Introduction
3 -, kan-beyin bariyeri, merkezi sinir sistemi (MSS) 1 sistemik dolaşıma ayırır. Bu hücrelerin serbest dolaşımını ve suda çözünen moleküllerin difüzyon engeller ve patojenler ve potansiyel olarak zararlı maddelerden koruyan beyin fiziksel bir engel oluşturur. bariyer fonksiyonuna ek olarak, BBB nöronal doku düzgün işleyişini sağlayan beyin parankimi, oksijen ve besin iletimini sağlar. BBB fonksiyonel özellikleri son derece son derece uzmanlaşmış EC ana yapı elemanı olmak üzere, hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri tarafından düzenlenir. BBB EC sıkı birleşme (TJ) kompleksleri, fenestrasyonlar eksikliği, aşırı düşük pinocytic aktivitesi ve kalıcı olarak aktif taşıma mekanizmaları varlığı ile karakterize edilir. endotel, astrositik uç ayak ve = ilişkili par katıştırma Diğer BBB bileşenleri AK bazal membran, perisitlerenchymal bazal membran da bbb 2,4 geliştirilmesi, bakım ve işlevine katkıda - 6 ve birlikte nöronlar ve mikroglia ile merkezi sinir sistemi 7 doğru çalışmasını sağlayan nörovasküler birimi (NVU) meydana - 9.
Bu gibi nörodejeneratif, enflamatuar veya bulaşıcı hastalıklar gibi nörolojik hastalıklar, çeşitli, BBB fonksiyonu 2,5,10 ele almaktadır. TJ kompleksleri ve moleküler taşıma mekanizmaları düzensizliği BBB geçirgenliği, lökosit ekstravazasyonu, enflamasyon ve nöronal hasarı sebep olur. Böyle patofizyolojik koşullarda BBB özelliklerini incelemek amacıyla, çeşitli in vitro BBB modelleri 9,11,12 kurulmuştur. Birlikte bariyer bütünlüğünün, geçirgenlik yanı sıra taşıma mekanizmaları değişiklikleri değerli bilgiler sağlamıştır. Bu modeller, insan, fare, sıçan, domuz veya b endotel hücrelerini kullanırKoyun kökenli 13-18; 25 - primer endotel hücreleri ya da hücre hatları, in vivo 19 daha yakından BBB taklit etmek için perisitler ve / veya astrositler ile tekli kültür olarak ya da birlikte kültürlenir. Son yıllarda, endotel elektrik direnci (TEER) ölçümü endotel bariyer özelliklerinin 26,27 değerlendirmek için yaygın olarak kabul gören bir araç haline gelmiştir.
TEER hücre tek tabaka boyunca iyon akı empedansı yansıtan ve onun azalma tehlikeye endotel bariyer bütünlüğünün ve dolayısıyla artan geçirgenliği hassas bir ölçümünü sağlar. 30 - Çeşitli TEER ölçüm sistemleri Epitelyal Voltohmmeter (EVOM), elektrik Hücre alt-tabaka empedansını algılayarak, (ECIS) ve gerçek zamanlı hücre analizi 15,28 dahil olmak üzere geliştirilmiştir. TEER bitişik EC arasındaki iyon akımının (paraselüler yol) direnç gösterir ve doğru orantılıdırbariyer bütünlüğü. Empedans spektroskopisi 27,31 yılında, karmaşık toplam empedansı (Z) CCL ölçerek bariyer bütünlüğünün hakkında ek bilgi sağlar, hangi ölçülür. CCL hücre zarı (transsellüler yol) üzerinden kapasitif akımı ile de ilgilidir: hücre katmanı zarın her iki tarafında ücretleri ayırma eşdeğer elektrik devresinde bir kapasitör gibi davranır ve ters bariyer fonksiyonunun orantılıdır. geçirgen ekler üzerinde yetiştirilen zaman, EC, uygun çoğalırlar ve mikro gözenekli membran yayıldı. Bu (kendisi bir kondansatör gibi davranır) ve minimal seviyeye ulaşana kadar kapasitans bir azalmaya yol açar ucun arka kapasitif akımını direnç gösterir. Bu TJ kurulması takip eder komşu EC arasındaki boşluk kapalı olduğu mühür kompleksleri. Bu parasellüler yoldan iyon akı kısıtlar ve onun plato ulaşana kadar TEER arttırır. inflamatuar koşullar altında, ancak, endothelial bariyer tehlikeye: TJ bozulur olsun kompleksleri ve ekin kapasitif bileşeni tekrar yükseldiğinde Ccl arttıkça TEER azalır.
Bizim TEER ölçümü otomatik hücre izleme 32 sistemi kullanır: Bu empedans spektroskopisi prensibini takip eder ve önceki uygulamalarını uzanır. Burada, bağışıklık hücreleri ile beyin endotel etkileşimi de dahil olmak üzere bariyer özellikleri çalışma, sağlayan in vitro BBB modeli tarif; özellikle aktive edilmiş T hücreleri. 37 - Bu patofizyolojik koşullar, çoklu skleroz ve hayvan modeli, deneysel otoimmün ensefalomiyelit 33 olarak merkezi sinir sisteminin bağışıklık hastalıklarının gözlenmektedir. Burada, çok önemli bir adımdır BBB boyunca ensefalitojenik, miyelin özgü T hücrelerinin göçü olup. Bu beyin parankimi içine perivasküler alanda ve giriş onların reaktivasyonuna tarafından takip edilir, diğer bağışıklık hücrelerini işe ve bana neredeACİL enflamasyon ve daha sonra demiyelinasyon 1,35,38. Bununla birlikte, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimin moleküler mekanizması, BBB temel bileşenler, iyi anlaşılmamıştır. Bizim protokol bu boşluğu doldurmak ve aktive T hücreleri ile bunların doğrudan temas ve karmaşık etkileşimi üzerine endotel hücreleri (yani, bariyer bütünlüğü ve geçirgenlik) üzerinde sonuçları yeni bir bakış açısı kazandırmayı amaçlamaktadır.
