Introduction
3 -血液脳関門は、中枢神経系（CNS）1から全身循環を分離します。それは、細胞の自由な移動と水溶性の分子の拡散を抑制し、病原体および潜在的に有害な物質から脳を保護する物理的障壁を提供します。そのバリア機能に加えて、BBBは、神経組織の適切な機能を確実に脳実質に酸素や栄養素の配信を可能にします。 BBBの機能特性は、高度に専門性の高い電気部品は、その主要構成要素であると、その細胞および無細胞成分によって規制されています。 BBBの電気部品は、タイトジャンクション（TJ）錯体、開窓の欠如、非常に低いピノサイトーシスの活動、および恒久的に能動輸送機構が存在することを特徴とします。 BBBの他の成分EC基底膜、内皮を埋め込む周皮細胞、アストロサイトのエンドフィート=関連するパーenchymal基底膜はまた、BBB 2,4の開発、保守および機能に寄与- 6と、一緒にニューロンおよびミクログリアで、CNS 7を適切に機能可能に神経血管ユニット（NVU）、形成- 9。
このような神経変性、炎症や感染症などの神経疾患、種々のでは、BBBの機能が2,5,10損なわれています。 TJ複合体および分子輸送機構の調節不全は、BBBの透過性、白血球の血管外遊出、炎症および神経損傷の増加につながります。そのような病態生理学的条件下で、BBBの特性を研究するために、様々なインビトロ BBBモデルは9,11,12が確立されています。彼らは一緒に障壁の完全性、透過性だけでなく、輸送機構の変化に貴重な洞察を提供してきました。これらのモデルは、ヒト、マウス、ラット、ブタまたはBの内皮細胞を用いますヒツジの原点13から18; 25 -初代内皮細胞または細胞株は、モノカルチャーとして、あるいは一緒に生体内 19 でより密接にBBBを模倣するために、周皮細胞および/またはアストロサイトのいずれかで培養されます。近年では、経内皮電気抵抗（TEER）の測定は、内皮バリア特性26,27を評価するための広く受け入れられているツールとなっています。
TEERは、細胞単層を横切るイオンフラックスに対するインピーダンスを反映し、その減少が損なわ内皮障壁の完全性、したがって透過性の増大の敏感な尺度を提供します。 30 -様々なTEER測定システムは、上皮Voltohmmeter（EVOM）、電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）、リアルタイム細胞解析15,28を含む、開発されてきました。 TEERは、隣接するECの間のイオンフラックス（傍細胞経路）に対する抵抗性を反映し、に直接比例しています関門の完全性。インピーダンス分光法27,31においては、複素合計インピーダンス（Z）は、CCLを測定することによって、障壁の完全性についての追加情報を提供する、測定されます。 CCLは、細胞膜（経細胞経路）を介して容量性電流に関する：細胞層は、膜の両側での電荷分離、等価電気回路におけるコンデンサと同様に機能し、障壁の完全性に反比例します。透過性インサート上で成長させた場合には、ECが、付着増殖し、微多孔膜に広がります。これは、（それ自体がコンデンサのように作用する）のインサートのバックグラウンド容量性電流に抵抗し、その最低レベルに達するまでの容量の低下を招きます。これは、TJの確立隣接する電気部品との間のスペースからそのシールを複合体が続いています。これは、傍細胞経路を介してイオン流束を制限し、そしてそれがそのプラトーに達するまでTEERが増加します。炎症状態下で、しかし、endotheliアル障壁が侵害された：TJが破壊を取得複合体およびインサートの容量成分が再び上昇するとCCLが増加するにつれて、TEERは減少します。
私たちのTEERの測定は、自動化されたセル監視32システムを使用しています。それは、インピーダンス分光法の原理に従っており、その前のアプリケーションを拡張します。ここでは、免疫細胞と脳内皮の相互作用を含むバリア性の研究を可能にインビトロ BBBモデルを記述します。特に、T細胞を活性化します。 37 -このような病態生理学的状態は、多発性硬化症およびその動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎33のようなCNSの自己免疫疾患において観察されます。ここで、重要なステップは、BBBを横切る脳炎誘発性、ミエリン特異的T細胞の遊出があります。これは、それらが他の免疫細胞を動員し、私血管周囲空間と脳実質への参入、中にそれらの再活性化が続いていますdiate炎症およびその後の脱髄1,35,38。しかしながら、このようなT細胞と内皮細胞との相互作用の分子機構は、BBBの主な成分は、よく理解されていません。私たちのプロトコルは、このギャップを埋め、活性化T細胞との直接接触との複雑な相互作用の際に内皮細胞（ すなわち、障壁の完全性と透過性）に影響新たな洞察を与えることを目指しています。
