Introduction
La barrière hémato-encéphalique sépare la circulation systémique du système nerveux central (SNC) 1 - 3. Il fournit une barrière physique qui empêche la libre circulation des cellules et la diffusion des molécules solubles dans l'eau et protège le cerveau contre les agents pathogènes et des substances potentiellement nocives. En plus de sa fonction de barrière, la BHE permet l'apport d'oxygène et de nutriments pour le parenchyme du cerveau, ce qui assure le bon fonctionnement du tissu neuronal. Propriétés fonctionnelles du BBB sont très réglementés par ses composants cellulaires et acellulaires, avec CEs hautement spécialisé étant son principal élément structurel. CEs de la BHE sont caractérisés par la présence de jonctions serrées (TJ) de complexes, le manque de fenestrations, très faible activité pinocytaire, et les mécanismes de transport actives en permanence. D'autres composantes du BBB La membrane basale CE, péricytes enrobage de l'endothélium, astrocytaires pieds d'extrémité et = par associémembrane basale de enchymal contribuent également au développement, la maintenance et le fonctionnement du BBB 2,4 - 6 et, de concert avec les neurones et les microglies, forment l'unité neurovasculaire (NVU), qui permet le bon fonctionnement du CNS 7-9.
Dans une variété de maladies neurologiques, telles que la neuro - dégénératives, des maladies inflammatoires ou infectieuses, la fonction de la BHE est compromise 2,5,10. Dysrégulation de TJ complexes et les mécanismes de transport moléculaire entraîne une augmentation de la perméabilité BBB, leucocytaire extravasation, l'inflammation et des lésions neuronales. Afin d'étudier les propriétés BBB dans de telles conditions physiopathologiques, divers modèles in vitro de BBB ont été établies 9,11,12. Ensemble, ils ont fourni des indications précieuses sur les changements de l'intégrité de la barrière, la perméabilité ainsi que des mécanismes de transport. Ces modèles utilisent des cellules endothéliales humaines, de souris, de rat, de porc ou de borigine ovine 13 - 18; les cellules endothéliales primaires ou de lignées de cellules sont cultivées soit en monoculture ou conjointement avec les péricytes et / ou des astrocytes dans le but d'imiter plus étroitement la BHE in vivo 19-25. Ces dernières années, la mesure de la résistance électrique transendothéliale (TEER) est devenu un outil largement accepté pour évaluer les propriétés de barrière endothéliale 26,27.
TEER reflète l'impédance au flux d'ions à travers la monocouche cellulaire et sa diminution fournit une mesure sensible de l'intégrité de la barrière endotheliale compromise et par conséquent une plus grande perméabilité. Divers systèmes de mesure de TEER ont été mis au point, y compris épithéliale Voltohmmeter (EVOM), Cell-substrat électrique Impedance Sensing (ECIS), et analyse en temps réel des cellules 15,28 - 30. TEER reflète la résistance au flux d'ions entre CEs adjacentes (voie paracellulaire) et est directement proportionnelle à laintégrité de la barrière. En impédance spectroscopie 27,31, impédance totale complexe (Z) est mesurée, qui fournit des informations supplémentaires sur l'intégrité de la barrière en mesurant Ccl. Ccl se rapporte au courant capacitif à travers la membrane cellulaire (transcellulaire passage): la couche cellulaire se comporte comme un condensateur dans le circuit électrique équivalent, la séparation des charges sur les deux côtés de la membrane et est inversement proportionnelle à l'intégrité de la barrière. Lorsqu'il est cultivé sur des inserts perméables, CEs adhèrent, prolifèrent et étalée sur la membrane microporeuse. Résiste à ce courant capacitif de fond de l'insert (qui lui-même agit comme un condensateur) et conduit à une baisse de la capacité jusqu'à ce qu'elle atteigne son niveau minimal. Elle est suivie par la mise en place de TJ complexes qui joint l'espace entre CEs adjacents. Cela restreint le flux d'ions à travers la voie paracellulaire et TEER augmente jusqu'à ce qu'il atteigne son plateau. Dans des conditions inflammatoires, cependant, le endothelial barrière est compromise: TEER diminue à mesure que les complexes TJ se perturbé et Ccl augmente à mesure que la composante capacitive de l'insert augmente à nouveau.
Notre mesure TEER utilise la surveillance automatisée des cellules 32 du système: il suit le principe de la spectroscopie d'impédance et étend ses applications précédentes. Ici, nous décrivons un modèle in vitro BBB qui permet l'étude des propriétés de barrière, y compris l'interaction de l' endothélium cérébral avec les cellules immunitaires; en particulier les lymphocytes T activés. De telles conditions physiopathologiques sont observées dans les maladies auto - immunes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et de son modèle animal expérimental encéphalomyélite auto - immune 33-37. Ici, une étape cruciale est la transmigration des cellules T spécifiques de la myéline encéphalitogéniques à travers la BHE. Ceci est suivi par leur réactivation dans l'espace périvasculaire et l'entrée dans le parenchyme du cerveau, où ils recrutent d'autres cellules immunitaires et mel' inflammation diate et démyélinisation ultérieure 1,35,38. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'interaction entre les cellules T et les cellules endothéliales, les principaux constituants de la BHE, ne sont pas bien comprises. Notre protocole vise à combler cette lacune et donner de nouvelles perspectives sur les conséquences sur les cellules endothéliales ( par exemple, l' intégrité de la barrière et de perméabilité) lors de leur contact direct et interaction complexe avec les cellules T activées.