Burada açıklanan protokol mikro-gözenekli membran ile geçirgen eklerde üzerinde tek-katman olarak yetiştirilen primer fare beyni mikrovasküler endotel hücreleri, kullanır. Endotel hücreleri, ortak-kültürlenir poliklonal veya antijen spesifik şekilde ya da ön-aktive edilebilir, CD4 + T hücreleri ile. Ön-aktifleştirilmiş, ancak saf T hücreleri ile MBMECs Co-kültür TEER bir azalmaya ve MBMEC fonksiyon bozukluğu ve engelleyici bir bozulma nicel ölçümünü sağlar CCl bir artışa da neden olur. tekniknon-invaziv: built-in yerine AT tek tabaka büyük olumsuz yönde etkilenmemesi çubuk elektrotlar, kullanır; hücre belirteçleri kullanılmadan bariyer fonksiyonunu izlemek için de kullanılabilir. Bu otomatik bir şekilde sürekli ölçümler yapar ve aynı anda zamanla iki bariyer parametreleri (TEER ve Ccl) bağımsız bir değerlendirmesini sağlar. Yöntem ayrıca, farklı T hücresi aktivasyonunun seviyeleri ve EC ile T hücrelerinin etkilerini ayırt kadar hassastır.
Bu fonksiyonel analizlerin geniş bir kullanılabilir: inflamatuar süreçlere de karışırlar farklı sitokinler ve / veya kemokin MBMECs ve T hücrelerinin ko-kültür ilave edilebilir; EC ya da T-hücresi, her iki yanında, hücre yapışma moleküllerinin karşı bloke edici antikorlar kullanılabilir; ve T hücre aktivasyon işaretleme maddelerinin veya sitolitik özellikleri inhibitörleri, T-hücresi priming veya EC ile ko-kültür sırasında ilave edilebilir. Tahlil, aynı zamanda, T-hücresi göçü için kullanışlıdırdeneyler, bu T hücrelerinin ilave edilmesinden önce, MBMEC tek tabaka bütünlüğünün bir kalite kontrol olarak hizmet edebilmektedir. Bütün bu yöntemini AK tek tabaka bütünlüğünü aktive T hücrelerinin etkisi odaklanarak, in vitro BBB incelemek için çok yönlü ve güvenilir bir araçtır. Bu, kendi kendine reaktif ensefalitojenik T hücreleri BBB çapraz ve enflamasyon ve nöronal zarara neden MS ve hayvan modeli EAE gibi oto-bağışıklık hastalıklarının patojenezinde BBB bozulma mekanizmalarının anlaşılması için özel bir önem taşımaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hayvan bakımı Alman kurallarına göre tüm deneyler için, fareler yetiştirilmiş ve Münster University merkezi bir hayvan tesisine spesifik patojenden serbest durumlar altında tutulur. Bütün deneyler hayvan deneylerinin etik komitenin kurallarına göre yapılır ve Kuzey Ren-Vestfalya, Almanya (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) yerel otoriteler tarafından kabul edildi.
1. MBMEC İzolasyon ve Kültürü
Not: Daha önce şu değişiklikler detaylı 14'de anlatıldığı gibi MBMECs izole:
- CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) 20 yetişkin C57BL / 6 fareler kurban ve kalp ve solunum arrest araştırarak onların ölümünü onaylayın.
- % 70 etanol ile fare durulayın ve makas kullanarak başını kesmek; forseps ve makas kullanılarak kafa derisi çıkarın. foramen magnum başlayarak, kafatasının sol ve sağ tarafında kesiler olun. onun kuyruk tarafı ve tak gelen kafatası kaldırınforseps ile beyin dışarı e.
- Laminer akış kaputu altında, sadece korteks tutarak, bir Petri kabındaki beyin yerleştirin ve beyin sapı, beyincik ve talamus kaldırmak için steril forseps kullanabilir.
NOT: Bir mikroskop kullanımı, bu herhangi bir aşaması için gerekli değildir. - Steril Western lekeleme bir kağıt parçası üzerine korteksi yerleştirin ve meninks artık görünür olana kadar forseps ile yavaşça yuvarlayın.
- (Protokol 14 Aşağıdaki) mekanik ve enzimatik sindirimden sonra, uzun, steril bir iğne ve 5 mi piston kullanılarak yoğunluk gradyanı endotel hücreleri toplamak. Endotel hücreleri eritrositler ile kırmızı halka üzerinde bir karanlık bir tabaka olarak görünür. Yeni 50 mi santrifüj tüpe bu katmanın devri 20-25 mi; DMEM ile tüp kontör.
- Yıkama 14 iki tur sonra, puromisin içeren MBMEC ortamında (4 ug / ml), 6 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 24 oyuklu plaka altı kaplanmış oyuklarına üzerine onları tohum; bir dokuda onları terk37 ° C'de ve% 5 CO2 kültür inkübatörü üç gün (buradan itibaren "kuluçka" olarak adlandırılır).
NOT: MBMEC kaplama çözeltisinin ayrıntılar için Malzemeler Tablosuna bakınız. - Puromisinin olmayan, taze MBMEC ortam, her sıra için, 1 ml ilave edilerek orta değiştirme; iki gün daha geri 37 ° C ve% 5 CO2 de tabak koydu.
2. Hasat MBMECs
- MBMEC izolasyondan sonra Beşinci günde MBMEC kaplama solüsyonu ile ön kaplama geçirgen eklerde: uç başına çözeltisi 80 ul ilave edin ve 3 saat boyunca CO2 37 ° C'de bırakmak ve% 5.
- Dikkatle kaplama çözüm pipet ve 30 dakika boyunca ekler hava kurumaya bırakın. orta yıkamak MBMECs kullanılarak plaka her oda sıcaklığında 2 ml (RT) PBS ilave et; bu adımı tekrarlayın. % 0.05 tripsin-EDTA (oyuk başına 300 ul) ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca inkübatör plaka bırakın.
- durdurmak için her bir oyuğa MBMEC orta 2 ml ilave edilirtrypsinization. 15 ml santrifüj tüpüne hücreler toplandı aktarın ve 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve Puromisinin olmadan MBMEC orta 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon.
