Introduction
Blod-hjerne-barrieren skiller den systemiske sirkulasjon fra sentralnervesystemet (CNS) 1 - 3. Det gir en fysisk barriere som hindrer fri bevegelse av celler og diffusjon av vannløselige molekyler og beskytter hjernen mot patogener og potensielt skadelige stoffer. I tillegg til sin barrierefunksjon muliggjør BBB leveringen av oksygen og næringsstoffer til hjernen parenchyma, som sikrer riktig funksjon av den neuronale vev. Funksjonelle egenskaper ved BBB er sterkt regulert av dets cellulære og acellulære komponenter med høyt spesialiserte ECS som sin viktigste strukturelle element. ECS av BBB er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av tett kobling (TJ) komplekser, mangel på fenestrations, ekstremt lav pinocytic aktivitet, og permanent aktive transportmekanismer. Andre komponenter i BBB EU basalmembran, pericytes innebygging endotelet, astrocytic end føtter og = forbundet parienchymal basalmembran også bidra til utvikling, vedlikehold og funksjon av BBB 2,4 - 6, og sammen med nevroner og mikroglia, danner neurovascular enheten (nvu), som muliggjør riktig funksjon av CNS 7 - 9.
I en rekke nevrologiske sykdommer, så som neurodegenerative, inflammatoriske eller infeksjonssykdommer, er funksjonen av BBB kompromittert 2,5,10. Feilregulering av TJ komplekser og molekylære transportmekanismer fører til økt BBB permeabilitet, leukocytter bloduttredelse, betennelser og nerveskader. For å studere BBB eiendommer under slike patofysiologiske forhold, er det etablert ulike in vitro BBB modeller 9,11,12. Sammen har de gitt verdifull innsikt i endringer av barriereintegritet, permeabilitet samt transportmekanismer. Disse modellene benytter endotelceller menneske, mus, rotte, svin eller bsau opprinnelse 13-18; primære endotelceller eller cellelinjer blir dyrket enten som en monokultur eller sammen med pericytes og / eller astrocytter for å etterligne nærmere BBB in vivo 19-25. I de senere år har måling av transendothelial elektrisk motstand (teer) blir et allment akseptert verktøy for å vurdere endotelial barriereegenskaper 26,27.
Teer reflekterer impedansen til den ionefluks gjennom cellenes monolag og dens reduksjon gir et følsomt mål på kompromittert endotelial barriereintegritet og dermed økt permeabilitet. Ulike Teer målesystemer har blitt utviklet, inkludert epithelial Voltohmmeter (EVOM), Elektrisk Cell-substrat Impedance Sensing (ECIS), og real-time celle analyse 15,28 - 30. Teer reflekterer motstand mot ionefluks mellom tilstøtende ECS (paracellulære vei) og er direkte proporsjonal medbarriereintegritet. I impedansspektroskopi 27,31, er kompleks total impedans (Z) målt, noe som gir ytterligere informasjon om barriereintegritet ved å måle Ccl. CCL vedrører den kapasitive strøm gjennom cellemembranen (transcellulær rute): cellelaget fungerer som en kondensator i den tilsvarende strømkrets, separering av de ladninger på begge sider av membranen, og er omvendt proporsjonal med barriereintegritet. Når dyrket på permeable innsatser, egenkapitalbevis holder seg, sprer og spredt over mikro membran. Dette motstår bakgrunnen kapasitiv strøm av innsatsen (som i seg selv fungerer som en kondensator) og fører til en reduksjon i kapasitansen til den når sin minimalt nivå. Dette blir etterfulgt av etablering av TJ komplekser som tetning av rommet mellom tilstøtende ECS. Dette begrenser ion fluks gjennom paracellulære rute, og Teer øker til den når sitt platå. Under inflammatoriske tilstander, men den endothelial barrieren er utsatt: Teer avtar som TJ komplekser bli forstyrret og Ccl øker som den kapasitive komponent av innsatsen stiger igjen.
Vår Teer måling bruker automatiserte celleovervåkning 32 system: det følger prinsippet om impedansspektroskopi og utvider tidligere søknader. Her beskriver vi en in vitro BBB modell som gjør det mulig å studere de barriereegenskaper, blant annet interaksjonen av hjerne endotel med immunceller; særlig aktiverte T-celler. Slike patofysiologiske tilstander blir observert i autoimmune sykdommer i sentralnervesystemet, for eksempel multippel sklerose og dens dyremodell eksperimentell autoimmun encefalomyelitt 33-37. Her er et viktig skritt på sjelevandring av encefalitogene, myelin-spesifikke T-celler på tvers av BBB. Dette etterfølges av deres reaktivering ved perivaskulær plass og inntreden inn i hjernen parenchyma, hvor de rekrutterer andre immunceller og megdiate betennelser og påfølgende demyelinisering 1,35,38. Imidlertid molekylære mekanismer av interaksjonen mellom slike T-celler og endotelceller, de viktigste bestanddeler av BBB, er ikke godt forstått. Vår protokoll som mål å fylle dette gapet, og gi ny innsikt i konsekvensene på endotelceller (dvs. barriere integritet og permeabilitet) ved sin direkte kontakt og komplekst samspill med aktiverte T-celler.