ここで説明するプロトコルは、微多孔膜と通気性のインサート上の単層として成長した初代マウス脳微小血管内皮細胞を利用します。内皮細胞を、ポリクローナルまたは抗原特異的な様式で予備活性化することができるCD4 + T細胞と共培養されます。予め活性化とMBMECsの共培養ではなく、ナイーブT細胞TEERの低下やMBMEC機能障害およびバリア破壊の定量的な尺度を提供するCCLの増加を誘導します。技術非侵襲的である：それは、EC単層の主要な乱れを防ぐビルトインの代わりに箸電極を、使用しています。細胞マーカーを使用することなく、バリア機能を監視するために使用することができます。これは、自動化された方法で連続測定を行うと同時に、時間をかけて2バリアパラメータ（TEERとCCL）の独立した評価を可能にします。この方法はまた、別のT細胞活性化のレベルとのECのようなT細胞の効果を区別するのに十分な感度です。
これは、機能的アッセイの広い範囲で使用することができる：炎症プロセスに関与する種々のサイトカインおよび/またはケモカインはMBMECs及びT細胞の共培養物に添加することができます。 ECまたはT細胞側のいずれかの細胞接着分子に対するブロッキング抗体を使用することができます。およびT細胞活性化マーカーの、またはそれらの細胞傷害特性の阻害剤は、T細胞プライミングまたは電気部品との共培養の間に添加することができます。アッセイはまた、T細胞の遊出するのに便利ですこれはT細胞の添加前にMBMEC単層の完全性の品質管理としての役割を果たすことができるようにアッセイ。このすべてが、この方法EC単層の完全性に活性化T細胞の効果に焦点を当てて、in vitroで BBBを研究するための汎用性と信頼性の高いツールになります。これは、自己反応、脳炎誘発性T細胞がBBBを横断し、炎症および神経損傷を引き起こすMS、その動物モデルEAEなどの自己免疫疾患の病因にBBB破壊のメカニズムを理解するために特に重要です。
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Protocol
動物のケアのためのドイツのガイドラインに従って、すべての実験のために、マウスを交配したとミュンスター大学の中央動物施設における特定の病原体を含まない条件下で維持しました。全ての実験は、動物実験倫理委員会のガイドラインに従って行われ、ノルトライン=ヴェストファーレン州、ドイツ（LANUV、AZ 84-02.05.20.12.217）の地方当局によって承認されました。
1. MBMEC単離および培養
注：以前に以下のように変更して詳細14に記載されているようにMBMECsを分離：
- CO 2吸入によって20成人（6〜8週齢）C57BL / 6マウスを生け贄に捧げる、心と呼吸停止を確認することによって彼らの死を確認します。
- 70％エタノールでマウスをすすぎ、はさみを使用してそれを刎ねます。ピンセットやハサミを使って頭皮を削除します。大後頭孔から出発し、頭蓋骨の左側と右側の切開を行います。その尾側とTAKから頭蓋骨を持ち上げ鉗子で脳を電子。
- 層流フードの下では、唯一の皮質を保ち、ペトリ皿に脳を置き、脳幹、小脳、及び視床を除去するために滅菌ピンセットを使用しています。
注：顕微鏡の使用は、これらのステップのいずれかのために必要ではありません。 - 無菌ウェスタンブロッティング一枚の紙の上に皮質を置き、髄膜が見えなくなるまでピンセットで軽く転がしていません。
- （プロトコル14以下）機械的および酵素消化した後、長い間、滅菌針と5ミリリットルのプランジャーを使用して密度勾配から内皮細胞を収集します。内皮細胞は、赤血球と赤いリング上記の濁った層として表示されます。新しい50ミリリットルの遠心分離管に、この層20〜25ミリリットル転送。 DMEMでチューブをトップアップ。
- 洗濯14 2ラウンドの後、ピューロマイシンを含むMBMEC培地（4 / mlの）の6ミリリットル中に細胞を再懸濁し、24ウェルプレートの6コーティングされたウェル上にそれらをシード。組織でそれらを残します3日間（ここでは上から「インキュベータ」という）37℃、5％CO 2で培養インキュベーター。