- Hücreleri saymak; % 0.04 tripan mavi 90 ul (hücre 10x seyreltme) hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın. Pipet cam kapak ve hücre sayım odasına (hemositometre) arasındaki bu karışımı 10 ul. odanın (N), dört çeyrek Tripan Mavisi içermeyen hücrelerin sayısı ve sayılan hücrelerin (N ") 'nin ortalama sayısını belirlemek aşağıdaki gibidir: K' = K / 4.
- Aşağıdaki formül kullanılarak (10 6 hücre / ml), hücre konsantrasyonu hesaplanır: C = N x 10 4 hemasitometre boyutlarıyla verildi ve 10 adım 2.4 seyreltme faktörüdür 10 x 10 4,.
- Tohum uç başına 260 ul'lik bir hacim içinde 2 x 10 4 hücre. her bir alt bölmeye MBMEC ortamının 810 ul ekle. bölüm 4 ile devam etmek için hazır olana kadar inkübatör ekler ile plaka koyun.
NOT: Üst ve alt bölüm için hacimleri insert spesifik ve tüm 24-kuyu biçimleri için işe yaramaz.
3. CD4 + T hücre izolasyonu ve Uyarım
- CD4 + T hücre Isolation
- CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) bir yetişkin fare Kurban ve kalp ve solunum arrest ascertaining ederek ölüme onaylayın.
- Temiz bir diseksiyon gemide sırtında fare yerleştirin ve% 70 etanol ile durulayın; dalak ve lenf nodları (inguinal, koltuk altı, brakiyal ve rahim ağzı) periton açıp kaldırmak için steril makas ve forseps kullanabilir; Son olarak, buz üzerinde 5 ml PBS içeren 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın.
- Laminer akış Kaputun altında, üstünde bir 70 mikron hücre süzgecinden ile 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne doku ile PBS boşaltılarak doku transferi; homojenleştirmeksüzgecinden 1 ml pistonu ile bastırarak dokusudur.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de FACS tamponu ve santrifüj bunu 30 ml ekleyin. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri. tüp FACS tampon diğer 20 ml ekleyin, 40 mikron hücre süzgecinden süspansiyon filtre.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de o santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve FACS tampon 500 ul hücreleri tekrar süspansiyon.
- Fare CD4 manyetik mikro boncuklar 20 ul ekle karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de FACS tamponu ve santrifüj bunu 25 mL ekleyin.
- Bu süre zarfında, mıknatıs bir LS ayırma sütunu yerleştirin ve FACS tamponu 3 ml ile durulayın. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
- sütun hücreleri ekleyin. üç kez FACS tamponu 3 ml sütun yıkayın. mıknatıstan sütunu kaldırmak ve yeni bir 15 ml merkezkaç üzerine yerleştirinfugation tüp. FACS tampon 5 ml ekleyin 5 dakika 4 ° C için 500 xg'de sütun piston ve santrifüj onu etiketli hücreleri yıkayın.
- Süpernatant atılır ve T hücre ortamının 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Oyuk başına ortam 100 ul 2.4 ve tohum 1 x 10 5 hücre tarif edildiği gibi hücre sayımı.
- CD4 + T hücre uyarımı
- Poliklonal CD4 + T hücre uyarımı
- Ön kaplama, istenen nihai konsantrasyonda saflaştınlmış anti-fare CD3 antikoru PBS (klon 145-2C11), bir yuvarlak dipli 96 oyuklu plaka. Örneğin, 1 ug / ml'de α-CD3 ile tam plaka ön kaplama için, PBS, girdap, 5 ml antikor 10 ul (stok konsantrasyon = 0.5 mg / ml) karıştırmak ve karışımın 50 ul iyi çok kanallı pipet ile her.
- 3 saat inkübatörde plaka bırakın. T hücrelerinin izole edilmesi sonra PBS ile iki kez önceden kaplanmış plakayı yıkayın. (Klon saflaştırılmış anti-CD28 antikor ekleyinArzu edilen bir nihai konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri (kadar 37.51), örneğin, 1 ug / ml); iyice karıştırın. T hücrelerini Tohum ve iki ya da üç gün boyunca inkübatör onları bırakın.
- Dendritik hücreler (DC'ler) ile antijene özgü CD4 + T hücresi uyarımı
Not: DCler antijen sunan hücreler (APC'ler) olarak kullanılması halinde, bu özel durumlar dışında, T hücresi izolasyon Protokolü izleyin:- dalak homojenize önce, 0.5 mg / ml PBS içinde kollajenaz tip Ia 1 ml enjekte ve 15 mi santrifüj tüpe aktarın.
- 15 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde inkübe edin. PBS ile yıkandıktan sonra, FACS tampon pelet tekrar süspansiyon ve 20 fare CD11c, manyetik mikro boncuklar ul yerine CD4 mikro ekleyin.
- MS ayrımı kolonu ve uygun hacimlerde: FACS tampon 1 ml kolon durulama; FACS tampon 1 ml ve tekrar süspansiyon Hücreler, FACS tamponu üç kez 1 ml sütun yıkayın.
- ilanDCler (örneğin, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) aa 35-55 20 de ug / ml) için tercih edilen bir D antijen, iyice karıştırın ve tohum 5 x 10 4 hücre T hücre kültür ortamında 100 ul başına 96 yuvarlak Alt- iyi.
- Protokol T hücre izolasyonu tarif edildiği gibi, sonunda 96 yuvarlak dipli-oyuk başına T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleyin.
- B hücreleri antijen-spesifik CD4 + T hücresi uyarımı
NOT: B hücreleri APC 'olarak kullanılması halinde, bu istisnalar, T hücre izolasyonu için Protokolü izleyin:- Olan B hücreleri (B hücreleri, özellikle MOG 35-55 tanır, örneğin, IgH MOG (Th) fareler) antijen spesifik transgenik farelerden dalak kullanın.
- (TCR MOG (2B2) fareler arasında, örneğin) antijen-spesifik T hücreleri kullanır. Fare CD19 manyetik mikro boncuklar yerine CD4 mikro 20 ul ekleyin.