Le protocole décrit ici utilise des cellules du cerveau endothéliales microvasculaires de souris primaires, cultivées en monocouche sur des inserts perméables avec des membranes microporeuses. Les cellules endothéliales sont co-cultivées avec des cellules T CD4 +, qui peut être pré-activé soit polyclonale ou d'une manière spécifique de l' antigène. Co-culture de cellules T avec MBMECs pré-activé, mais pas naïf induit une diminution de la TEER et une augmentation de la CCl, qui fournit une mesure quantitative du dysfonctionnement et la rupture de la barrière MBMEC. La techniqueest non-invasive: il utilise intégré à la place d'électrodes de baguettes, qui empêchent perturbation majeure de la monocouche CE; il peut être utilisé pour surveiller la fonction de barrière sans l'utilisation de marqueurs cellulaires. Il effectue des mesures continues de manière automatisée et permet une évaluation indépendante des deux paramètres de barrière (TEER et Ccl) simultanément au fil du temps. Le procédé est également suffisamment sensible pour faire la distinction entre les différents niveaux d'activation des lymphocytes T et les effets de ces cellules T sur CEs.
Il peut être utilisé dans une large gamme de dosages fonctionnels: les différentes cytokines et / ou chimiokines impliquées dans les processus inflammatoires peuvent être ajoutés à la co-culture de MBMECs et les lymphocytes T; blocage des anticorps dirigés contre des molécules d'adhésion cellulaire de chaque côté de la CE, ou des cellules T peuvent être utilisées; et des inhibiteurs de marqueurs d'activation des lymphocytes T ou de leurs propriétés cytolytiques peuvent être ajoutés au cours de l'amorçage des cellules T ou de leur co-culture avec CEs. L'essai est également utile pour la transmigration des cellules Tdes essais, car il peut servir de contrôle de la qualité de l'intégrité de la monocouche MBMEC avant l'addition des cellules T. Tout cela fait de cette méthode un outil polyvalent et fiable pour étudier la BHE in vitro, avec un accent sur l'effet des lymphocytes T activés sur l' intégrité de la monocouche CE. Ceci est d'une importance particulière pour la compréhension des mécanismes de la perturbation BBB dans la pathogenèse des maladies auto-immunes, telles que MS et son modèle animal EAE, où, les cellules T encéphalitogéniques autoréactives traversent la BHE et provoquent une inflammation et des lésions neuronales.
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Protocol
Pour toutes les expériences, les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques dans l'animalerie centrale à l'Université de Münster, selon les directives allemandes pour le soin des animaux. Toutes les expériences ont été réalisées selon les directives du comité d'éthique des animaux expérimentaux et approuvés par les autorités locales de Rhénanie du Nord-Westphalie, Allemagne (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).
1. MBMEC Isolement et culture
NOTE: Isoler MBMECs comme précédemment décrit en détail 14 avec les modifications suivantes:
- Sacrifiez 20 adultes C57BL / 6 (6-8 semaines) par inhalation de CO 2 et confirmer leur mort en constatant l' arrêt cardiaque et respiratoire.
- Rincer la souris avec 70% d'éthanol et décapiter l'aide de ciseaux; retirer le cuir chevelu à l'aide de pinces et ciseaux. Faire des incisions sur le côté gauche et à droite du crâne, à partir du foramen magnum. Soulevez le crâne de son côté caudale et take sur le cerveau avec une pince.
- Sous une hotte à flux laminaire, utiliser des pinces stériles pour placer le cerveau dans une boîte de Pétri et retirer le tronc cérébral, le cervelet et le thalamus, ne conservant que le cortex.
NOTE: L'utilisation d'un microscope est pas nécessaire pour l'une de ces étapes. - Placez le cortex sur un morceau de papier buvard Western stérile et le rouler délicatement avec une pince jusqu'à ce meninges ne sont plus visibles.
- Après digestion enzymatique et mécanique (suivant le protocole 14), collecter des cellules endotheliales à partir du gradient de densité à l'aide d' une longue aiguille stérile et 5 ml de piston. Les cellules endothéliales apparaissent comme une couche sombre au-dessus de l'anneau rouge avec des érythrocytes. Transfert de 20 à 25 ml de cette couche dans un nouveau tube de 50 ml d'une centrifugation; recharger le tube avec DMEM.
- Après deux tours de lavage 14, remettre en suspension les cellules dans 6 ml de milieu MBMEC contenant Puromycin (4 pg / ml) et épépiner sur six puits recouverts d'une plaque de 24 puits; les laisser dans un tissuincubateur de culture à 37 ° C et 5% de CO 2 (dénommé «incubateur» à partir d' ici) pendant trois jours.
NOTE: Pour plus de détails de la solution de revêtement MBMEC, voir le tableau des matériaux. - Changer le support en ajoutant 1 ml à chaque puits de milieu MBMEC frais sans puromycine; mettre la plaque arrière à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant deux jours.
2. La récolte MBMECs
- Sur cinq jours après MBMEC isolement, pré-manteau inserts perméables avec une solution de revêtement MBMEC: ajouter 80 pi de solution par insert et les laisser à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 3 heures.
- pipette avec précaution la solution de revêtement et laisser inserts sécher à l'air pendant 30 minutes. Ajouter 2 ml de la température ambiante (RT) PBS dans chaque puits de la plaque, à l'aide MBMECs pour laver le support; répétez cette étape. Ajouter 0,05% trypsine-EDTA (300 pi par puits) et laisser la plaque dans l'incubateur pendant 5-10 min.
- Ajouter 2 ml de milieu MBMEC à chaque puits pour arrêtertrypsinisation. Transférer les cellules recueillies dans un tube de centrifugation de 15 ml et les centrifuger à 700 g pendant 8 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu MBMEC sans puromycine.