Protokollen er beskrevet her gjør bruk av primærmusehjerne mikrovaskulære endotelceller, dyrket som et monolag på gjennomtrengelige innlegg med mikroporøse membraner. Endotelceller blir ko-dyrket med CD4 + T-celler, noe som kan være pre-aktiveres enten polyclonally eller i en antigen-spesifikk måte. Ko-kultur av MBMECs med pre-aktivert, men ikke naive T-celler induserer en reduksjon i teer og en økning i Ccl, som gir et kvantitativt mål på MBMEC dysfunksjon og barriere avbrudd. teknikkener ikke-invasiv: den bruker innebygd i stedet for chopstick elektroder, som hindrer vesentlig forstyrrelse av EC monolayer; den kan brukes til å overvåke barrierefunksjon uten bruk av cellemarkører. Det gjør kontinuerlige målinger i en automatisert måte og gjør en selvstendig vurdering av de to barriere parametere (Teer og CCL) samtidig over tid. Fremgangsmåten er også følsom nok til å skille mellom forskjellige nivåer av T-celleaktivering og virkninger av slike T-celler på ECS.
Den kan brukes i et bredt spekter av funksjonelle analyser: forskjellige cytokiner og / eller kjemokiner involvert i inflammatoriske prosesser kan tilsettes til ko-kulturen av MBMECs og T-celler; blokkerende antistoffer mot celleadhesjonsmolekyler på enten EC eller T-celle side kan anvendes; og inhibitorer av T-celle-aktiveringsmarkører eller av deres cytolytiske egenskaper kan tilsettes i løpet av T-celle-priming eller deres ko-kultur med ECS. Analysen er også nyttig for T-celle-transmigrasjonassays, så det kan tjene som en kvalitetskontroll av MBMEC monolaget integritet før tilsetning av T-celler. Alt dette gjør denne metoden en allsidig og pålitelig verktøy for å studere BBB in vitro, med en vekt på virkningen av aktiverte T-celler på EC monolag integritet. Dette er av særlig betydning for å forstå mekanismene for BBB avbrudd i patogenesen av autoimmune sykdommer, slik som MS og dens dyremodell EAE, hvor selvreaktive, encefalitogene T-celler krysser BBB og føre til betennelse og neuronal skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For alle forsøk ble mus oppdrettet og holdt under spesifikke patogenfrie forhold i det sentrale dyret anlegget ved University of Münster, ifølge tysk retningslinjer for dyr vare. Alle forsøkene ble utført i henhold til retningslinjene fra dyrestudier etikkomité og godkjent av de lokale myndigheter i Nordrhein-Westfalen, Tyskland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).
1. MBMEC Isolering og kultur
MERK: Isoler MBMECs som tidligere beskrevet i detalj 14 med følgende modifikasjoner:
- Sacrifice 20 voksne C57BL / 6 mus (6-8 uker gamle) av CO 2 innånding og bekrefte sin død ved å konstatere hjerte- og respirasjonsstans.
- Skyll mus med 70% etanol og halshogge den ved hjelp av saks; fjerne hodebunnen ved hjelp av pinsett og saks. Gjør snitt på venstre og høyre side av hodeskallen, fra foramen magnum. Løft skallen fra sin hale side og take ut hjernen med pinsett.
- Under en laminær strømningshette, bruke steril tang for å plassere hjernen i en petriskål og fjerne hjernestammen, lillehjernen, og thalamus, holder bare cortex.
Merk: Bruk av et mikroskop er ikke nødvendig for noen av disse trinnene. - Plasser cortex på et stykke steril Western blotting papir og rull den forsiktig med pinsett til hjernehinnene ikke lenger er synlige.
- Etter mekanisk og enzymatisk fordøyelse (etter protokollen 14), samle endotelceller fra densitetsgradient den ved hjelp av en lang, steril nål og en 5 ml stempelet. Endotelceller fremstå som en skummel lag over den røde ringen med erytrocytter. Overføring 20-25 ml av dette lag inn i en ny 50 ml sentrifugering tube; fylle opp røret med DMEM.
- Etter to runder med vasking 14, resuspender cellene i 6 ml MBMEC medium som inneholdt puromycin (4 ug / ml) og frø dem på seks belagte brønner i en 24-brønners plate; la dem i et vevkultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 (referert til som "inkubator" fra nå av) i tre dager.
MERK: For mer informasjon om MBMEC belegg løsning, se Materialer tabell. - Skift medium ved å tilsette 1 ml til hver brønn av friskt medium uten MBMEC Puromycin; sette platen tilbake ved 37 ° C og 5% CO2 i to dager.
2. Høsting MBMECs
- På dag fem etter MBMEC isolasjon, pre-frakk permeable innsatser med MBMEC belegg løsning: legg til 80 ul oppløsning per innsatsen og la dem ved 37 ° C og 5% CO 2 i 3 timer.
- Nøye pipette ut beleggløsningen og la den innsatser lufttørke i 30 minutter. Tilsett 2 ml romtemperatur (RT) PBS til hver brønn på platen, ved hjelp av MBMECs å vaske mediet; gjenta dette trinnet. Tilsett 0,05% Trypsin-EDTA (300 ul per brønn) og la platen i inkubatoren i 5-10 min.
- Tilsett 2 ml MBMEC medium til hver brønn for å stoppetrypsinering. Overføre de innsamlede celler til et 15 ml rør og sentrifugering sentrifuge dem ved 700 x g i 8 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml MBMEC medium uten puromycin.