注：MBMEC塗布液の詳細については、 材料表を参照してください。 - ピューロマイシンを含まない新鮮なMBMEC媒体の各ウェルに1ミリリットルを追加することで、メディアを変更します。 2日以上のために戻って37℃、5％CO 2のプレートを置きます。
2.収穫MBMECs
- MBMEC分離後の5日目、MBMECコーティング溶液でプレコート透過性インサートは：3時間インサートあたりの溶液80μlを添加し、37℃でそれらを残す、5％CO 2。
- 慎重にコーティング溶液をピペットし、30分間のインサートの空気乾燥をしましょう。培地を洗浄するためにMBMECsを使用して、プレートの各ウェルに室温（RT）PBSの2ミリリットルを追加します。この手順を繰り返します。 0.05％トリプシン-EDTA（ウェルあたり300μl）を加え、5〜10分間インキュベーターでプレートを残します。
- 停止するために各ウェルにMBMEC培地2mlを追加トリプシン処理。 15ミリリットルの遠心分離管に採取した細胞を移し、4℃で8分間、700×gで、それらを遠心分離します。上清を捨て、ピューロマイシンなしMBMEC培地1mlに細胞を懸濁します。
- 細胞を数えます。 0.04％トリパンブルー（細胞の10倍希釈）の90μlの10μlの細胞懸濁液を混ぜます。ピペットガラスカバーと細胞計数室（血球計数器）の間、この混合物10μl。チャンバー（N）のすべての4つの象限でのトリパンブルーを含まない細胞をカウントし、カウントした細胞（N '）の平均数を決定し、次のように：N' = N / 4。
- C = N 10 4は、血球計算板の寸法によって与えられ、10は、ステップ2.4からの希釈係数である「×10 4×10、次の式を用いて（10 6細胞/ ml）で細胞濃度を計算します。
- シードインサートあたり260μlの量の2×10 4個の細胞。各ウェルの下部コンパートメントにMBMEC媒体の810μLを追加。セクション4を続行する準備ができるまでインキュベーター中に挿入して、プレートを置きます。
注：上部と下部コンパートメントのためのボリュームが挿入に固有のものであり、全ての24ウェルフォーマットには対応していません。
3. CD4 + T細胞の単離と刺激
- CD4 + T細胞の単離
- CO 2吸入によって（6〜8週齢）1成体マウスを犠牲にし、心臓や呼吸停止を確認することによって、その死を確認します。
- きれいな解剖ボード上の背中の上でマウスを置き、70％エタノールでそれを洗い流し;腹膜を開き、脾臓およびリンパ節（鼠径部、腋窩、上腕および子宮頸部）を除去し、滅菌ハサミやピンセットを使用します。最後に、氷上で5mlのPBSを含む15ミリリットルの遠心分離管に組織を移します。
- 層流フードの下で、上に70μmのセルストレーナーで50ml遠心チューブに組織を含むPBSをデカントすることにより、組織を移します。均質化しますストレーナを介して1ミリリットルプランジャとそれを押すことによって組織。
- FACS緩衝液30 mlを加え、4℃で5分間、500×gでそれを遠心。上清を捨て、FACS緩衝液10mlに細胞を再懸濁。チューブにFACS緩衝液の別の20ミリリットルを追加し、40μmのセルストレーナーを介してサスペンションをフィルタリングします。
- 4℃で5分間、500×gでそれを遠心。上清を捨て、FACS緩衝液500μlの中に細胞を懸濁します。
- 、マウスCD4磁気マイクロビーズの20μl加えよく混ぜ、4℃で15分間インキュベートします。 FACS緩衝液25 mlを加え、4℃で5分間、500×gでそれを遠心。
- 一方、磁石にLS分離カラムを配置し、FACS緩衝液3mlでそれをすすぎます。上清を捨て、FACS緩衝液3mlに細胞を再懸濁。
- 列にセルを追加します。 FACS緩衝液3mlの3回でカラムを洗浄します。磁石から列を削除し、新しい15ミリリットルセントリの上に置きますfugationチューブ。 、FACS緩衝液5mlを加えることは、5分、4℃、500×gで列プランジャと遠心分離機で標識された細胞を洗い流します。
- 上清を捨て、T細胞培地3mlに細胞を再懸濁。ウェル当たり100μlの培地で2.4および種子1×10 5細胞で説明したように細胞をカウントします。
- CD4 + T細胞刺激