- Compter les cellules; mélanger 10 ul de suspension cellulaire avec 90 ul de 0,04% de Bleu Trypan (10x) de cellules de dilution. Pipette 10 pi de ce mélange entre le couvercle de verre et la chambre de comptage de cellules (hémocytomètre). Count TRYPAN cellules Blue-libres dans les quatre quadrants de la chambre (N) et déterminer le nombre moyen de cellules comptées (N ') comme suit: N' = N / 4.
- Calculer la concentration de cellules (dans 10 6 cellules / ml) en utilisant la formule suivante: C = N x 10 4 x 10 où 10 4 est donnée par les dimensions de l'hémocytomètre et 10 est le facteur de dilution de l' étape 2.4.
- Semences 2 x 10 4 cellules dans un volume de 260 ul par insertion. Ajouter 810 ul de milieu MBMEC dans le compartiment inférieur de chaque puits. Placer la plaque avec des inserts dans l'incubateur jusqu'à ce prêt à procéder à l'article 4.
NOTE: Les volumes pour le compartiment supérieur et inférieur sont insert spécifique et ne fonctionnent pas pour tous les formats de 24 puits.
3. T CD4 + Isolement cellulaire et stimulation
- CD4 + lymphocytes T Isolation
- Sacrifiez une souris adulte (6-8 semaines) par inhalation de CO 2 et de confirmer sa mort en constatant l' arrêt cardiaque et respiratoire.
- Placez la souris sur le dos sur une planche de dissection propre et le rincer à l'éthanol à 70%; utiliser des ciseaux et des pinces stériles pour ouvrir le péritoine et enlever la rate et les ganglions lymphatiques (inguinale, axillaire, brachial et cervicales); Enfin, le transfert du tissu dans un tube de centrifugation de 15 ml contenant 5 ml de PBS sur de la glace.
- Sous la hotte à flux laminaire, transférer le tissu décante le PBS avec le tissu dans un tube de centrifugation de 50 ml avec un tamis cellulaire de 70 pm sur le dessus; homogénéiserle tissu en le pressant avec un piston de 1 ml à travers le tamis.
- Ajouter 30 ml de tampon FACS et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de tampon FACS. On filtre la suspension à travers un tamis cellulaire de 40 pm, ajoute encore 20 ml de tampon FACS au tube.
- Centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 500 pi de tampon FACS.
- Ajouter 20 ul de microbilles magnétiques souris CD4, bien mélanger et laisser incuber pendant 15 min à 4 ° C. Ajouter 25 ml de tampon FACS et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Entre-temps, placer une colonne de séparation de LS dans l'aimant et le rincer avec 3 ml de tampon FACS. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 3 ml de tampon FACS.
- Ajouter des cellules dans la colonne. Laver la colonne avec 3 ml de tampon FACS à trois reprises. Retirer la colonne de l'aimant et le placer sur un nouveau 15 ml centritube fugation. Ajouter 5 ml de tampon FACS, débusquer les cellules marquées avec le piston de la colonne et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 3 ml de milieu de lymphocytes T. Compter les cellules comme décrit dans 2.4 et semences 1 x 10 5 cellules dans 100 ul de milieu par puits.
- CD4 + lymphocytes T Stimulation
- La stimulation polyclonale des cellules T CD4 +
- Prérevêtement une plaque à 96 puits à fond rond avec de l'anticorps purifié anti-souris CD3 (clone 145-2C11) dans du PBS à une concentration finale désirée. Par exemple, pour une pré-enduire la plaque complète avec α-CD3 à 1 pg / ml, mélanger 10 pi de l'anticorps (concentration du stock = 0,5 mg / ml) avec 5 ml de PBS, vortex et ajouter 50 ul du mélange à chaque puits avec une pipette à canaux multiples.
- Laissez la plaque dans l'incubateur pendant 3 heures. Après avoir isolé les cellules T, laver la plaque pré-enduit deux fois avec PBS. Ajouter un anticorps anti-CD28 purifié (clone37,51) à des lymphocytes T isolés à une concentration finale désirée (par exemple à 1 pg / ml); bien mélanger. Ensemencer les cellules T et les laisser dans l'incubateur pendant deux à trois jours.
- Stimulation des lymphocytes T CD4 + spécifiques de l' antigène avec des cellules dendritiques (DCs)
NOTE: Si les PED sont utilisées comme cellules présentatrices d'antigène (CPA), suivre le protocole pour l'isolement des cellules T, avec ces exceptions:- Avant l'homogénéisation de la rate, injecter 1 ml de collagénase type IA dans du PBS à 0,5 mg / ml et la transfère dans un tube de 15 ml par centrifugation.
- Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Après un lavage avec du PBS, resuspendre le culot dans du tampon pour FACS et ajouter 20 ul de microbilles magnétiques CD11c de souris, au lieu de microbilles de CD4.
- Utilisez une colonne de séparation MS et les volumes appropriés: rincer la colonne avec 1 ml de tampon FACS; Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon FACS et laver la colonne avec 1 ml de tampon FACS à trois reprises.
- Un dd ' antigène de choix pour les PED (par exemple, la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG) aa 35-55 à 20 pg / ml), bien mélanger et de graines 5 x 10 4 cellules dans 100 pi de T milieu de culture cellulaire par 96 tour-bottom bien.
- Ajouter 1 x 10 5 cellules T dans 100 ul de milieu de culture T de cellules par 96 fond rond de puits à la fin, comme décrit dans le protocole d' isolement pour des cellules T.
- Stimulation des lymphocytes T CD4 + spécifiques de l' antigène avec les cellules B
NOTE: Si les cellules B sont utilisées comme APC, suivre le protocole pour l'isolement des cellules T, avec ces exceptions:- Utilisez la rate de souris transgéniques dont les cellules B sont spécifiques de l' antigène (par exemple, IgH MOG (Th) des souris, dont les cellules B reconnaissent spécifiquement MOG 35-55).