- Telle celler; blande 10 ul av cellesuspensjonen med 90 ul av 0,04% trypanblått (10x fortynning av celler). Pipetter 10 mL av denne blandingen mellom glassdekselet og cellen tellekammer (hemocytometer). Telle trypanblått-frie celler i alle fire kvadranter av kammeret (N) og bestemme den gjennomsnittlige antall telte celler (N ') som følger: N' = N / 4.
- Beregn cellekonsentrasjon (i 10 6 celler / ml) ved anvendelse av følgende formel: C = N 'x 10 4 x 10, hvor 10 4 er gitt ved dimensjonene av hemocytometer og 10 er fortynningsfaktoren fra trinn 2.4.
- Seed 2 x 10 4 celler i et volum på 260 ul pr innsats. Legg 810 mL av MBMEC medium til det nedre rom fra hver brønn. Sett platen med innstikk i inkubatoren til den er klar til å fortsette med § 4.
MERK: volumer for øvre og nedre kammeret er insert-spesifikke og fungerer ikke for alle 24-brønners format.
3. CD4 + T Cell Isolering og stimulering
- CD4 + T celleisolasjon
- Ofre en voksen mus (6-8 uker gamle) av CO 2 innånding og bekrefte sin død ved å konstatere hjerte- og respirasjonsstans.
- Plasser musen på ryggen på en ren disseksjon bord og skyll den med 70% etanol; bruke steril saks og pinsett for å åpne peritoneum og fjerne milten og lymfeknutene (lyske, axillaris, brachialis og livmorhals); endelig, overføre vevet inn i et 15 ml rør inneholdende sentrifugering 5 ml PBS på is.
- Under laminær hette, overføre vev ved dekantering PBS med vevet inn i en 50 ml sentrifugering rør med en 70 mikrometer celle sil på toppen; homogenvevet ved å trykke på den med en 1 ml stempelet gjennom silen.
- Tilsett 30 ml FACS-buffer og sentrifuger det ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender cellene i 10 ml FACS-buffer. Filtrer suspensjonen gjennom en 40 um celle sil, tilsett ytterligere 20 ml FACS-buffer til røret.
- Sentrifuger det ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender cellene i 500 ul FACS-buffer.
- Tilsett 20 ul av mus CD4-magnetiske mikroperler, bland godt og inkuber i 15 min ved 4 ° C. Legg 25 ml FACS-buffer og sentrifuger det ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- I mellomtiden, plassere en LS separasjon kolonne i magneten og skyll den med 3 ml FACS buffer. Kast supernatanten og resuspender cellene i 3 ml FACS-buffer.
- Legg celler til kolonnen. Vask kolonnen med 3 ml FACS-buffer tre ganger. Fjern kolonnen fra magneten og plassere den på en ny 15 ml centrisentrifugering tube. Tilsett 5 ml FACS-buffer, spyle ut de merkede celler med kolonne stempelet i sentrifugen og den ved 500 xg i 5 minutter 4 ° C.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 3 ml T-cellemedium. Tell cellene, som beskrevet i 2.4 og frø 1 x 10 5 celler i 100 ul medium per brønn.
- CD4 + T-cellestimulering
- Polyklonalt CD4 + T-cellestimulering
- Pre-coat en rundbunnet 96-brønns plate med renset anti-muse-CD3-antistoff (klon 145-2C11) i PBS, ved en ønsket sluttkonsentrasjon. For eksempel, for å forhånds belegge den fulle plate med α-CD3 ved 1 ug / ml, bland 10 ul av antistoffet (lager konsentrasjon = 0,5 mg / ml) med 5 ml PBS, Vortex og tilsett 50 pl av blandingen for å hver brønn med en multikanal pipette.
- La platen i inkubator i 3 timer. Etter å isolere T-celler, vaske den pre-belagte plate to ganger med PBS. Legg renset anti-CD28-antistoff (klon37,51) for å isolerte T-celler på en ønsket sluttkonsentrasjon (for eksempel ved 1 ug / ml); Bland godt. Seed T-cellene og la dem i inkubatoren i to til tre dager.
- Antigen-spesifikke CD4 + T-cellestimulering med dendrittiske celler (DC)
MERK: Hvis DC brukes som antigenpresenterende celler (APC), følger protokollen for T-celle isolasjon, med disse unntakene:- Før homogenisering av milt, injisere den med 1 ml Collagenase typen IA i PBS ved 0,5 mg / ml og overføre den til et 15 ml rør sentrifugering.
- Inkuber i vannbad ved 37 ° C i 15 min. Etter vasking med PBS, resuspender pelleten i FACS-buffer og tilsett 20 pl muse CD11c magnetiske mikrokuler, i stedet for CD4-mikroperler.
- Bruker en MS separasjonskolonne og de aktuelle volumene: skylle kolonnen med 1 ml FACS-buffer; Resuspender celler i 1 ml FACS-buffer og vask av kolonnen med 1 ml FACS-buffer tre ganger.
- AdD-antigenet av valget til DC (f.eks myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG) aa 35-55 ved 20 ug / ml), bland godt og frø 5 x 10 4 celler i 100 ul av T-cellekulturmedium pr 96-round-bunn- godt.
- Tilsett 1 x 10 5 T-celler i 100 ul av T-cellekulturmedium per 96-rundbunnet-brønnen ved enden, som beskrevet i protokollen for T-celle-isolasjon.