- ポリクローナルCD4 + T細胞刺激
- 精製抗マウスCD3抗体でプレコート丸底96ウェルプレート（クローン145-2C11）を、PBS中で、所望の最終濃度。たとえば、を1μg/ mlのα-CD3でフルプレートをコートを事前にPBS 5mlで抗体（ストック濃度= 0.5 mg / mlで）を10μlを混合し、ボルテックスとにミックス50μlのを追加マルチチャンネルピペットで各ウェル。
- 3時間インキュベーターでプレートを残します。 T細胞を単離した後、PBSで2回予備コーティングされたプレートを洗浄します。 （クローン精製した抗CD28抗体を追加します。1μg/ mlの所望の最終濃度（ 例えば、）で単離されたT細胞の37.51）。よく混ぜます。 T細胞に接種し、2〜3日間インキュベーターでそれらを残します。
- 樹状細胞（DC）による抗原特異的CD4 + T細胞刺激
注：DCは、抗原提示細胞（APC）として使用される場合、これらの例外を除いて、T細胞の単離のためのプロトコルに従います。- 脾臓を均質化する前に、0.5 mg / mlとなるようにPBS中のコラゲナーゼタイプIAの1ミリリットルでそれを注入し、15ミリリットルの遠心チューブに移します。
- 15分間37℃の水浴中でインキュベートします。 PBSで洗浄した後、FACS緩衝液中にペレットを再懸濁し、代わりにCD4マイクロビーズの、マウスのCD11c磁性マイクロビーズの20μlを添加します。
- MS分離カラムと適切なボリュームを使用：FACS緩衝液1mlでカラムをすすぎます。 FACS緩衝液1mlで再懸濁細胞およびFACS緩衝液1mlの3回カラムを洗浄。
- 広告樹状細胞（ 例えば 、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）のaa 35-55 20時/ mlの）に選択のD抗原は、よく混ぜシード5×10 4細胞のT細胞培養培地100μl中あたり96ラウンドボトムよく。
- T細胞の単離のためのプロトコルに記載のように、最後に96丸底ウェルあたりのT細胞培養培地100μl中1×10 5 T細胞を加えます。
- B細胞と抗原特異的CD4 + T細胞刺激
注：B細胞をAPCとして使用される場合、これらの例外を除いて、T細胞の単離のためのプロトコルに従います。- B細胞の抗原特異的（B細胞特異的にMOG 35-55を認識例えば、IgH遺伝子MOG（TH）マウス、）トランスジェニックマウスからの脾臓を使用してください。
- （TCR MOG（2D2）マウスから、例えば ）抗原特異的T細胞を使用してください。マウスCD19磁気マイクロビーズの代わりにCD4マイクロビーズの20μlを添加します。
- Bのセルに選択した抗原を追加します。lsが（ 例えば 、20μgの/ mlのMOG 35-55）は 、96丸底ウェルあたりのB細胞培養培地100μl中5×10 4個の細胞をよく混ぜ、種。
- T細胞の単離のためのプロトコルに記載されるように、96丸底ウェルあたりのT細胞培養培地100μl中1×10 5 T細胞を加えます。
- ポリクローナルCD4 + T細胞刺激
4.設定とTEER測定を行います
- 層流フードの下でTEER機器の24ウェルモジュールを配置します。ふたを外し、ピンセットを用いて、機器にMBMECsでインサートを配置します。
- モジュールウェルの下部コンパートメントに新鮮な培地810μLをピペット：インサートとよくモジュールの壁との間に慎重にそれを追加します。
- 蓋を閉じ、インキュベーター内に配置してください。そのコンピュータに楽器を接続します。機器コントローラをオンにしてソフトウェアを開きます。
- ポップアップウィンドウで「新たな計測」を選択します。チェCK 'ショーTEER'と 'ショーCCL」ボックス。その後、「開始」を押してください。最初の測定を完了した後、すべてのTEERとCCLの値を参照するには、「結果」タブで「すべてのウェルをチェック」を選択します。
- 「ファイル名 '>名前を付けて保存>ファイル：ファイルを保存します。
注：TEERとCCLを連続的に自動化された方法で測定されたように、3〜5日の期間にわたってその値を監視します。 TEERの増加の欠如によって可視化されるように、細胞生存率は、次善のでない限り、培地を変更することは、必要ありません。 - CCLは安定であり、より低い1μF/ cm 2であり、TEERが最大レベルに達した時点をT細胞とする共培養MBMECsを選択します。