- Utiliser les cellules T spécifiques de l' antigène (par exemple de TCR MOG (2D2) chez la souris). Ajouter 20 ul de microbilles magnétiques CD19 de souris au lieu de microbilles de CD4.
- Ajouter l'antigène de choix pour le cel Bls (par exemple, MOG 35-55 à 20 pg / ml), bien mélanger et de graines 5 x 10 4 cellules dans 100 ul de B milieu de culture cellulaire par 96 à fond rond-bien.
- Ajouter 1 x 10 5 cellules T dans 100 pi de T milieu de culture cellulaire par 96 à fond rond-bien, tel que décrit dans le protocole pour l' isolement des cellules T.
- La stimulation polyclonale des cellules T CD4 +
4. Configuration et exécution TEER Mesure
- Placer le module 24 puits de l'instrument TEER sous la hotte à flux laminaire. Retirez les couvercles et placer les inserts avec MBMECs dans l'instrument en utilisant une pince.
- Pipeter 810 ul de milieu frais dans le compartiment inférieur du puits de modules: l'ajouter soigneusement entre l'insert et la paroi du module ainsi.
- Fermez les couvercles et placer l'instrument dans l'incubateur. Connecter l'appareil à son ordinateur; tourner sur le contrôleur de l'instrument et ouvrir le logiciel.
- Sélectionnez 'nouvelle mesure "dans la fenêtre pop-up. Check 'show TEER' et boîtes 'show Ccl'; puis appuyez sur «start». Après avoir terminé la première mesure, sélectionnez "vérifier tous les puits» dans l'onglet «résultats pour voir toutes les valeurs TEER et Ccl.
- Enregistrez le fichier: Fichier> Enregistrer sous> 'le nom de votre fichier'.
NOTE: Comme TEER et Ccl sont continuellement mesurés de façon automatisée, de surveiller leurs valeurs sur une période de trois à cinq jours. Changer le milieu soit pas nécessaire, à moins que la viabilité des cellules est sous-optimale, telle que visualisée par l'absence d'augmentation de la TEER. - Choisissez le point de co-culture avec des cellules T MBMECs quand Ccl est stable et inférieure à 1 pF / cm 2 et TEER a atteint son niveau maximum de temps.
- Inspectez soigneusement les valeurs absolues TEER et Ccl et excluent les puits dans lesquels MBMECs ont pas développé suffisamment confluentes monocouches en décochant ces puits.
- Groupe le reste des puits: un clic droit sur un puits et sélectionnez 'ajouter ainsi à nouveau puits moyen ». Name dans la fenêtre pop-up; faire la même chose pour tous les puits individuels pour être regroupés.
- Vérifiez tous les puits moyens pour confirmer que tous ont les mêmes conditions initiales avant la co-culture. Si certains ont significativement différentes valeurs absolues TEER ou TEER de ski, ou les erreurs types sont trop grandes, refaire le groupement.
NOTE: Le regroupement optimal des puits fournit une variation minimale des valeurs TEER, à la fois au sein et entre les groupes expérimentaux. - Dans l'onglet «expérience», appuyez sur 'pause', débranchez l'appareil et de le sortir de l'incubateur. Retirez les couvercles sous la hotte à flux laminaire.
- Préparer pré-activé et / ou les cellules T naïves, avec ou sans cytokines spécifiques, des anticorps ou d'autres substances, comme souhaité: Par exemple: mélanger purifié NA / LE rat anticorps anti-souris IFN-γ (clone XGM1.2) avec prêt T cellules à 20 ug / ml par puits de l'instrument TEER.
NOTE: Si des substances telles que l'inhibiteur de granzyme B sont utilisés, ils sontdded à la culture des cellules T au début de la stimulation des cellules T: par exemple, granzyme B Inhibiteur II (Calbiochem) est mélangé avec des cellules T isolées à une concentration finale de 10 uM dans du DMSO. Voir matériaux et équipements pour plus de détails. - Retirez une partie du milieu de l'insert (le compartiment de puits supérieur): par exemple, la pipette soigneusement 150 pi ( en retirant tout le milieu doit être évitée car elle pourrait perturber la monocouche MBMEC).
- Ajouter lymphocytes T à MBMECs par pipetage soigneusement 150 pi de milieu contenant 2 x 10 5 cellules / insert.
NOTE: Lors de la récolte des cellules T pré-activé, compter que le dynamitage, les cellules Trypan Blue-libres. - Fermez les couvercles et placer l'instrument à l'incubateur. Rebranchez l'instrument et appuyez sur "de reprendre la mesure. Après 24 heures, appuyez sur «stop» dans l'onglet «expérience» et enregistrez le fichier (Fichier> Enregistrer).
5. Les données d'exportation et d'analyse statistique
- Exporter les résultats en choisissant Fichier> Exporter.
- Dans l'onglet "Paramètres" de la fenêtre pop-up, sélectionnez ".dot" dans l'option "séparateur décimal" et "tabulator" dans l'option "champ delimiter".
- Dans l'onglet "Résultats de l'exportation", le nom du fichier, vérifier tous les puits à exporter, et cochez la case "TEER" et des boîtes "Ccl" dans l'option "choisir des données".
- Appuyez sur "Données à l'exportation," ouvrir le fichier exporté, et copier les données vers un tableur.
- Normaliser les données exportées (triées par chaque répétition, avec TEER et Ccl valeurs données pour chaque essai (mesure)): les valeurs Set TEER et Ccl du dernier point de temps avant la co-culture à 100% et modifier en conséquence les valeurs pour tous les autres courses, par rapport à la course '100%'.