- Antigen-spesifikke CD4 + T-cellestimulering med B-celler
MERK: Hvis B-celler er brukt som APC, følger protokollen for T-celle isolasjon, med disse unntakene:- Bruk milten fra transgene mus som har B-celler er antigen-spesifikke (f.eks avIgH MOG (Th) mus, som har B-celler spesifikt å gjenkjenne MOG 35-55).
- Bruk antigen-spesifikke T-celler (for eksempel fra TCR MOG (2D2) mus). Tilsett 20 ul av mus CD19-magnetiske mikrokuler i stedet for CD4-mikroperler.
- Tilsett antigen av valget til B cells (f.eks MOG 35-55 ved 20 ug / ml), bland godt og frø 5 x 10 4 celler i 100 ul av B-cellekulturmedium per 96-rundbunnet-brønnen.
- Tilsett 1 x 10 5 T-celler i 100 ul av T-cellekulturmedium per 96-rundbunnet-brønnen, som beskrevet i protokollen for T-celle-isolasjon.
- Polyklonalt CD4 + T-cellestimulering
4. Sette opp og Performing Teer måling
- Plasser 24-brønnen modul av Teer instrument under laminær hette. Fjern lokket og plassere innsatser med MBMECs i instrumentet med tang.
- Pipettere 810 ul friskt medium til det nedre rom av modul brønnene: legge til det forsiktig mellom innsatsen og den vegg av modulen brønnen.
- Lukk dekslene og plassere instrumentet i inkubatoren. Koble instrumentet til sin datamaskin; slå på instrumentet kontrolleren og åpne programvaren.
- Velg "ny måling" i pop-up vindu. Check 'vis Teer "og" showet CCL' boksen; Trykk deretter på "Start". Etter å ha fullført den første målingen, velg "sjekke alle brønner 'i' resultater 'kategorien for å se alle Teer og CCL verdier.
- Lagre filen: Fil> Lagre som> "navnet på filen '.
MERK: Som Teer og Ccl kontinuerlig målt i en automatisert måte, overvåke deres verdier over en periode på tre til fem dager. Endring av mediet ikke er nødvendig, med mindre celleviabilitet er suboptimal, som visualisert ved en manglende økning i teer. - Velg tidspunkt å co-kultur MBMECs med T-celler når Ccl er stabil og lavere enn 1 uF / cm 2 og Teer har nådd sitt høyeste nivå.
- inspisere absolutte Teer og CCL verdier nøye og inkluderer alle brønnene som MBMECs ikke har utviklet sammenflytende nok monolag ved å fjerne slike brønner.
- Gruppe resten av brønnene: høyreklikk på et godt og velg "legg godt til ny gjennomsnittlig godt '. Name det i pop-up vindu; gjøre det samme for alle individuelle brønner som skal grupperes.
- Sjekk alle gjennomsnittlig brønner for å bekrefte at alle av dem har samme startbetingelsene før co-kulturen. Hvis noen har vesentlig forskjellige absolutte Teer verdier eller Teer skråninger, eller standard feil er for stor, gjenta gruppering.
MERK: Den optimale gruppering av brønner gir minimal variasjon i Teer verdier, både innen og mellom eksperimentelle grupper. - I "eksperiment" fanen, trykk "pause", koble instrumentet og ta den ut av inkubatoren. Fjern lokkene under laminær hette.
- Fremstille pre-aktivert og / eller naive T-celler, med eller uten spesifikke cytokiner, antistoffer eller andre stoffer, som ønsket: For eksempel: bland renset NA / LE rotte-anti-muse-IFN-γ antistoff (klon XGM1.2) med klare T -celler, ved 20 ug / ml per brønn av den teer instrumentet.
MERK: Hvis stoffer som granzyme B-hemmer blir brukt, er de endded til T-cellekulturen ved begynnelsen av T-celle stimulering: for eksempel, er granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) blandet med isolerte T-celler ved en sluttkonsentrasjon på 10 uM i DMSO. Se Materialer og utstyr for flere detaljer. - Fjern noe av mediet fra innsatsen (øvre vel rommet): f.eks nøye pipette ut 150 ul (fjerne all medium bør unngås da det kan forstyrre MBMEC monolayer).
- Legg T-celler til MBMECs ved forsiktig pipettering av 150 ul medium inneholdende 2 x 10 5 celler / insert.
MERK: Når høsting pre-aktiverte T-celler, teller bare sprengning, trypanblått-frie celler. - Lukk dekslene og plassere instrumentet tilbake til inkubatoren. Koble instrumentet og trykk 'måling CV'. Etter 24 timer trykke "stopp" i "eksperiment" -fanen og lagre filen (File> Save).
5. Data Export and Statistical Analysis
- Eksportere resultatene ved å velge Fil> Eksporter.
- I "Innstillinger" -kategorien av pop-up vindu, velger du "DOT" i "desimaltegn" og "tabulator" i "feltet delimiter" alternativet.
- I "eksportere resultater" -kategorien, gi filen et navn, sjekk alle brønnene som skal eksporteres, og sjekke "Teer" og "CCL" boksene i "velge data" alternativet.
- Trykk "eksportere data," åpne den eksporterte filen, og kopiere dataene til et regneark.