- B cel için tercih edilen antijen ekleLS (örneğin, 20 ug / ml'de MOG 35-55), 96-yuvarlak dipli oyuklu her B hücre kültür ortamında 100 ul 5 x 10 4 hücrelerini karıştırın ve tohum.
- Her T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleme 96 yuvarlak dipli çukurlu T hücresi izolasyon Protokolü hazırlanır.
- Poliklonal CD4 + T hücre uyarımı
4. Kurma ve TEER Ölçümü Sahne
- Laminer akış kaputun altında TEER aletinin 24 kuyu modülünü yerleştirin. forseps kullanarak enstrüman MBMECs ile kapakları ve yer ekler çıkarın.
- Modül kuyu alt bölmesine taze ortam 810 ul pipet: uç ve de modülün duvarı arasında dikkatli bir şekilde ekleyin.
- kapaklarını kapatın ve inkübatör aleti koyun. kendi bilgisayarına aleti bağlayın; Gösterge denetleyicisi açmak ve yazılımı açın.
- Pop-up pencerede 'yeni ölçüm' seçeneğini seçin. Check 'şov TEER' ve 'gösteri CCI' kutuları; tuşuna basın 'start'. İlk ölçüm tamamladıktan sonra, tüm TEER ve Ccl değerlerini görmek için 'sonuçları' sekmesinde 'tüm kuyuları kontrol' seçeneğini seçin.
- 'Dosyanızın adı'> Farklı kaydet> Dosya: Dosyayı kaydedin.
NOT: TEER ve Ccl sürekli olarak, otomatik bir şekilde ölçülür olarak, üç ila beş günlük bir süre boyunca değerlerini izler. hücre canlılığı, optimal olmadığı sürece TEER artış eksikliği ile gösterildiği gibi orta değiştirme gerekli değildir. - Ccl istikrarlı ve daha düşük 1 mF / cm 2 ve TEER maksimum seviyeye ulaştığında T hücreleri ile MBMECs kültür eş zamanlı noktasını seçin.
- Dikkatle mutlak TEER ve Ccl değerlerini incelemek ve MBMECs bu tür kuyular işaretini kaldırarak konfluan yeterli mono tabakaları gelişmemiş olan kuyular hariç.
- Grup kuyuların kalanı: Bir kuyu üzerinde sağ tıklayın ve 'yeni ortalama kuyu iyi eklemek' seçeneğini seçin. namPop-up pencerede e; tüm bireysel kuyuları gruplandırılmış olması için de aynı şeyi.
- hepsi ko-kültür önce aynı başlangıç koşullarına sahip olduğunu doğrulamak için tüm ortalama kuyu kontrol edin. Bazı önemli ölçüde farklı mutlak TEER değerlere sahip veya TEER eğimli veya standart hatalar çok büyükse, gruplama kokan.
NOT: Kuyular optimal gruplama içinde ve deney grupları arasında hem TEER değerlerinde minimum varyasyon sağlar. - 'Deney' sekmesinde, basının 'pause', enstrüman ayırın ve inkübatör dışına götürün. Laminer akış kaputun altında kapaklarını çıkarın.
- Hazırlanan önceden aktive arzu edildiği gibi, veya belirli sitokinler, antikorlar ya da diğer maddeler olmadan ve / veya naif T hücreleri: hazırlanmış T saflaştırılmıştır mix NA / LE sıçan anti-fare IFN-γ antikoru (klon XGM1.2): Örnek hücreler, TEER aygıtının oyuk başına 20 ug / ml'de.
NOT: Bu Granzim B inhibitörü olarak maddeler kullanıldığında, bunlar, birT hücresi stimülasyon başında olan T hücre kültürüne dded: örneğin, Granzim B inhibitörü II (Calbiochem) DMSO içinde 10 mM'lik bir son konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri ile karıştırılır. Daha fazla bilgi için malzemeler ve donatım bakın. - Ovülden orta (üst kuyu bölmesi) bazı kaldırın: (Bu MBMEC tek tabaka rahatsız olabilir gibi tüm orta kaçınılmalıdır kaldırma), örneğin dikkatlice 150 ul dışarı pipetle.
- Dikkatli bir şekilde 2 x 10 5 hücre / parçasını içeren ortam 150 ul pipetleme MBMECs T hücrelerinin ekleyin.
NOT: Önceden aktive T hücreleri hasat, yalnızca, Tripan Mavi-serbest hücreleri patlatma saymak. - kapaklarını kapatın ve tekrar inkübatör cihazı yerleştirin. enstrüman ve basın 'özgeçmiş ölçümü' yeniden bağlayın. ve 'deney' sekmesinde 24 saat, basın 'dur' sonra dosyayı (Dosya> Kaydet) kaydedin.
5. Veri Aktarma ve İstatistiksel Analiz
- Dosya> Dışa Aktar'ı seçerek sonuçları ihracat.
- Pop-up pencere "ayarları" sekmesinde, "alan sınırlayıcı" seçeneğinde "ondalık ayracı" seçeneğinde ".dot" ve "sekme" seçeneğini seçin.
- "İhracat sonuçları" sekmesinde, dosya adı tüm kuyuları ihraç edilecek kontrol ve "verileri seçmek" seçeneğindeki "teer" ve "Ccl" onay kutularını.
- Basın "ihracat verileri," aktarılan dosyayı açın ve bir elektronik tabloya veri kopyalama.
- ko-kültür önceki son zaman noktasında Set TEER ve Ccl değerleri% 100 ve diğer tüm için buna göre değerleri değiştirmek: (Her çalışma (ölçüm için verilen TEER ve Ccl değerleri ile, her tekrarında sıralama kriteri:)) ihraç veri normalleştirmek '% 100' vadede göreceli çalışır.
- ayrı ayrı kuyuların kullanılarak ve her tedavi grubu için ortalama standart hata gösteren bir grafik oluşturmak için bir seçim yazılımı normalleştirilmiş verileri kopyalama.