- 慎重に絶対TEERとCCLの値を検査し、MBMECsは、このような井戸をオフにしてコンフルエントに十分な単層を発症していないいる井戸を除外します。
- グループ井戸の残り：よく上で右クリックし、「新しい平均のウェルにも追加」を選択します。ナムポップアップウィンドウでそれを電子。すべての個々のウェルをグループ化するために同じことを行います。
- それらのすべてが共培養する前に、同じ初期条件を持っていることを確認するために、すべての平均井戸を確認してください。いくつかの著しく異なる絶対TEER値を有するか、TEERが傾斜、または標準誤差が大きすぎる場合は、グループ化をやり直します。
注：井戸の最適なグループ分けは、実験群内および間の両方、TEER値の最小の変化を提供します。 - 「実験」タブを押して「一時停止」で、楽器を切断し、インキュベーターの外にそれを取ります。層流フードの下蓋を外します。
- 所望のように、特定のサイトカイン、抗体または他の物質の有無にかかわらず、予備活性化および/またはナイーブT細胞を準備します。たとえば、次のように精製されたNA / LEラットを混在抗マウスIFN-γ抗体（クローンXGM1.2）準備されたTとTEER器具のウェルに20μg/ mlの細胞。
注：このようなグランザイムB阻害剤のような物質が使用される場合、それらはT細胞刺激の開始時にT細胞培養にdded： 例えば 、グランザイムB阻害剤II（Calbiochem社）をDMSO中に10μMの最終濃度で、単離されたT細胞と混合されます。詳細については、材料および装置を参照してください。 - インサートから培地（上部ウェルコンパートメント）の一部を削除します。（それはMBMEC単層を乱す可能性があるので、すべての媒体は避けるべきで除去） など 、慎重に150μlをピペット。
- 慎重に2×10 5細胞/インサートを含む培地150μlのピペッティングすることによってMBMECsにT細胞を追加します。
注：前活性化T細胞を採取する場合、唯一のブラスト、トリパンブルーを含まない細胞をカウントします。 - 蓋を閉じて、バックインキュベーターに配置してください。楽器を押す「リジューム測定 'を再接続します。 24時間後「実験」タブで、を押して「停止」して、ファイル（ファイル]> [保存]）を保存します。
5.データのエクスポートと統計解析
- [ファイル]> [エクスポート]を選択して、結果をエクスポートします。
- ポップアップウィンドウの「設定」タブで、「フィールド区切り文字」オプションの「桁区切り記号」オプションと「タブ」の「の.dot」を選択します。
- 「エクスポート結果」タブでは、ファイルに名前を付けるエクスポートするすべてのウェルをチェックし、「データを選択」オプションで「TEER」と「CCL」チェックボックスをオンにします。
- 押して「エクスポートデータは、「エクスポートされたファイルを開き、スプレッドシートにデータをコピーします。
- （各によってソートされた各ラン（測定）のために与えられたTEERとCCLの値で、複製）エクスポートされたデータを正規化：100％の共培養前の最後の時点のTEERとCCL値を設定し、それに応じて他のすべての値を変更「100％」のランの相対動作し、。
- 個々のウェルを使用し、各処置群について平均値の標準誤差を表示し、グラフを生成するために選択したソフトウェアに正規化されたデータをコピーします。
- P選択肢の統計ソフトウェアを使用して、多重比較のためのボンフェローニ補正で双方向ANOVA統計検定をerform。
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Representative Results
図1は、T細胞および内皮細胞間の相互作用を研究するために使用されるのin vitro BBBモデルの一般的な概要を提供します。実験は、次の3つの主要手順で構成されています。最初のステップは、脳皮質からの一次MBMECsの単離、および5日間彼らの文化です。それらは、細胞培養プレート中でコンフルエンスに達したとき、MBMECsをトリプシン処理し、次いで、TEER装置内に配置される透過性インサート上に再播種されます。 TEERとMBMECsのCCLは、連続的に測定し、3〜5日の期間にわたって監視されています。一方、T細胞は、単離された、刺激された（ステップ2）、および2〜5日、種類および刺激の強さのために培養されます。 CCLは、安定した低いレベルであり、TEERが最大レベルにあるときに、ステップ3において、T細胞に添加し、MBMECsと共培養しました。 TEERは、その高原のままである共培養のために、この時点を選択すると、成功のために不可欠です全体の測定。 T細胞は、電気部品への添加の時点で活性化の所望のレベルに到達することになる。したがって、T細胞の単離および刺激の時間点を慎重に選択されることが非常に重要ですT細胞を添加した後、測定は、一以上の日に再開され、結果が分析されます。