- Normal de eksporterte dataene (sortert etter hvert replikat, med Teer og CCL verdier gitt for hvert løp (måling)): Set Teer og CCL verdier av det siste tidspunkt før co-kultur til 100% og endres tilsvarende verdiene for alle andre løyper, i forhold til "100%" kjøre.
- Kopier normaliserte data til en programvare for valg for å generere en graf, ved bruk av individuelle brønner og viser standardavvik av gjennomsnittet for hver behandlingsgruppe.
- Perform Toveis ANOVA statistisk test med en Bonferroni korreksjon for multiple sammenligninger ved hjelp av statistisk programvare av valget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 gir en generell oversikt over in vitro BBB modell for å studere interaksjonen mellom T-celler og endotelceller. Eksperimentet består av tre store skritt. Det første trinnet er isolering av primære MBMECs fra hjerne cortices, og deres kultur i fem dager. Når de når konfluens i cellekulturplaten, har MBMECs trypsinisert og sådd på nytt på gjennomtrengelige innlegg, som deretter plasseres i den teer instrument. Den Teer og Ccl av MBMECs kontinuerlig målt og overvåket over en periode på tre til fem dager. I mellomtiden, T-celler isoleres, stimulert (trinn 2), og dyrket i to til fem dager, type og styrke av stimulus. I trinn tre, er T-celler tilsatt og co-dyrket med MBMECs når Ccl er på et stabilt lavt nivå og Teer er på sitt høyeste nivå. Ved å velge dette tidspunkt for co-kulturen når Teer er fortsatt på sitt platå er avgjørende for suksessav hele målingen. Således er det svært viktig at tidspunktet for T-celle isolasjon og stimuleringen er nøye valgt slik at T-cellene når det ønskede nivået av aktivering ved tidspunktet for deres tilsetning til ECS. Etter tilsetning av T-celler, blir målingen gjenopptatt for en mer dag og resultatene er analysert.
Etter den første fem-dagers kultur, MBMECs vise lett karakteristisk spindel-formet morfologi (Figur 2A, venstre panel) og uttrykke endothelial celle-spesifikke markører som PECAM-en og claudin-5 (figur 2A, midtre og høyre panel). Men dette alene ikke gir tilstrekkelig bevis for deres komplette samløpet og riktig barriereintegritet. Impedans-spektroskopi, på den annen side gir et godt estimat på monolaget integritet og tjener som en kvalitetskontroll for hver brønn før utførelsen av en funksjonell analyse. I figur 2B, de fleste avbrønner inneholdt MBMECs som CCL verdiene var stabil og lav, og deres Teer verdier nådd et platå. Disse brønner ble anvendt for etterfølgende ko-kultur-eksperimenter. De ble gruppert på en slik måte at avvik innenfor og mellom gruppene var minimal før tilsetning av T-celler (Figur 2C). Brønnene som teer verdier signifikant forskjellig fra resten (for eksempel blå kurven vist i figur 2B) var ikke brukes, da de ville føre til tvetydige resultater eller feiltolking av dataene.
Forutsatt at innledende krav til MBMEC kultur og T-celle stimulering er oppfylt, kan impedansspektroskopi gi verdifull innsikt i T-celle-EC interaksjon. Teer målingen kan tjene som den primære avlesning for en slik interaksjon og et mål på T-celle-mediert EC dysfunksjon, slik som vist i figur 3A og 3B. I dette tilfellet er MBMECs dyrket på innsatser med mikroporer 0,4pm i diameter, noe som ikke tillater T-celler til å passere gjennom innsatsen membranen. Figur 3A viser at bare stimulerte, men ikke naive T-celler er i stand til å indusere EC dysfunksjon, som bestemt ved en reduksjon i teer og økning i Ccl. Naive T-celler kan således tjene som en negativ kontroll, ettersom teer og Ccl i ko-kultur med naive T-celler bo på deres opprinnelige nivåer. Unntaket er topp helt i begynnelsen av co-kultur, forårsaket av håndtering av instrument (løfte lokkene, og legger nytt medium med celler som kan ha litt forskjellige temperaturer og pH-verdier, og lukke lokkene). Denne gjenstanden vises med alle typer Teer målinger og ignoreres under analysen. Tilsetningen av de pro-inflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-a (ved 100-500 U / ml), som er kjent for å være i stand til å indusere EC inflammasjon, kan anvendes som positiv kontroll. I figur 3A, MOG 35-55-spesifikke CD4
For å undersøke mekanismene for den beskrevne MBMEC mono avbrudd, kan ulike tilnærminger brukes. Resultatene i figur 3C viser at de stimulerte T-celler, men ikke deres supernatanter forårsaket en betydelig skade på MBMECs, noe som indikerer at direkte kontakt mellom T-celler og MBMECs er kritisk for barriere avbrudd. Videre er tilsetning av et nøytraliserende α-IFN-γ antistoff under målingen teer bare litt bedre MBMEC barriereegenskaper, noe som tyder på at IFN-γ ikke kan være den primære årsaken til forstyrrelsen. På den annen side, legger granzyme B Inhibitor II T cellekultur (figur 3D) restaurert MBMEC integritet i større grad, og pekte på dette cytolytisk molekylet som en viktig aktør i forårsaker MBMEC skade og påfølgende reduksjon i Teer.