- Copier des données normalisées à un logiciel de choix pour générer un graphique, en utilisant des puits individuels et l'affichage de l'erreur-type de la moyenne pour chaque groupe de traitement.
- PDeux voies a performance ANOVA test statistique avec une correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples, en utilisant le logiciel statistique de choix.
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Representative Results
La figure 1 donne un aperçu général du modèle BBB in vitro utilisé pour étudier l'interaction entre les cellules T et les cellules endothéliales. L'expérience consiste en trois étapes principales. La première étape est l'isolement des MBMECs primaires provenant corticales du cerveau, et leur culture pendant cinq jours. Lorsqu'ils atteignent la confluence de la plaque de culture cellulaire, MBMECs sont trypsinisées et réensemencées sur des inserts perméables, qui sont ensuite placées dans l'instrument TEER. Le TEER et Ccl de MBMECs sont continuellement mesurés et suivis sur une période de trois à cinq jours. Pendant ce temps, les cellules T sont isolées, stimulées (étape 2), et mises en culture pendant deux à cinq jours, le type et la force du stimulus. A l'étape 3, les lymphocytes T sont ajoutés à et co-cultivées avec MBMECs lorsque Ccl est à un faible niveau stable et la TEER est à son niveau maximum. Le choix de ce point de temps pour la co-culture lorsque la TEER est encore à son plateau est crucial pour le succèsde l'ensemble de mesure. Ainsi, il est extrêmement important que le point de temps pour l'isolement des lymphocytes T et la stimulation est choisi avec soin, de sorte que les cellules T atteignent le niveau désiré d'activation au moment de leur addition à la CEs. Après avoir ajouté les cellules T, la mesure est reprise pour un jour et les résultats sont analysés.
Après la culture initiale de cinq jours, MBMECs montrent aisément morphologie caractéristique en forme de broche (figure 2A, à gauche) et expriment des marqueurs spécifiques des cellules endothéliales tels que PECAM-1 et Claudin-5 (figure 2A, milieu et panneaux de droite). Toutefois, cela seul ne fournit pas de preuves suffisantes de leur confluence complète et de l'intégrité de la barrière adéquate. La spectroscopie d'impédance, d'autre part, donne une bonne estimation de l'intégrité de la monocouche et sert de contrôle de la qualité de chaque puits avant l'exécution d'un test fonctionnel. Sur la figure 2B, la plupart dupuits contenait MBMECs dont les valeurs Ccl étaient stables et faibles, et leurs valeurs TEER a atteint un plateau. Ces puits ont été utilisés pour des expériences de co-culture ultérieures. Ils ont été regroupés d'une manière telle que la variance à l'intérieur et entre les groupes était minime avant d' ajouter les cellules T (figure 2C). Les puits dont les valeurs TEER différait sensiblement du reste (comme la courbe bleue indique la figure 2B) ne sont pas utilisées, car elles conduiraient à des résultats ambigus ou mauvaise interprétation des données.
A condition que les exigences initiales pour la culture MBMEC et la stimulation des cellules T ont été remplies, la spectroscopie d'impédance peut donner des indications précieuses sur l'interaction des cellules T-CE. Mesure de TEER peut servir l'affichage principal pour une telle interaction et une mesure de T à médiation cellulaire dysfonctionnement CE, telle que représentée sur la figure 3A et 3B. Dans ce cas, MBMECs sont cultivées sur des inserts avec micropores 0,4um de diamètre, ce qui ne permet pas aux cellules T de passer à travers la membrane de l'insert. La figure 3A montre que seulement stimulé, mais les cellules T naïves ne sont capables d'induire un dysfonctionnement CE, telle que déterminée par une diminution de la TEER et l' augmentation Ccl. cellules Naïf T peuvent donc servir de témoin négatif, puisque TEER et Ccl lors de la co-culture avec des cellules T naïves restent à leurs niveaux initiaux. L'exception est le pic au début de la co-culture, provoquée par la manipulation de l'instrument (soulevant les paupières, en ajoutant nouveau milieu avec des cellules qui peuvent avoir des températures légèrement différentes et des valeurs de pH, et la fermeture des paupières). Cet artefact apparaît avec toutes sortes de mesures de TEER et est ignoré lors de l'analyse. L'addition des cytokines pro-inflammatoires IFN-y et TNF-a (à 100-500 U / ml), qui sont connus pour être capables d'induire une inflammation CE, peut être utilisé comme témoin positif. Sur la figure 3A, MOG 35-55 CD4 spécifique de
Afin d'étudier les mécanismes de la MBMEC monocouche perturbation décrit, différentes approches peuvent être utilisées. Résultats de la figure 3C montrent que les cellules T stimulées, mais pas leurs surnageants ont provoqué un dommage important aux MBMECs, ce qui indique que le contact direct entre les cellules et MBMECs T est critique pour rupture de la barrière. En outre, l'addition d'un neutralisant α-Ianticorps FN-γ lors de la mesure TEER que légèrement amélioré les propriétés de barrière MBMEC, ce qui suggère que l'IFN-γ peut ne pas être la principale cause de cette perturbation. D'autre part, granzyme ajoutant B Inhibitor II à la culture de cellules T (Figure 3D) rétablit l' intégrité MBMEC une plus grande mesure, montrant cette molécule cytolytique comme un acteur important dans l' apparition de dommages MBMEC et diminution subséquente de TEER.