- Pseçim istatistiksel yazılımı kullanarak, çoklu karşılaştırmalar için bir Bonferroni düzeltmesi İki yönlü ANOVA istatistik testi erform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan in vitro BBB modelinin genel bir bakış sağlar. Deney üç ana adımdan oluşur. İlk adım beyin korteks primer MBMECs izolasyonu ve beş gün boyunca onların kültürüdür. Onlar hücre kültürü plakasına izdiham ulaştığınızda, MBMECs tripsinize ve sonra TEER enstrüman yerleştirilir geçirgen ekler, üzerine reseeded edilir. TEER ve MBMECs CCL sürekli olarak ölçülür ve üç ila beş günlük bir süre boyunca izlenir. Bu süre içinde, T-hücreleri, izole uyarılmış (aşama 2) ve iki ila beş gün sonra, tipine ve uyarıya gücü için kültürlenir. 3. adımda, T hücreleri ilave edilir ve Ccl sabit düşük bir seviyede ve TEER maksimum düzeyde olduğu zaman MBMECs ile birlikte kültürlendi. TEER kendi yaylasında hala ko-kültür için bu kez noktasını seçme başarısı için çok önemlidirBütün ölçüm. bu T hücreleri, EC onların ilave zaman aktivasyon istenen seviyesine ulaşmak için ve dolayısıyla, T hücresi izolasyon ve uyarılması için zaman noktası özenle seçilir son derece önemlidir. T hücrelerini ekledikten sonra, ölçüm bir gün daha devam edilir ve sonuçları analiz edilmektedir.
İlk beş günlük kültürden sonra, MBMECs kolaylıkla özelliği iğ şeklinde bir yapıya (Şekil 2A, sol panel) gösterir ve PECAM-1 ve Claudin-5 (Şekil 2A, orta ve sağ paneller) ve endotelial hücreye özel belirteçler. Ancak, bu tek başına onların tam izdiham ve uygun bariyer bütünlüğünün yeterli kanıt sağlamaz. Empedans spektroskopisi, diğer taraftan, tek tabaka bütünlüğü iyi tahminini veren ve iyi bir fonksiyonel değerlendirme yapılmasından önce, her bir kalite kontrol olarak hizmet etmektedir. Şekil 2B'de, enkuyular olan Ccl değerleri stabil ve düşük MBMECs içeriyordu ve bunların TEER değerleri bir plato ulaştı. Bu kuyular, daha sonra eş-kültür deneyleri için kullanılmıştır. Bunlar içinde ve gruplar arasındaki varyans T hücrelerini (Şekil 2C) ilave edilmeden önce çok az bir şekilde gruplanmıştır. Onlar belirsiz sonuçları veya verinin yanlış yorumlanmasına yol açacak kadar olan TEER değerleri (örneğin Şekil 2B gösterilen mavi eğri gibi) geri kalanından önemli ölçüde farklı kuyular, kullanılmamıştır.
MBMEC kültürü ve T hücre uyarılması için ilk şartlarının yerine getirilmiş olması şartıyla, empedans spektroskopisi T hücre-AT etkileşim değerli bilgiler verebilir. Şekil 3A ve 3B'de gösterildiği gibi TEER ölçümü, bu tür bir etkileşim için birincil okuma ve T hücre-aracılı AT işlev bozukluğunun bir önlem olarak kullanılabilir. Bu durumda, MBMECs fazla mikro gözenek 0.4 ekler üzerinde yetiştirilenT hücreleri, uç membrandan geçmesine izin vermez çapı um. Şekil 3A, sadece uyardığını gösterir ancak CCl bir TEER azalma ile artış ile belirlendiği üzere bu durum naiv T hücreleri, AB disfonksiyon indükleyebilir. Saf T hücreleri, bu şekilde naiv T hücreleri, ilk seviyede kalmak ko-kültür sırasında TEER ve CCI, çünkü bir negatif kontrol olarak hizmet edebilir. istisna (biraz farklı sıcaklık ve pH değerlerine sahip olabilecek hücreleri ile yeni orta ekleme ve kapakları kapatarak, kapakları kaldırma) aleti ele kaynaklanan ko-kültür, başında doruğudur. Bu eser TEER ölçümlerinin her türlü görünür ve analiz sırasında göz ardı edilir. AT iltihabı uyarabildiği bilinmektedir pro-enflamatuar sitokinler, IFN-γ ve (100-500 U / ml), TNF-α, eklenmesi, pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. Şekil 3A'da, MOG 35-55 e özgü CD4
açıklanan MBMEC tek tabaka bozulması mekanizmalarını araştırmak amacıyla, çeşitli yaklaşımlar kullanılabilir. Şekil 3C'de sonuçları, uyarılmış T hücreleri göstermektedir, ancak bunların süpernatanları T hücreleri ve MBMECs arasında doğrudan temas engelleyici engelleme için önemli olduğunu gösteren MBMECs için önemli hasara yol açtı. Ayrıca, nötralize edici bir α-I ilavesiTEER ölçümü sırasında FN-γ antikor sadece biraz IFN-γ, bu bozulma birincil nedeni olmayabilir düşündüren, MBMEC bariyer özellikleri geliştirilmiş. Diğer yandan, T hücre kültürüne ilave Granzim B Inhibitor II (Şekil 3D) MBMEC hasar ve TEER sonraki bir azalmaya neden önemli bir oyuncu olarak sitolitik moleküle işaret büyük ölçüde MBMEC bütünlüğü geri.