I tillegg til dens bruk som en primær avlesning for virkningen av T-celler på EC monolaget integritet, kan teer måling også bli brukt som en kvalitetskontroll av barriereintegritet før andre analyser, så som T-celle-transmigrasjon assay. I dette tilfellet setter inn med mikroporer av 3 um i diameter blir brukt. I figur 3E, ble teer målinger utført for å sikre at MBMEC monolag var av den samme grad av integritet i alle brønner før tilsetningen av T-celler for etterfølgende transmigration analysen. Dette ble etterfulgt av høsting av T-celler fra den nedre avdeling av instrument brønnene, farving T-celler med α-CD4-antistoff og flowcytometrisk analyse, ved hjelp av celletellings kuler for å bestemme absolutte tall av transmigrated T-celler; vist i figur 3E, midtre og høyre). Merk som stimulerte T-celler som brukes for sjele ikke føre til en betydelig reduksjon i Teer, selv om de var pre-aktivert som i figur 3A. Dette kan reflektere transcellular ruten immunceller kan bruke i løpet av sjelevandring, som har blitt observert tidligere 39. I figur 3F, ble halvparten av brønnene med MBMECs betent med IFN-γ og TNF-α (uninflamed vs. Betent), og senere, naive T-celler ble tilsatt for vurdering av transmigratory aktivitet. I dette tilfellet, Teer måling ga en anelse om hvor sterk betennelse med cytokiner var, og når T-celler bør legges til transmigration.
Figur 4 viser noen av de mest vanlige situasjoner som kan føre til feiltolking av Teer resultater. På figur 4A, for eksempel ikke alle MBMECs utviklet et fullstendig konfluent monolag på samme tid. En av gruppene ( 'naive T-celler - ekskludert') inneholdt MBMECs som TJ komplekser ble modning i et annet tempo enn de andre gruppene like før tillegg av T-celler. Denne gruppen følgelig utviklet teer verdier over 100% i løpet av eksperimentet og ble utelukket fra videre analyse. Således er helningen på kurven teer (rate of TJ modning) før forsøket så viktig som absolutte verdier teer for riktig tolkning av data. Figur 4B viser at start av ko-kulturen ikke bare for tidlig, men også for sent kan føre til falske resultater. Her, både i gruppen med stimulerte T-celler og den negative kontrollgruppen (medium Change) har teer verdier allerede passert sin platå og begynte å avta uavhengig av den eksperimentelle tilstand, dermed indikerer suboptimale dyrkingsbetingelser før og under forsøket. Slike grupper bør ikke inkluderes i analysen. Til slutt, selv om teer og Ccl vanligvis endre deres verdier på en slik måte at en større reduksjon i teer er ledsaget av en større økning i Ccl, kan dette ikke alltid være tilfelle. I figur 4C, stimulerte T-celler B forårsaket en større nedgang i Teer, men en mindre økning i Ccl enn stimulerte T-celler A gjorde.
Figur 1: Samlet oversikt over teknikken. Etter den første kultur, MBMECs reseeded på permeable innsatser og plasseres i den automatiserte celle skjermen; Teer og Ccl måles hver time i 4-5 dager. I mellomtiden blir T-celler aktivert in vitro 40. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: MBMECs utvikle et konfluent monolag er egnet for en in vitro-modell BBB. (A) Spindel-form morfologi (venstre) og immunofluorescerende farging av PECAM-1 (i midten) og claudin-5 (høyre) fem dager etter MBMEC isolasjon. (B og C) teer og CCL-verdier før (B) og etter (C) gruppering av individuelle brønner før to tilsetting av T-celler. Den blå kurven i (B) er ikke brukt for forsøket, ettersom MBMECs i denne brønnen ikke har utviklet teer så høy som i de andre brønnene. Data i (C) viser gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative resultater. (AD) Endringer i Teer som en primær mål på MBMEC dysfunksjon ved interaksjon med T-celler. (A) MOG-spesifikke T-celler ble aktivert med MOG-spesifikke B-celler i nærvær av MOG 35-55 peptidet i fem dager. Naive T-celler og pro-inflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-a (begge ved 100 U / ml) tjente som en negativ og positiv kontroll, respektivt. (B) T-celler ble stimulert med α-CD3 og α-CD28 antistoff (1 ug / ml hver) i to eller tre dager, som angitt, før tilsetning av dem til MBMECs. (C) T-celler (pre-aktivert som i (A)) eller deres supernatanter, i nærvær av α-IFN-γ antistoff eller det tilsvarende isotypekontroll. (D) T-celler (pre-aktivert som i (B)) i to dager, i nærvær av granzyme B inhibitor II eller dets fortynningsmiddel DMSO. (E og F) Teer måling bare brukes som en kvalitetskontroll for barriereintegritet før T-celle sjelevandring. MBMECs ble dyrket på innsatser med porer av 3 um i diameter. (E) T-celler, stimulert som beskrevet i (A), ble la til transmigrere i 18 timer (til venstre). Deretter ble de høstet, beiset for α-CD4 antistoff (klone RM4-4) og analysert ved flowcytometri, ved hjelp av celletelling perler (midten og høyre). (F)Overvåking av MBMEC monolaget integritet ved stimulering med IFN-γ og TNF-α, og velge riktig tidspunkt for etterfølgende tilsetning av T-celler for transmigrasjon analysen. (AF) Resultatene viser tekniske triplicates og er representative for