以使用，如先前已39观察到。在图3F，与MBMECs井的一半，用IFN-γ和TNF-α（非炎性VS。发炎）发炎，后来，加入了transmigratory活动的评估幼稚T细胞。在这种情况下，TEER测量提供一个线索，有多强用细胞因子的炎症反应，当T细胞应为transmigratio被添加ñ。
图4显示了一些最常见的情况下，可能导致TEER结果的错误解释。在图4A中，例如，不是所有的MBMECs开发同时完全汇合单层。之一的基团（“幼稚T细胞 - 排除'）的含有MBMECs其TJ络合物以不同的速率进行熟化相比，只是在加入T细胞之前的其它基团。该组因此开发TEER值在100％以上的实验过程中，并从进一步分析中排除。 因此，在实验前的TEER曲线（TJ成熟率）的斜率是作为正确数据解释绝对TEER值作为重要。 图4B示出了在开始共培养不仅过早而且太晚可导致错误的结果。这里，在这两个具有刺激T细胞的组和阴性对照组（介质昌E），TEER值已经通过他们的平台，并开始从实验条件下独立下降，因此表明前和实验过程中不理想的培养条件。这样的基团不应该被包括在分析中。最后，虽然TEER和CCl通常改变，在TEER一个更大的下降伴随着CCL更大的增加这样的方式它们的值，这可能不总是这种情况。在图4C中 ，刺激的T电池B造成TEER更大下降，但比刺激的T细胞中的做了较小的增加CCL。
图1：该技术的一般概述。在初始培养之后，MBMECs被重新接种到可渗透插入并放入自动细胞显示器; TEER和CCL测量每小时4-5天。在此期间，T细胞在体外活化40重新打印。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：MBMECs 开发适合体外 BBB模型融合单层。 （A）的主轴形形态（左）和PECAM-1（中）和紧密连接蛋白5（右）后MBMEC隔离五天免疫荧光染色。 （B和C）TEER和CCl值之前，（B）和单个孔的后（C）的分组，事先吨O增加T细胞。在（B）的蓝色曲线不用于该实验中，因为在该井MBMECs还没有开发的TEER高达在其它孔中。在（C）的数据显示，平均±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 代表性的结果。在TEER（AD）的变化作为MBMEC功能障碍在与T细胞相互作用的主要措施。 （A）中特定的MOG T细胞被MOG特异性B细胞中的MOG 35-55肽存在五天激活。幼稚T细胞和促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α（均在100单位/毫升）分别作为阴性和阳性对照。 （B）中的T细胞用α-CD3和αCD28抗体（1μg/ ml的每）为两三天，所指示的刺激，将它们添加到MBMECs之前。 （C）的T细胞（预活化如（A）中）或它们的上清，α-IFN-γ抗体或相应的同种型对照的存在。 （D）的T细胞（活化前如在（B）中 ）两天，在颗粒酶B抑制剂II或其稀释剂的DMSO的存在。 （E和F）只用作前T细胞轮回屏障完整性的质量控制TEER测定。 MBMECs生长在刀片为3微米的直径的孔。 （E）T细胞，刺激如（A）描述的方法，让轮回到18小时（左）。接下来，他们收获，染色αCD4抗体（克隆RM4-4），并通过流式细胞术分析，使用细胞计数珠（中间和右边）。 （F）在用IFN-γ和TNF-α，以及选择用于随后加入T细胞为轮回测定适当的时间点刺激的MBMEC单层完整性监视。 （AF）结果表明技术一式三份，并且代表每个三个独立的实验。数据显示平均值±SEM。 （E，右）未配对，双尾t检验。 **，P <0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 实际的考虑和数据解释。 （A）来自一个实验组（红色曲线）MBMECs从分析中排除，因为它们的连接复合的成熟的速率不同相比其他克oups。 （ 二 ）增加T细胞太晚的一个例子，这阻碍了MBMEC功能障碍适当的评估。 （c）在破坏由刺激的T细胞“A”（黑色曲线），MBMECs的CCL值呈现较急剧增加比会从TEER引起的相同的T细胞的同时减少可以预期的。 （AC）的T细胞用α-CD3两天刺激和α-CD28抗体（1μg/ ml的每）。结果显示技术一式三份，并且代表每个三个独立的实验。数据显示平均值±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
所描述的协议的几个步骤是一个成功的实验是必不可少的。在初始MBMEC分离和培养，这是至关重要的工作尽可能无菌条件下进行，以防止细胞培养物的污染，真菌孢子或细菌。为了获得内皮细胞的纯培养物，推荐使用含有嘌呤霉素的前三天的介质，使内皮细胞存活，但不是其他细胞类型（特别是周细胞）41,42。值得特别注意的另一个关键步骤是添加预活化的T细胞的正确时间点的识别。期间TEER测定MBMECs的第一个48小时增殖上可渗透插入并关闭彼此之间的间隙。因此，CCL减小，直到它达到一个稳定的和低水平（约0.6μF/厘米2）。这是一个融合的EC单层的第一个迹象，但还不是一个密闭的阻隔的标志。仅在那之后覆铜板已达到一个稳定的水平是否TEER开始增加。当TJ复合物完全形成，欧共体屏障被完全封锁，TEER达到最高水平。该平台通常补种的内皮细胞后三到五天达到并维持另外24到36小时。用于将T细胞的最佳时间点是在高原的开始，这确保内皮细胞仍然存活足以被共同培养与T细胞。作为T细胞激活需要能够安全地预测用于共培养的最佳时间点之前被启动，它可以是有利的，以刺激T细胞的两批在两个不同的日子，以便增加该定时的灵活性。最后，需要以这样一种方式，内和组间变异性是最小的要完成添加T细胞向MBMECs之前个别重复孔的分组。这保证了初始条件T细胞和MBMECs的共培养期间，各组间相等。 我们的协议描述了与预活化的CD4 + T细胞原发性小鼠脑内皮细胞的共培养期间TEER测定。其简单的形式允许多个修改，按照科学需求。例如，类型，强度和刺激的持续时间可以改变。抗原特异性CD4 + T细胞可以通过它们的同源抗原被激活，在合适的抗原提呈细胞（APC）的存在下;可替代地，T细胞可以被多克隆由α-CD3和αCD28抗体激活。在T细胞活化状态可通过各种细胞因子进行调制，阻断抗体，抑制剂。不建议更换主脑EC内皮细胞系，但是，因为它是已知后者显示较少限制的TJ络合物和高导磁率相比，原代细胞43。除了测量TEER作为主读出，该协议提供了EC monolay良好的质量控制之前的T细胞轮回测定（ 图3E，F），呃完整性。值得注意的是，TEER值不一定穿过MBMECs（ 图3E）的T细胞的轮回期间下降：这可能反映了跨细胞路径轮回期间的免疫细胞可以使用，如先前已39,44观察到。
如活化的T细胞共培养中诱导EC功能障碍，TEER示出了稳定的，可预测下降，越过实验可比具有相同的条件。在TEER更大的下降通常伴随着覆铜板更大随之增加。在罕见的情况，但是，增加了在CCL可以更明显比会从TEER（ 图4C）中相应的减少就可以期待。这种差异可能反映了EC单层中断的不同方面。作为内皮尝试关闭屏障破坏过程中形成的间隙，它们可以经历在动态变化形态和运动，如形成突起和增加他们的总表面积，所有这些都可以向在CCL戏剧性和快速增长。这使得在CCL变化不太可预测的，相比于TEER变化。因此，在TEER降低的程度仍然损害屏障完整性的最可靠和有代表性的度量。