最初の5日間培養した後、MBMECsは容易に特徴紡錘状の形態（ 図2A、左パネル）を示し、そのようなPECAM-1とクローディン5（ 図2A、真ん中と右のパネル）などの内皮細胞特異的なマーカーを発現します。しかし、これだけでは、完全な合流し、適切な障壁の完全性の十分な証拠を提供していません。インピーダンス分光法は、一方では、単層の完全性の良好な推定値を与え、十分に機能アッセイの性能の前にそれぞれの品質管理として機能します。 図2Bは、ほとんどのウェルは、そのCCL値が安定して低く、そのTEER値がプラトーに達したMBMECsを含んでいました。これらのウェルは、その後、共培養実験に用いました。それらは、内およびグループ間の差異は、T細胞（ 図2C）を加える前に、最小であったようにグループ分けしました。彼らはあいまいな結果やデータの誤った解釈につながるとして、そのTEER値（例えば、 図2Bに示された青色の曲線として）残りの部分と有意に異なるウェルは、使用しませんでした。
MBMEC文化とT細胞刺激のための最初の要件が満たされていると仮定すると、インピーダンス分光法は、T細胞-ECの相互作用の中に貴重な洞察力を与えることができます。 図3A及び図3Bに示すようにTEERの測定は、そのような相互作用のための主要な読み出しおよびT細胞媒介EC機能障害の指標として機能することができます。この場合、MBMECsは微細孔0.4でインサート上で成長させますT細胞はインサート膜を通過することはできません直径がμmで、。 図3Aは、TEERの減少とCCLの増加によって決定されるようにのみ刺激はなく、ナイーブT細胞は、ECの機能不全を誘導することができることを示しています。ナイーブT細胞との共培養は、それらの初期のレベルに滞在中に、ナイーブT細胞は、このようにTEERとCCLので、負の対照としての役割を果たすことができます。例外は（、蓋を持ち上げ、わずかに異なる温度およびpH値を有することができる細胞を新しい培地を加えて、蓋を閉じる）楽器を扱うことによって引き起こされる、共培養の非常に最初のピークです。このアーティファクトは、TEER測定のすべての種類で表示され、解析時には無視されます。 EC炎症を誘導することができることが知られている炎症性サイトカインIFN-γ及び（100-500 U / mlで）、TNF-αの添加を、ポジティブコントロールとして使用することができます。 図3Aでは、MOG 35-55特異的CD4
記載MBMEC単層破壊のメカニズムを調べるために、様々な手法を用いることができます。 図3Cの結果はその刺激されたT細胞を示すではなく、それらの上清は、T細胞とMBMECsとの間の直接接触はバリア破壊のために重要であることを示す、MBMECsに著しい損害を引き起こしました。また、中和α-Iの添加TEERの測定時のFN-γ抗体は、わずかしか、IFN-γは、この混乱の主な原因ではないかもしれないことを示唆し、MBMECバリア性を改善しました。一方、T細胞培養に追加するグランザイムB阻害剤II（ 図3D）は MBMECの損傷やTEERにおけるその後の低下を引き起こす上で重要なプレーヤーとしてこの細胞溶解性分子を指し、大きい程度にMBMECの整合性を回復しました。