AT tek tabaka bütünlüğünü T hücrelerinin etkisi için bir primer okuma olarak kullanımı yanı sıra, TEER ölçümü aynı zamanda, T-hücresi göçü deneyi gibi diğer deneylerden önce bariyer fonksiyonunun bir kalite kontrol olarak da kullanılabilir. Çapı 3 um mikro-kullanıldığı bu durumda, ekler. Şekil 3E de, TEER ölçümü MBMEC tek tabaka daha sonra transmigratio T hücrelerinin ilave edilmesinden önce, tüm kaynaklarda bütünlüğünün aynı seviyede olmasını sağlamak amacıyla gerçekleştirilmiştirn deneyi. Bu transmigrant T hücrelerinin mutlak sayıları belirlemek için hücre sayım boncuklar kullanılarak, α-CD4 antikoru ve flow sitometri ile T hücrelerinin boyanması, gösterge kuyu alt bölmeden T hücrelerinin hasat izledi; ), orta ve sağ Şekil 3E gösterilen. Bu Şekil 3A'da olarak önceden aktive edildi, ancak TEER önemli bir azalmaya neden olmadı göçü için kullanılan T hücrelerini stimüle unutmayın. Daha önce 39 gözlenmiştir gibi bu, bağışıklık hücrelerinin göçü sırasında kullanabilir transselüler rotayı yansıtıyor olabilir. Şekil 3F'de, MBMECs ile kuyu yarısı IFN-y ve TNF-a (iltihaplı. Rakip Enflamasyon olmayan) ile iltihaplı ve daha sonra, saf T hücreleri transmigratory aktivitesinin değerlendirilmesi için ilave edildi. Bu durumda, TEER ölçümü T hücreleri transmigratio için eklenmelidir ne kadar güçlü sitokinler ile inflamasyon ve ne zaman bir ipucu sağladın.
Şekil 4 TEER sonuçlarının yanlış yorumlanmasına yol açabilir en yaygın durumlardan bazılarını gösterir. Şekil 4A, örneğin, tüm MBMECs, aynı zamanda, tam konfluent tek tabaka geliştirdi. grup ( "naif T hücreleri - hariç ') biri olan TJ kompleksleri, sadece T hücrelerinin ilave edilmesinden önce, diğer gruplara kıyasla, farklı bir oranda olgunlaşan edildi MBMECs ihtiva etmiştir. Bu grup sonuç deneme sırasında% 100'ün üzerinde TEER değerleri gelişmiş ve daha fazla analiz dışında tutulmuştur. Böylece, deneyden önce TEER eğrisi (TJ olgunlaşma oranı) eğimi uygun veri yorumlama için mutlak TEER değerleri kadar önemlidir. Şekil 4B ko-kültür başlangıç değil sadece çok erken değil, aynı zamanda çok geç sahte sonuçlara yol açabilir olduğunu göstermektedir. Burada, uyarılmış T hücreleriyle grubu ve negatif kontrol grubuna, hem de (orta change) TEER değerleri zaten onların plato geçti ve deneysel durumdan bağımsız olarak azalmaya başladı, dolayısıyla öncesi ve deney sırasında optimal kültür koşullarını gösteren var. Bu tür gruplar analize dahil edilmemelidir. TEER ve Ccl genellikle TEER daha büyük bir azalma CCL daha büyük bir artış eşlik böyle bir şekilde kendi değerlerini değiştirmek rağmen nihayet, bu her zaman böyle olmayabilir. Şekil 4C'de, T hücreleri, B TEER daha büyük bir azalma göstermiştir, ancak A mi uyarılmış T hücrelerinden daha CCl daha küçük bir artışa neden olmuştur uyarmıştır.
Şekil 1: tekniğin genel bakış. İlk kültürden sonra, MBMECs geçirgen ekler üzerine reseeded ve otomatik hücre monitör yerleştirilir; TEER ve Ccl 4-5 gün her saat ölçülür. Bu arada, T hücreleri, in vitro aktive 40 izniyle yeniden yazdırın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: MBMECs bir in vitro BBB modeli için uygun olan bir konfluent tek tabaka gelişir. (A), mili-şekilli morfolojisi (sol) ve PECAM-1 (orta) ve Claudin-5 (sağ) MBMEC izolasyondan sonra beş gün immünofloresan boyama. (B ve C) TEER ve Ccl değerleri (B) önce ve her bir kuyuda sonra (C) gruplama, önceden TT hücrelerinin O eklenmesi. Bu kuyuda MBMECs diğer kuyularda gibi yüksek teer gelişmiş değil çünkü (B) mavi eğri, deney için kullanılmaz. (C) gösterisinde Veri ortalama ± SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Temsilcisi sonuçları. T hücreleri ile etkileşimi üzerine MBMEC disfonksiyonu birincil ölçütü olarak TEER (AD) Değişiklikler. (A) MOG spesifik T hücreleri, beş gün boyunca MOG 35-55 peptidi mevcudiyetinde MOG özgü B hücreleri tarafından aktive edilmiştir. Naiv T hücreleri ve pro-enflamatuar sitokinler, IFN-γ, TNF-α (100 U / ml, her iki), sırasıyla, negatif ve pozitif kontrol olarak kullanıldı. (B) T hücreleri MBMECs eklemeden önce, α-CD3 ve α-CD28 antikorları (1 ug mL) ekstrakte edildi, iki ya da üç gün olarak gösterilen / ile uyarıldı. (A (olduğu gibi, önceden aktive edilmiş)) (C), T hücreleri veya α-IFN-γ antikor veya karşılık gelen izotip kontrolü huzurunda süpernatantlar. Granzim B inhibitörü II ya da seyreltici DMSO mevcudiyetinde iki gün ((B) 'deki gibi, önceden aktive edilmiş) (D) T hücreleri. (E ve F) T-hücre göçü öncesinde bariyer bütünlüğü için bir kalite kontrol gibi sadece kullanılan TEER ölçümü. MBMECs çapı 3 um'lik gözenekleri olan ekler üzerinde büyütüldü. (A) 'da tarif edildiği gibi (S) T hücreleri, 18 saat (solda) transmigrate izin verildi uyarmıştır. Daha sonra, bu hücre sayımı boncuk (orta ve sağ) kullanılarak, α-CD4 antikoru (klon RM4-4) boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz, hasat edilmiştir. (F)IFN-y ve TNF-a, ve transmigrasyonun deneyi için T hücrelerinin daha sonra ilave edilmesi için, uygun bir zaman noktası seçimi ile uyarma üzerine MBMEC tek tabaka bütünlüğünün izlenmesi. (AF) Sonuçlar, teknik triplicates gösterir ve üç bağımsız deneyin her temsilidir. Veri göstermek ortalama ± SEM. (E sağda) Eşleşmemiş, Student t testi, iki kuyruklu. ** P <0.01. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Pratik düşünceler ve veri yorumlama. (A) bir deney grubu (kırmızı eğri) den MBMECs farklı diğer gr karşılaştırıldığında onların kavşak komplekslerinin olgunlaşma oranı beri, analize dahil edilmemiştiroups. (B) MBMEC disfonksiyon uygun bir değerlendirme engelledi çok geç T hücrelerinin eklenmesi için bir örnek. Uyarılmış T hücreleri "A" ile kesintiden sonra (c) (siyah eğri), MBMECs CCL değerleri aynı T-hücreleri tarafından neden TEER eşlik eden azalma beklenecektir daha çok büyük bir artış göstermiştir. (AC) T hücreleri, iki gün süre ile α-CD28 antikorları (1 ug / ml her biri) α-CD3 ile stimüle edildi ve. Sonuçlar, teknik triplicates gösterir ve üç bağımsız deneyin her temsilidir. Veri göstermek ortalama ± SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
tarif edilen protokol birkaç adım başarılı deney için gereklidir. Başlangıç MBMEC izolasyonu ve kültürü sırasında, çalışma mantar sporları, bakteri veya hücre kültürünün bulaşmasını önlemek için, mümkün olduğu kadar, steril koşullar altında gerçekleştirilir çok önemlidir. EC saf bir kültür elde etmek için, bir EC hayatta kalmasını sağlayan, ilk üç gün puromisin içeren ortam, ancak diğer hücre türleri (özellikle perisitler) 41,42 kullanılması tavsiye edilir. özel dikkat gösterilmesi gereken bir diğer önemli bir adım önceden aktive edilmiş T hücrelerinin eklenmesi için doğru zaman noktasının tanımlanmasıdır. TEER ölçüm MBMECs ilk 48 saat boyunca geçirgen ekler üzerinde çoğalır ve birbirlerine arasındaki boşlukları kapatın. Bu, kararlı ve düşük seviyede (yaklaşık 0.6 jxF / cm2) ulaşana kadar Dolayısıyla CCL azalır. Bu konfluent AT tek tabaka ilk işaretidir, ancak henüz sıkı bir bariyer belirtisi değildir. sonraCcl TEER artırmak için başlangıç yapar istikrarlı bir düzeye ulaşmıştır. TJ kompleksleri tamamen şekillenmiş ve AK bariyer tamamen kapatılmış olduğunda, TEER maksimum seviyeye ulaşır. Bu plato genellikle ECS yeniden tohumlama sonra üç ila beş gün ulaşıldığında ve başka 24 ila 36 saat muhafaza edilir. T hücrelerinin eklenmesi için en uygun zaman noktası EC hala yeterli ortak-kültürlenir edilmesi, T hücreleri ile uygulanabilir olmasını sağlar plato başında yer almaktadır. T hücresi aktivasyonu güvenli bir şekilde tahmin edilebilir ko-kültür için en uygun zaman noktasından önce başlatılması gerekmektedir gibi, bu zamanlama esnekliğini artırmak için, iki farklı günde T hücrelerinin iki toplu uyarma avantajlı olabilir. Son olarak, MBMECs T hücrelerinin ilave edilmeden önce tek tek kopya kuyu grubu içinde ve gruplar arasındaki değişkenlik az olduğu bir şekilde yapılması gerekir. Bu başlangıç koşulları, T hücreleri ve MBMECs ko-kültür sırasında tüm gruplar arasında eşit olmasını sağlar. Bizim protokol, önceden aktive edilmiş CD4 + T hücreleri ile primer fare beyin EC ko-kültür sırasında TEER ölçümünü açıklamaktadır. Onun basit bir form bilimsel ihtiyaçlarına göre, birden fazla değişiklikler için izin verir. Örneğin, uyarıcı tip, güç ve süresi değişebilir. Antijen spesifik CD4 + T hücrelerinin, uygun bir antijen sunan hücreler (APC'ler) varlığında, kendi aynı kökenli antijen tarafından aktive edilebilir; Seçenek olarak ise, T hücreleri, poliklonal α-CD3 ve α-CD28 antikorları ile aktive edilebilir. T-hücre aktivasyon durumu inhibitörleri bloke edici antikorlar, çeşitli sitokinler tarafından modüle edilebilir. Ikincisi gösteri daha az kısıtlayıcı TJ kompleksleri ve yüksek geçirgenlik birincil hücreler 43 ile karşılaştırıldığında olduğu bilindiği gibi endotel hücre hatları ile primer beyin ECS değiştirilmesi, ancak tavsiye edilmez. Birincil okuma olarak TEER ölçülmesine ek olarak, bu protokol, AT monolay kaliteli bir kontrol sağlarT-hücre transmigration deneyinde (Şekil 3E, F) öncesinde er bütünlüğü. Not, TEER değerleri mutlaka MBMECs (Şekil 3E) karşısında T hücrelerinin göçü sırasında azalma olmayabilir: Daha önce 39,44 gözlenmiştir olarak bu, bağışıklık hücrelerinin göçü sırasında kullanabilir transselüler rotayı yansıtıyor olabilir.
aktive T hücreleri ko-kültür sırasında AK disfonksiyon neden olarak, TEER aynı şartlarda deneyler arasında karşılaştırılabilir sabit, öngörülebilir bir düşüş gösterir. TEER daha fazla bir azalmaya, genellikle CCl daha büyük bir eşlik eden bir artış eşlik eder. Nadir durumlarda, ancak CCL bir artış TEER (Şekil 4C) karşılık gelen azalma beklenenden daha belirgin olabilir. Bu tutarsızlık AK tek tabaka bozulması farklı yönlerini yansıtıyor olabilir. EC bariyer kesintileri sırasında oluşan boşlukları kapatmaya çalışırsanız, onlar dinamik değişiklikleri uğrayabilirBu tür uzantıların oluşturulması ve CCI dramatik ve hızlı bir artış katkıda bulunabilir bütün bunlar toplam yüzey alanı, artan olarak morfolojisi ve motilitesi. Bu TEER değişikliklere göre CCL değişiklikler daha az öngörülebilir hale getirir. Bu nedenle, TEER azalma düzeyi tehlikeye bariyer fonksiyonunun en güvenilir ve Örnek ölçer kalır.