tre uavhengige eksperimenter hver. Data viser gjennomsnitt ± SEM. (E, høyre) Uparet, tosidige Student t-test. ** P <0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Praktiske hensyn og tolking. (A) MBMECs fra en eksperimentell gruppe (rød kurve) ble ekskludert fra analysen, siden hastigheten av modningen av de synaptiske komplekser ble forskjellig i forhold til andre groups. (B) Et eksempel på å legge til T-celler for sent, som hindret skikkelig vurdering av MBMEC dysfunksjon. (C) Ved avbrudd av stimulerte T-celler 'A' (svart kurve), CCI verdier av MBMECs viste en mer dramatisk økning enn det som ville være ventet fra den samtidig reduksjon i teer forårsaket av de samme T-celler. (AC) T-celler ble stimulert med α-CD3 og α-CD28-antistoffer (1 pg / ml hver) i to dager. Resultatene viser tekniske triplicates og er representative for tre uavhengige eksperimenter hver. Data viser gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere trinn i den beskrevne protokoll er avgjørende for en vellykket eksperiment. Under den første MBMEC isolasjon og kultur, er det avgjørende at arbeidet utføres under sterile betingelser så mye som mulig, for å hindre forurensning av cellekulturen med soppsporer og bakterier. For å oppnå en ren kultur av ECS, anbefales det å bruke et medium som inneholdt puromycin for de første tre dagene, som muliggjør overlevelse av ECS, men ikke på andre celletyper (særlig pericytes) 41,42. Et annet kritisk punkt som fortjener spesiell oppmerksomhet er identifisering av riktig tidspunkt for å legge til pre-aktiverte T-celler. I løpet av første 48 timer av Teer måle MBMECs sprer på permeable innsatser og lukke gapene mellom hverandre. Derfor, Ccl avtar inntil den når en stabil og lavt nivå (omkring 0,6 uF / cm 2). Dette er det første tegnet på en konfluent EC enkeltlag, men er likevel ikke et tegn på et stramt barriere. Bare etterCCL har nådd et stabilt nivå gjør teer begynne å øke. Når TJ komplekser fullt dannet og EF-barrieren er helt avsperret, når Teer sitt maksimale nivå. Dette platå er som regel tilfelle tre til fem dager etter reseeding ECS og blir opprettholdt i ytterligere 24 til 36 timer. Det beste tidspunkt for tilsetning av T-celler er i begynnelsen av platået, som sikrer at ECS fremdeles er levedyktig nok til å bli ko-dyrket med T-cellene. Som T-celleaktivering må settes i gang før det optimale tidspunkt for ko-kultur kan forutsies med sikkerhet, kan det være fordelaktig å stimulere to grupper av T-celler på to forskjellige dager for å øke fleksibiliteten i dette tidspunktet. Til slutt, må gruppering av individuelle replikate brønner før tilsetning av T-celler til de MBMECs må gjøres på en slik måte at variasjonen innenfor og mellom gruppene er minimal. Dette sikrer at startbetingelsene er lik blant alle grupper under ko-kultur av T-celler og MBMECs. Vår protokollen beskriver Teer måling under co-kultur av muse hjernen egenkapitalbevis med pre-aktiverte CD4 + T-celler. Dens enkle formen tillater flere modifikasjoner, i henhold til de vitenskapelige behov. For eksempel kan den type, styrke og varighet av stimulus varieres. Antigen-spesifikke CD4 + T-celler kan aktiveres ved deres beslektet antigen, i nærvær av egnede antigen-presenterende celler (APC); Alternativt kan T-celler bli polyclonally aktiveres ved α-CD3 og α-CD28-antistoffer. Aktiveringsstatusen T-celle kan moduleres ved hjelp av forskjellige cytokiner, blokkerende antistoffer, inhibitorer. Skifte primære hjerneegenkapitalbevis med endothelial cellelinjer er ikke anbefalt, men som det er kjent at sistnevnte viser mindre restriktiv TJ komplekser og høyere permeabilitet i forhold til de primære celler 43. I tillegg til å måle teer som den primære avlesning, gir denne protokollen en god kvalitetskontroll av EC monolayeh integritet før den T-celle-transmigrasjon analysen (figur 3E, F). Av notatet, kan Teer verdier ikke nødvendigvis avta i løpet av sjelevandring av T-celler på tvers av MBMECs (Figur 3E): dette kan reflektere transcellular ruten immunceller kan bruke under sjelevandring, som har blitt observert tidligere 39,44.
Som aktiverte T-celler induserer EC dysfunksjon ved co-kultur, viser Teer en jevn, forutsigbar nedgang, sammenlignes på tvers av eksperimenter med de samme betingelsene. En større reduksjon i Teer er vanligvis ledsaget av en større samtidig økning i Ccl. I sjeldne tilfeller kan imidlertid en økning i Ccl kan bli større enn det ville være forventet fra den tilsvarende nedgang i teer (figur 4C). Dette avviket kan gjenspeile ulike sider ved EC mono avbrudd. Som ECS prøver å lukke hullene dannet under barrieren avbrudd, kan de gjennomgå dynamiske endringer imorfologi og motilitet som danner utstikkende deler og øke deres totale overflateareal, som alle kan bidra til en dramatisk og rask økning i Ccl. Dette gjør endringer i Ccl mindre forutsigbar i forhold til endringer i Teer. Således er graden av reduksjon i teer er fortsatt den mest pålitelige og representative mål for kompromittert barriereintegritet.