Outre son utilisation comme indicateur primaire de l'effet des cellules T sur l'intégrité de la monocouche CE, TEER mesure peut également être utilisé en tant que contrôle de la qualité de l'intégrité de la barrière préalable à d'autres dosages, tels que le dosage de transmigration des cellules T. Dans ce cas, des inserts avec des micropores de 3 um de diamètre sont utilisées. Dans la figure 3E, la mesure TEER a été réalisée afin de veiller à ce que MBMEC monocouche était du même niveau d'intégrité dans tous les puits avant l'addition des cellules T pour transmigratio ultérieuren dosage. Elle a été suivie par la récolte de cellules à partir du compartiment inférieur du puits de l'instrument T, la coloration des lymphocytes T avec un anticorps α-CD4 et cytométrie en flux, en utilisant des billes de comptage de cellules pour déterminer le nombre absolu de lymphocytes T transmigré; illustré à la figure 3E, au milieu et à droite). Notez que les cellules stimulées T utilisés pour la transmigration n'a pas causé une diminution substantielle de TEER, bien qu'ils aient été pré-activées comme dans la figure 3A. Cela pourrait refléter la voie transcellulaire cellules immunitaires peuvent utiliser au cours de la transmigration, comme cela a été observé précédemment 39. Sur la figure 3F, la moitié des puits avec MBMECs ont été enflammée par l' IFN-γ et du TNF-α (vs non enflammée. Enflammée), et par la suite, les cellules T naïves ont été ajoutés pour l' évaluation de l' activité transmigrations. Dans ce cas, la mesure TEER a fourni un indice quant à la force de l'inflammation avec des cytokines a été et lorsque les cellules T doivent être ajoutées pour le transmigration.
La figure 4 montre certaines des situations les plus courantes qui peuvent conduire à une mauvaise interprétation des résultats TEER. Dans la figure 4A, par exemple, ne sont pas tous MBMECs ont développé une monocouche confluente entièrement en même temps. L'un des groupes ( «cellules T naïves - exclus») contenait MBMECs dont complexes TJ ont été venant à échéance à un taux différent par rapport aux autres groupes, juste avant l'addition des cellules T. Ce groupe a développé en conséquence des valeurs TEER supérieures à 100% au cours de l'expérience et a été exclu de l'analyse. Ainsi, la pente de la courbe TEER (taux de TJ maturation) avant l'expérience est aussi importante que les valeurs TEER absolues pour une interprétation correcte des données. La figure 4B montre que le démarrage de la co-culture non seulement trop tôt , mais aussi trop tard peut conduire à des résultats erronés. Ici, à la fois dans le groupe avec des cellules T stimulées et le groupe témoin négatif (moyen change), les valeurs TEER ont déjà dépassé leur plateau et ont commencé à diminuer, indépendamment de la condition expérimentale, par conséquent, indiquant des conditions de culture non optimales, avant et pendant l'expérience. De tels groupes ne doivent pas être inclus dans l'analyse. Enfin, bien que la TEER et Ccl changent habituellement leurs valeurs de telle sorte qu'une plus grande diminution de la TEER est accompagnée d'une augmentation plus importante de la CCl, cela peut ne pas être toujours le cas. Dans la figure 4C, stimulés cellules T B a provoqué une plus grande diminution de la TEER, mais une augmentation de plus petite Ccl que les cellules T stimulées A fait.
Figure 1: Vue d' ensemble de la technique. Après la culture initiale, MBMECs sont réensemencées sur inserts perméables et placés dans le moniteur cellulaire automatisé; TEER et Ccl sont mesurées toutes les heures pendant 4-5 jours. Dans l'intervalle, les lymphocytes T sont activés in vitro 40. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: MBMECs développer une monocouche confluente approprié pour un modèle in vitro du Bureau. (A) de la broche en forme de morphologie ( à gauche) et immunofluorescence de PECAM-1 (moyen) et Claudin-5 ( à droite) cinq jours après MBMEC isolement. (B et C) les valeurs TEER et Ccl avant (B) et après (C) regroupement des puits individuels, t avanto ajout de cellules T. La courbe bleue (B) ne sont pas utilisées pour l'expérience, puisque MBMECs dans ce puits ont pas développé TEER aussi élevé que dans les autres puits. Les données de (C) montrent moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Les résultats représentatifs. (AD) Variations de TEER comme mesure principale du dysfonctionnement MBMEC lors de l' interaction avec les cellules T. (A) Les cellules T spécifiques de MOG ont été activés par les cellules B spécifiques MOG , en présence d' un peptide MOG 35-55 pendant cinq jours. les cellules T naïves et des cytokines pro-inflammatoires IFN-y et TNF-a (les deux à 100 U / ml) a servi de contrôle négatif et positif, respectivement. (B) les lymphocytes T ont été stimulés avec des anticorps α-CD28 (1 pg / ml à chaque fois ) pendant deux ou trois jours, comme indiqué α-CD3 et, avant de les ajouter à MBMECs. Des cellules (C) T (pré-activées comme dans (A)) ou leurs surnageants, en présence d'anticorps anti-α-IFN-γ ou l'isotype de contrôle correspondant. Cellules (D) T (pré-activées comme dans (B)) pendant deux jours, en présence d' un inhibiteur granzyme B II ou son DMSO diluant. (E et F) mesure TEER utilisé seulement comme un contrôle de la qualité de l' intégrité de la barrière avant la transmigration des cellules T. MBMECs ont été cultivées sur des inserts avec des pores de 3 um de diamètre. Cellules (E) T, stimulés comme décrit dans (A), ont été loués à transmigrer pendant 18 heures ( à gauche). Ensuite, ils ont été récoltés, colorées pour α-CD4 anticorps (clone RM4-4) et analysées par cytométrie en flux, en utilisant des billes de comptage cellulaire (milieu et à droite). (F)Surveillance de l'intégrité de la monocouche MBMEC lors de la stimulation par l'IFN-γ et de TNF-α, et en choisissant le point de temps approprié pour l'addition ultérieure des cellules T pour le dosage de la transmigration. (AF) Les résultats montrent triplicats techniques et sont représentatifs de trois expériences indépendantes chacune. Les données montrent moyenne ± SEM. (E, droite) non apparié, deux-tailed test t de Student. **, P <0,01. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: considérations pratiques et l' interprétation des données. (A) MBMECs d'un groupe expérimental (courbe rouge) ont été exclus de l' analyse, puisque le taux de maturation de leurs complexes jonctionnels est différente par rapport à d' autres groups. (B) Un exemple d'ajouter des cellules T trop tard, ce qui a empêché une évaluation adéquate de la dysfonction MBMEC. (C) Sur la perturbation par 'A' cellules T stimulées (courbe noire), les valeurs Ccl de MBMECs a montré une augmentation plus dramatique que ce qui serait attendu de la diminution concomitante de la TEER causée par les mêmes cellules T. Des cellules (CA) T ont été stimulés avec des α-CD3 et des anticorps α-CD28 (1 pg / ml à chaque fois ) pendant deux jours. Les résultats montrent triplicats technique et sont représentatifs de trois expériences indépendantes chacune. Les données montrent moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Plusieurs étapes du protocole décrit sont essentiels pour une expérience réussie. Pendant l'isolement de MBMEC initial et de la culture, il est crucial que le travail est effectué dans des conditions stériles, autant que possible, afin d'éviter la contamination de la culture cellulaire avec des spores fongiques ou bactéries. Afin d'obtenir une culture pure de CEs, il est recommandé d'utiliser un milieu contenant Puromycin pour les trois premiers jours, ce qui permet la survie des CEs, mais pas les autres types de cellules ( en particulier les péricytes) 41,42. Une autre étape cruciale qui mérite une attention particulière est l'identification du point de temps correct pour ajouter des cellules T pré-activées. Pendant les 48 premières heures de TEER MBMECs de mesure prolifèrent sur des inserts perméables et combler les lacunes entre eux. Par conséquent, Ccl diminue jusqu'à ce qu'il atteigne un niveau stable et faible (environ 0,6 pF / cm 2). Ceci est le premier signe d'une confluentes CE monocouche, mais pas encore le signe d'une barrière étanche. Seulement aprèsle Ccl a atteint un niveau stable ne le TEER commencent à augmenter. Lorsque complexes TJ sont entièrement formés et la barrière C'est complètement bouclé, TEER atteint son niveau maximum. Ce plateau est généralement atteint trois à cinq jours après réensemencement CEs et est maintenue pendant encore 24 à 36 heures. Le meilleur point de temps pour ajouter les cellules T est au début du plateau, qui assure que la CE sont encore viables assez pour être co-cultivées avec des cellules T. Comme a besoin de l'activation des cellules T à être initié avant le point de temps optimal pour la co-culture peut être prédite en toute sécurité, il peut être avantageux de stimuler deux lots de cellules T sur deux jours différents afin d'augmenter la flexibilité de ce calendrier. Enfin, le regroupement des puits réplicats individuels avant d'ajouter les cellules T aux MBMECs doit être fait de manière à ce que la variabilité à l'intérieur et entre les groupes est faible. Cela garantit que les conditions initiales soient égales entre tous les groupes au cours de la co-culture de cellules T et MBMECs. Notre protocole décrit la mesure TEER lors de la co-culture de cerveau de souris primaire CEs avec des cellules T CD4 + pré-activé. Sa forme simple permet de multiples modifications, en fonction des besoins scientifiques. Par exemple, le type, l'intensité et la durée du stimulus peut être modifiée. Des cellules spécifiques de l' antigène T CD4 + peuvent être activés par leur antigène correspondant, en présence de cellules présentatrices d'antigène (CPA) appropriés; alternativement, les cellules T peuvent être polyclonale activés par des anticorps α-CD28 α-CD3 et. L'état d'activation des cellules T peut être modulée par diverses cytokines, des anticorps bloquants, des inhibiteurs. Remplacement CEs cérébrales primaires avec des lignées cellulaires endothéliales est pas recommandé, cependant, comme il est connu que ce dernier spectacle moins restrictive complexes TJ et perméabilité supérieure par rapport aux cellules primaires 43. En plus de mesurer TEER que la lecture primaire, ce protocole offre un bon contrôle de la qualité de l'monolay CEer intégrité avant le dosage de transmigration des cellules T (figure 3F, F). À noter, les valeurs TEER ne peuvent pas diminuer nécessairement au cours de la transmigration des cellules T à travers les MBMECs (Figure 3E): cela pourrait refléter la voie transcellulaire cellules immunitaires peuvent utiliser pendant la transmigration, comme cela a été observé précédemment 39,44.
Comme les cellules T activées induisent un dysfonctionnement CE au cours de la co-culture, TEER montre, une diminution régulière et prévisible, comparables entre les expériences avec les mêmes conditions. Une plus grande diminution de la TEER est généralement accompagnée d'une augmentation concomitante dans la plus grande Ccl. En de rares occasions, cependant, une augmentation de Ccl peut être plus prononcé que prévu de la diminution correspondante de la TEER (figure 4C). Cet écart peut refléter les différents aspects de la monocouche perturbation CE. Comme CEs essayer de combler les lacunes formées lors de la rupture de la barrière, ils peuvent subir des changements dynamiques dansla morphologie et de la motilité tels que des saillies formant et en augmentant leur surface totale, qui peut contribuer à une augmentation importante et rapide Ccl. Cela rend les changements dans Ccl moins prévisibles, par rapport aux changements de TEER. Ainsi, le taux de diminution de la TEER reste la mesure la plus fiable et représentative de l'intégrité de la barrière compromises.