EC単層の完全性のT細胞の効果のための主要な読み出しとしてのその使用に加えて、TEERの測定はまた、T細胞の遊出アッセイなど他のアッセイの前に障壁の完全性の品質管理として使用することができます。この場合には、直径が3μmの微細孔が使用されて挿入します。 図3Eに、TEER測定をMBMEC単層は、後続transmigratioためのT細胞の添加前に、すべてのウェルにおける整合性と同レベルであったことを確認するために行きましたn個のアッセイ。これは、遊出T細胞の絶対数を決定するために、細胞計数ビーズを使用して、α-CD4抗体およびフローサイトメトリー分析を用いてT細胞を染色し、機器ウェルの下側コンパートメントからのT細胞の採取を行いました。 図3E、中・右）に示します。それらは、図3Aのように予め活性化したが、TEERの実質的な減少を引き起こさなかった遊出するために使用されるT細胞を刺激したノート。以前に39観察されているように、これは、免疫細胞が遊出時に使用することができる経細胞経路を反映し得ます。 図3Fでは、MBMECsでウェルの半分は、IFN-γおよびTNF-α（炎症を起こした。 対起こしていない）で炎症を起こした、と後に、ナイーブT細胞は、輪廻の活性の評価のために添加しました。この場合、TEER測定はサイトカインと炎症がいかに強力かつT細胞はtransmigratioのために追加すべきときに手掛かりを提供しましたn個。
図4は、TEER結果の誤った解釈につながる可能性があり、最も一般的な状況のいくつかを示しています。 図4Aに、例えば、全てMBMECs同時に完全にコンフルエントな単層を開発しました。グループ（「ナイーブT細胞 - 除外 '）の一つは、そのTJ複合体だけT細胞の添加前に、他の群と比較して異なる速度で成熟したMBMECsを含んでいました。このグループは、結果的に、実験中に100％以上のTEER値を開発し、さらなる分析から除外しました。 このように、実験前TEER曲線（TJ成熟の速度）の勾配は、適切なデータ解釈のための絶対TEER値と同様に重要です。 図4Bは、だけでなく、早すぎるだけでなく、遅すぎる共培養を開始すると、誤った結果を導くことができることを示しています。ここでは、刺激されたT細胞と群と陰性対照群の両方において（中チャンE）、TEER値はすでにプラトーに合格し、実験条件から独立して減少し始め、従って前および実験中準最適培養条件を示しています。このような基は、分析に含まれるべきではありません。 TEERとCCLは、通常、TEERのより大きな減少がCCLのより大きな増加を伴うような方法でそれらの値を変更したが最後、これは必ずしもそうではないかもしれません。 図4Cにおいては、Bは、TEERで大きく低下するが、Aが行った刺激されたT細胞よりCCLにおける小さな増加を引き起こし、T細胞を刺激しました。
図1：技術の一般的な概要。最初の培養後、MBMECsは、透過性のインサート上に再播種され、自動細胞モニターの中に入れ、 TEERとCCLは4-5日間1時間ごとに測定します。一方、T細胞は、 インビトロで活性化されます40から許可を得て再印刷します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：MBMECs は、in vitro BBBモデルに適したコンフルエントな単層を開発しています。 （A）5日MBMEC分離後のPECAM-1（中央）とクローディン5（右）のスピンドル形状の形態（左）と免疫蛍光染色。個々のウェルの（B）の前に（BおよびC）TEERとCCL値と後（C）グループ化、前トンT細胞のOを添加。このウェル中のMBMECsは、他のウェルほど高いTEERを開発していないので（B）中の青い曲線は、実験に使用されていません。 （C）ショーのデータは平均±SEM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 代表的な結果。 T細胞との相互作用にMBMEC機能不全の主要な尺度としてTEER中（AD）の変更。 （A）MOG特異的T細胞は、5日間のMOG 35-55ペプチドの存在下で、MOG特異的B細胞によって活性化しました。ナイーブT細胞および炎症性サイトカインIFN-γ及びTNF-α（100 U / mlの両方）は、それぞれ陰性および陽性対照として用いました。 （示されるように、B）T細胞をMBMECsに追加する前に、2〜3日間、α-CD3およびα-CD28抗体（1 / mlのそれぞれ）で刺激しました。 α-IFN-γ抗体または対応するアイソタイプ対照の存在下で（C）T細胞（（A）のように予め活性化）、またはそれらの上清。グランザイムB阻害剤IIまたはその希釈DMSOの存在下で2日間（D）T細胞（（B）のように予め活性化）。 （EおよびF）T細胞の遊出の前に障壁の完全性のための品質管理としてのみ使用TEER測定。 MBMECsは、直径3μmの孔を有するインサート上で成長させました。 （E）T細胞を、（A）に記載のように刺激は、18時間（左）が遊出することせました。