Bu testte endotel bariyer özelliklerini araştırmak için diğer tekniklerle tamamlanabilir. Bu kesintiye AT tek tabaka 44 boyunca yayılabilmesi farklı boyutlarda moleküllerinin miktarını ölçen bir geçirgenlik deneyi ile takip edilebilir. Bu amaç için, örneğin, floresein ve Teksas Kırmızısı gibi floresan etiketli dekstran konjugatlar kullanılabilir; Diğer moleküler izleyiciler da mevcuttur (örneğin, sükroz, mannitol, albümin, Evans Mavi ve yaban turpu peroksidazı) 26. Ayrıca, immünofloresan mikroskopi protein ekspresyonu değişiklikleri araştırmak için kullanılabilirTJ ve hücre adhezyon moleküllerinin hücre lokalizasyonu. sunulmuştur BBB modeli çok basit olsa da, bu şekilde elde edilen sonuçlar daha fizyolojik koşullar altında başka deneyler için değerli bir yönlendirme sağlar. Bu tahliller arasında (bunlarla sınırlı değildir) BBB tam karmaşıklığı hesaba farelerin yaşam içine statik koşullar altında Evans Mavi enjeksiyonu ile in vivo geçirgenliği deneyinde elde edilen TEER ölçümü güzelleştirmek için in vitro kesme akış deneyi.
duyarlı ve güvenilir olmasına rağmen, burada açıklanan yöntem özel ilgiyi hak belirli sınırlamalar vardır. Bizim deney düzeneği ölçülen maksimum TEER değerleri 35-40 değerleri Ωcm 2 ulaşır. Bu TEER değerleri farklı hücre tipleri ve aselüler bileşenleri BBB bütünlüğüne katkıda in vivo, çok daha düşük, ama onlar da TEER in vitro BBB modellerinde bazı diğer elde değerler gibi yüksek değildir <sup> 26,45,46. 49 - Bu belirgin bariyer özelliklerini 27,47 geliştirmek için gösterilmiştir EC ortam, hidrokortizon eklenerek geliştirilebilir. Bununla birlikte, bu maddelerin kullanımı -, anti-enflamatuar ve bağışıklık bastırıcı etkiye sahip olduğu bilinmektedir - tüm fonksiyonel deneyleri için uygun değildir. Bu özel protokolün odak bariyer bütünlüğünün AT-T hücre etkileşimleri sonuçları olduğu gibi, yorumlama hidrokortizon eklenerek engel olacaktır. böylece burada sunulan protokolü kullanılarak EC bariyer disfonksiyonu neden uyarılmış T hücrelerinin gerçek inflamatuar potansiyelinin değerlendirilmesini sağlar. Bu literatürde farklı TEER değerleri doğrudan karşılaştırmalı dikkatli yapılması gerektiğini fazlalaştı. Bu tür değerler deneysel kurulum yüksek ölçüde bağlıdır, bunlar (hücre yoğunlukları, ortam, hücre büyüme alanı ve TEER ölçüm sistemleri tohumlama, farklı hücre tipleri ile elde edilir, örneğin </ Em>, elektrotların tasarım ve boyut).
Nitro BBB modellerinde kompleksi EC uç zarın karşı tarafında perisitlerin ile birlikte kültürlenir burada, oluşturulmuş, daha yakından in vivo durumu taklit etmek amacıyla, ya perisitler ve astrositler kuyu alt yetiştirilen yerlerde 12,25,50 - 52. Bu tip ko-kültür sistemleri, farklı hücre tipleri arasında çapraz konuşma üç ko-kültürler olarak in vitro durumu benzer ve bu nedenle yüksek TEER değerleri sağlayan en olmak bariyerin güçlü gerdirme, sağlar. Bu sistemlerin karmaşıklığı ise, in vitro BBB model olarak daha geniş bir kullanımı bir sınırlama oluşturmaktadır.
Bu modelin bir diğer sınırlaması bariyer bütünlüğünü 53,54 geliştirmek için gösterilmiştir kesme stresi, olmamasıdır. Bu sorunu aşmak için, yeni dinamik BBB modelleri son zamanlarda getirilmiştir: DCS vivo 55,56 mikrovasküler daha yakından taklit eden, içi boş elyaf kültürlenmiş ve pulsatil akış koşullarına tabi tutulurlar.
Özet olarak, bu protokol empedansı spektroskopisi göre BBB in vitro bir model tanımlar. aktive edilmiş T hücreleri ile primer fare beyin endotel hücreleri etkileşimi üzerinde yoğunlaşırken, yöntem, doğrudan temas içinde bariyer özelliklerini incelemek için izin verir. Bu, BBB ensefalitojenik T hücreleri ile EC bir etkileşim sırasında tehlikeye olup, burada çoklu skleroz ve hayvan modeli EAE gibi iltihaplı CNS hastalıklarının gelişiminde önemli adımlar anlaşılması için özel bir önem taşımaktadır. tarif edilen deney, bu tür antikorlar, sitokinler ve T hücre aktivasyonunun inhibitörleri bloke gibi maddelerin geniş kullanarak bu tür bir etkileşim hedef modülasyon sonuçları araştırılmasını mümkün kılar. yöntem, hassas, güvenilir ve non-invaziv bir olduğunuTEER ve CCL nd ölçümleri otomatik moda yapılmaktadır. Tüm bu BBB modelleri zengin gövdesine yeni bir katman daha ekler kullanışlı ve çok yönlü bir araçtır. Özellikle MS gibi otoimmün hastalıklarda gözlenen patofizyolojik koşullarda BBB özellikleri hakkında bilgimizi genişletmek olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz TEER ölçümlerine ilişkin yararlı tartışmalar için Annika ENGBERS ve mükemmel teknik destek için Frank Kurth ve Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) minnettarız. Bu çalışma, HW ve LK, CRC TR128, için SFB1009 proje A03 A08 projeleri Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmiştir; Z1 ve B01 LK ve LK HW ve (Münster Tıp Fakültesi) Klinik Araştırma Disiplinlerarası Merkezi hibe sayısı Kl2 / 2015/14 için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
References
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A.
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S.
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