Ce test peut être complété par d'autres techniques pour étudier les propriétés de barrière endothéliales. Elle peut être suivie par un test de perméabilité, qui mesure la quantité de molécules de différentes tailles qui diffusent à travers la monocouche 44 CE perturbé. A cet effet, les conjugués dextrane marqués par fluorescence, tels que la fluorescéine et le rouge Texas peuvent être utilisés; d' autres marqueurs moléculaires sont également disponibles (par exemple, le saccharose, le mannitol, l' albumine, le Bleu Evans et la peroxydase de raifort) 26. Par ailleurs, la microscopie par immunofluorescence peut être utilisé pour étudier les changements dans l'expression de la protéineet la localisation cellulaire des molécules TJ et l'adhésion cellulaire. Bien que le modèle présenté BBB est très simple, les résultats obtenus avec elle peuvent fournir une orientation précieuse pour d'autres essais dans des conditions plus physiologiques. De tels dosages comprennent (mais à titre non limitatif) l' essai par flux de cisaillement in vitro pour compléter la mesure TEER obtenu dans des conditions statiques et dans l' essai de perméabilité à l' injection in vivo avec du bleu d' Evans chez des souris vivant pour tenir compte de toute la complexité de la BHE.
Bien que sensible et fiable, la méthode décrite ici a certaines limites qui méritent une attention particulière. Les valeurs TEER maximales mesurées dans notre dispositif expérimental atteint des valeurs de 35-40 Qcm 2. Ces valeurs de TEER sont beaucoup plus faibles que in vivo, où différents types de cellules et de composants acellulaires contribuent à l'intégrité de la BHE, mais ils ne sont pas aussi élevés que TEER valeurs obtenues dans un autre des modèles in vitro BBB <sup> 26,45,46. Cela pourrait être améliorée par l'addition d'hydrocortisone au milieu CE, ce qui a été montré pour améliorer considérablement les propriétés de barrière 27,47 - 49. Cependant, l'utilisation de ces substances - connu pour avoir des effets anti-inflammatoires et immunosuppresseurs - ne convient pas pour tous les tests fonctionnels. Comme l'objet de ce protocole particulier est mis sur les conséquences des interactions cellulaires EC-T sur l'intégrité de la barrière, l'interprétation serait entravée par l'addition d'hydrocortisone. En utilisant le protocole présenté ici permet ainsi l'évaluation du véritable potentiel inflammatoire des cellules T stimulées pour provoquer un dysfonctionnement de la barrière CE. Il est également intéressant de noter que la comparaison directe des différentes valeurs de TEER rapportées dans la littérature doit être faite avec prudence. Ces valeurs dépendent fortement de la configuration expérimentale, ils sont obtenus avec différents types de cellules, l' ensemencement des densités cellulaires, les médias, les zones de croissance des cellules et des systèmes de mesure de TEER (par exemple </ Em>, la conception et la taille des électrodes).
Afin d'imiter la situation in vivo plus étroite, un complexe de modèles BHE in vitro ont été mis en place, le cas CEs sont co-cultivées avec des pericytes sur le côté opposé de la membrane de l' insert, ou lorsque les péricytes et les astrocytes sont cultivés sur le fond des puits 12,25,50 - 52. Dans de tels systèmes de co-culture, diaphonie entre différents types de cellules permet plus fort resserrement de la barrière, avec des co-cultures triples étant le meilleur ressemblant à la situation in vivo et donc fournir les valeurs de TEER les plus élevées. La complexité de ces systèmes, d'autre part, constitue une limitation à leur utilisation plus large que les modèles in vitro BBB.
Une autre limitation de ce modèle est l'absence de contrainte de cisaillement, qui a été montré pour améliorer l' intégrité de la barrière 53,54. Pour surmonter ce problème, de nouveaux modèles dynamiques BBB ont récemment été introduites: ECs sont cultivées dans des fibres creuses et soumis à des conditions d'écoulement pulsatile, imitant plus étroitement microvascularisation in vivo 55,56.
En résumé, ce protocole décrit un modèle de la BHE in vitro basée sur la spectroscopie d'impédance. En se concentrant sur l'interaction des cellules endothéliales cérébrales primaires de souris avec des cellules T activées, le procédé permet d'étudier les propriétés de barrière au cours de ce contact direct. Ceci est d'une importance particulière pour la compréhension des étapes cruciales dans le développement des maladies inflammatoires du système nerveux central tels que la sclérose en plaques et son modèle animal EAE, dans lequel le BBB est compromise lors d'une interaction des CEs avec des cellules T encéphalitogéniques. Le dosage décrit permet l'étude des effets d'une modulation ciblée d'une telle interaction en utilisant un large éventail de substances telles que des anticorps bloquants, des cytokines et des inhibiteurs de l'activation des lymphocytes T. La méthode est sensible, fiable et non invasivemesures nd de TEER et Ccl sont effectuées de manière automatisée. Tout cela en fait un outil utile et polyvalent qui ajoute une nouvelle couche au riche corps de modèles BBB. Il peut en particulier élargir nos connaissances sur les propriétés BBB dans des conditions physiopathologiques observées dans les maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques.
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Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Annika Engbers et Frank Kurth pour leur excellent soutien technique et Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) pour des discussions utiles concernant les mesures de TEER. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projet A03 HW et LK, CRC TR128, projets A08; Z1 et B01 à LK et HW, et le Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (Faculté de médecine de Münster) numéro de subvention Kl2 / 2015/14 à LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
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