该测定可以通过其它技术来补充研究内皮阻隔性能。它可以后跟渗透率测定法，其测量通过破碎EC单层44扩散不同大小的分子的量。为了这个目的，荧光标记的葡聚糖偶联物，如荧光素和德克萨斯红均可使用;其他分子示踪剂也可以（ 例如，蔗糖，甘露糖醇，白蛋白，伊文思蓝和辣根过氧化物酶）26。此外，免疫荧光显微镜可以用于研究在蛋白质表达的变化和TJ和细胞粘附分子的细胞定位。虽然所提出的血脑屏障模型是很简单的，用它获得的结果可以用于更多的生理条件下进一步分析提供有价值的取向。此类测定法包括（但不限于） 在体外剪切流测定法，以补充静态条件下 ，与伊文思蓝注入体内渗透性测定所得到活小鼠占血脑屏障的全部复杂性TEER测定。
虽然灵敏可靠，这里介绍的方法有值得特别注意一定的局限性。在我们的实验装置测得的最大的TEER值达到欧姆厘米2的35-40值。这些TEER值比在体内 ，其中不同类型的细胞和非细胞成分有助于血脑屏障的完整性低得多，但他们也不会高达TEER在其他一些在体外 BBB模型值达到<SUP> 26,45,46。 49 -这可能通过加入氢化可的松向EC介质，它已显示出显着提高的阻隔性能27,47得到改善。然而，这些物质的使用量 - 已知具有抗炎和免疫抑制作用 - 并不适合所有的功能测定法。如这个特定协议的重点是关于屏障完整性的EC-T细胞相互作用的后果，解释将通过加入氢化可的松受到阻碍。使用这样这里介绍的协议使刺激的T细胞的真炎症可能造成EC屏障功能障碍的评估。还值得一提的是，文献报道不同的TEER值的直接比较应谨慎进行。这样的值是高度依赖于实验装置，它们与不同的细胞类型得到的，播种的细胞密度，媒体，细胞生长区，和TEER测量系统（ 例如</ em>的，电极的设计和大小）。
为了更接近地模拟体内情况，复杂的体外 BBB模型已经建立，其中内皮细胞是具有在插入膜的相对侧周细胞共培养，或在周细胞和星形胶质细胞生长的孔的底部12,25,50 - 52。在这样的共培养系统中，不同的细胞类型之间的串扰使得屏障的强束紧，三重共培养物是最好在类似于在体内情况，从而提供最高的TEER值。在这些系统的复杂性，在另一方面，提出了一个限制它们作为在体外 BBB模型广泛使用。
该模型的另一个限制是缺乏剪切应力，这已被证明可以改善屏障完整性53,54的。为了克服这个问题，新的动态模式BBB最近又出台：电子铯是在中空纤维中培养，并进行脉动流的条件下，模仿更密切微血管体内 55,56。
总之，这个协议描述了基于阻抗谱血脑屏障的体外模型。着眼于初级小鼠脑内皮细胞与激活的T细胞的相互作用，该方法允许这样的直接接触的过程中学习的阻隔性能。这是特别重要的用于理解炎性CNS疾病的发展的关键步骤，例如多发性硬化和其动物模型EAE，其中所述BBB是内皮细胞与致脑炎的T细胞的相互作用过程中受到损害。所描述的测定法使得能够这样的相互作用的靶向调制的后果，通过使用各种各样的物质，例如阻断抗体，细胞因子和T细胞活化的抑制剂的研究。该方法灵敏，可靠，非侵入性的一TEER和CCl的第二测量以自动化方式进行。这一切都使得它一个有用的和通用的工具，增加了一个新层至BBB车型的丰富的肢体。它可以具体地扩展我们关于在自体免疫疾病，例如MS观察病理生理条件下的BBB性质知识。
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Acknowledgments
我们是对TEER测量有益的讨论感谢安妮卡Engbers和弗兰克·库尔特的出色的技术支持和马库斯·舍费尔博士（nanoAnalytics有限公司）。这项工作是由德意志研究联合会（DFG），SFB1009项目A03汉王和LK，CRC TR128，项目支持A08; Z1和B01，以LK和硬件，以及跨学科临床研究中心（医学院明斯特）的授权号KL2 / 2015/14 LK。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
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