Denne analysen kan suppleres med andre teknikker for å undersøke endoteliale barriere egenskaper. Det kan bli etterfulgt av en permeabilitet analyse som måler mengden av molekyler av forskjellige størrelser som diffunderer gjennom avbrutt EC monolaget 44. For dette formål kan fluorescensmerkede dextran-konjugater, for eksempel fluorescein og Texas Rød benyttes; andre molekylære markører er også tilgjengelig (for eksempel sukrose, mannitol, albumin, Evans blå og pepperrot peroksidase) 26. Videre kan immunofluorescens-mikroskopi brukes for å undersøke endringene i proteinekspresjonenog den cellulære lokalisering av TJ og celleadhesjonsmolekyler. Selv om den presenterte BBB-modellen er meget enkel, kan resultatene oppnådd med det tilveiebringe verdifull orientering for ytterligere analyser i henhold til flere fysiologiske betingelser. Slike analyser inkluderer (men er ikke begrenset til) in vitro skjærstrømning assay for å komplettere teer målinger oppnådd under statiske betingelser og in vivo permeabilitet analysen med Evans Blue-injeksjon inn i levende mus for å ta hensyn til den fulle kompleksitet av BBB.
Selv om følsom og pålitelig og fremgangsmåten som er beskrevet her har visse begrensninger som fortjener spesiell oppmerksomhet. De maksimale Teer verdiene som er målt i vår eksperimentelle oppsettet når verdiene av 35-40 Qcm to. Disse Teer verdier er mye lavere enn in vivo, hvor forskjellige celletyper og acellulære komponenter bidrar til integriteten av BBB, men de er heller ikke så høy som teer-verdier oppnådd i en annen in vitro-modeller BBB <sup> 26,45,46. Dette kan forbedres ved tilsetning av hydrokortison til EF-medium, noe som har vist seg å betydelig forbedre barriereegenskaper 27,47 - 49. Men bruk av slike stoffer - er ikke egnet for alle funksjonelle analyser - kjent for å ha anti-inflammatoriske og immunundertrykkende effekter. Som fokus for denne protokollen er på konsekvensene av EC-T-celle-interaksjoner på barriereintegritet, ville tolkning bli hemmet ved tilsetning av hydrokortison. Ved anvendelse av protokollen som presenteres her således muliggjør evaluering av den sanne inflammatoriske potensialet av stimulerte T-celler til å forårsake EC barriere dysfunksjon. Det er også verdt å merke seg at direkte sammenligning av ulike Teer verdier som er rapportert i litteraturen bør gjøres med forsiktighet. Slike verdier er svært avhengig av det eksperimentelle oppsettet, de fås med ulike celletyper, såing celletettheter, media, cellevekstområder, og Teer målesystemer (f.eks </ Em>, utformingen og størrelsen av elektrodene).
For å etterligne in vivo situasjonen nærmere, kompleks in vitro BBB-modeller har blitt etablert, hvor ECS er ko-dyrket med pericytes på den motstående side av innlegget membranen, eller hvor pericytes og astrocytter er dyrket på bunnen av brønnene 12,25,50 - 52. I slike co-kultur-systemer, krysstale mellom ulike celletyper muliggjør sterkere innstramming av barrieren, med trippel co-kulturer å være den beste i ligner in vivo situasjonen og dermed gi de høyeste Teer verdier. Kompleksiteten av disse systemer på den annen side, utgjør en begrensning i deres bredere anvendelse som in vitro-modeller BBB.
En annen begrensning ved denne modellen er mangelen på skjærspenningen, som har vist seg å forbedre barriereintegritet 53,54. For å bøte på dette problemet, har nye dynamiske BBB modeller nylig blitt introdusert: ECs dyrkes i hule fibre og utsatt for pulserende strømning betingelser, etterligne nærmere mikrovaskulaturen in vivo 55,56.
Oppsummert denne protokollen beskriver en in vitro modell av BBB basert på impedans-spektroskopi. Med fokus på interaksjonen av primærmusehjerne endotelceller med aktiverte T-celler, gjør det mulig metode for å studere barriereegenskapene i løpet av en slik direkte kontakt. Dette er av særlig betydning for å forstå de avgjørende skritt i utviklingen av inflammatoriske CNS-sykdommer så som multippel sklerose og dens dyremodell EAE, karakterisert ved at BBB er kompromittert i løpet av en interaksjon av ECS med encefalitogene T-celler. Den beskrevne analysen muliggjør undersøkelse av konsekvensene av en målrettet modulering av en slik interaksjon ved hjelp av en lang rekke stoffer som blokkerende antistoffer, cytokiner og inhibitorer av T-celleaktivering. Metoden er følsom, pålitelig og ikke-invasiv ennd målinger av Teer og Ccl utføres i en automatisert måte. Alt dette gjør det til et nyttig og allsidig verktøy som legger et nytt lag til fyldig BBB-modeller. Det kan spesielt utvide vår kunnskap om BBB egenskaper under patofysiologiske forhold observert i autoimmune sykdommer som MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Annika Engbers og Frank Kurth for deres utmerkede teknisk støtte og Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) for nyttige diskusjoner om Teer målinger. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 prosjekt A03 til HW og LK, CRC TR128, prosjekter A08; Z1 og B01 til LK og HW, og Tverrfaglig Senter for klinisk forskning (Medisinsk fakultet Münster) stipend antall KL2 / 2015/14 til LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
References
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A.
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S.
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