次に、それらは、細胞計数ビーズ（中央と右側）を使用して、α-CD4抗体（クローンRM4-4）について染色し、フローサイトメトリーによって分析し、回収しました。 （F）IFN-γおよびTNF-αで刺激したときのMBMEC単層の完全性の監視、および遊出アッセイのためのT細胞のその後の添加のための適切な時点を選択します。 （AF）の結果は、技術的三重を示し、3つの独立した実験それぞれの代表的なものです。データショーは平均±SEM。 （E、右）ペアになっていない、両側スチューデントt検定。 **、P <0.01。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 実用的な考慮事項およびデータ解釈。その接合部複合体の成熟速度は、他のグラムに比べて異なっていたので、（A）1つの実験群（赤線）からMBMECsは、分析から除外しましたoups。 （B）MBMEC機能障害の適切な評価を防止する、遅すぎるT細胞を追加した例。刺激されたT細胞の「A」によって破壊されると（C）（黒の曲線）は、MBMECsのCCLの値は同じT細胞によって引き起こされるTEERの同時減少から予想されるよりも多くの劇的な増加を示しました。 （AC）T細胞を2日間α-CD3およびα-CD28抗体（1 / mlのそれぞれ）で刺激しました。結果は、技術的三重を示し、3つの独立した実験それぞれの代表的なものです。データショーは平均±SEM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
記載されたプロトコルのいくつかのステップが成功した実験のために不可欠です。初期MBMEC単離および培養の間、仕事を真菌胞子または細菌を細胞培養物の汚染を防止するために、可能な限り無菌条件下で行われることが重要です。 ECの純粋な培養物を得るためには、41,42（特に、周皮細胞）、他の細胞型ECの生存を可能にする最初の3日間、ピューロマイシンを含有する培地を使用することは推奨されないが。特別な注目に値するもう一つの重要なステップは、前活性化T細胞を追加するための正しい時点の同定です。 TEER測定MBMECsの最初の48時間の間、透過性インサート上で増殖し、互いの間のギャップを閉じます。それは安定した低レベル（周辺で0.6μF/ cm 2で）に達するまでしたがって、CCLは減少します。これは、コンフルエントEC単層の最初の兆候であるが、まだタイトな障壁の兆候ではありません。後にのみCCLは、TEERが増加し始めるない安定したレベルに達しています。 TJ複合体が完全に形成され、EC障壁が完全に密封されている場合、TEERが最大レベルに達します。この台地は、通常、3〜5日のECを再播種後に到達され、別の24〜36時間維持されます。 T細胞を追加するための最良の時点は、電気部品が依然としてT細胞と共培養するのに十分に生存可能であることを保証するプラトーの先頭にあります。 T細胞活性化を安全に予測することができる共培養のための最適な時点の前に開始する必要があるように、このタイミングの柔軟性を増加させるために、2つの異なる日にT細胞の二つのバッチを刺激することが有利です。最後に、MBMECsにT細胞を添加する前に、個々の複製ウェルのグループ内およびグループ間のばらつきが最小となるように行われる必要があります。これは、初期条件は、T細胞とMBMECsの共培養中にすべてのグループ間で同等であることを保証します。 私たちのプロトコルは、プレ活性化CD4 + T細胞と初代マウス脳ECの共培養時にTEERの測定について説明します。そのシンプルなフォームは、科学的ニーズに応じて、複数の修飾を可能にします。例えば、刺激の種類、強度、および持続時間を変化させることができます。抗原特異的CD4 + T細胞は、適切な抗原提示細胞（APC）の存在下で、それらの同族抗原によって活性化することができます。あるいは、T細胞は、ポリクローナルα-CD3およびα-CD28抗体によって活性化することができます。 T細胞の活性化状態は、抗体、阻害剤を遮断する、種々のサイトカインによって調節することができます。内皮細胞株と原発性脳腫瘍のECを交換すると、それは初代細胞43に比べて後者のショー制限の少ないTJ複合体と高い透磁率ことが知られているように、しかし、お勧めしません。主要な読み出しとしてTEERを測定することに加えて、このプロトコルは、EC monolayの良好な品質管理を提供しますT細胞の遊出アッセイ（ 図3E、F）の前に小胞体の整合性。注目すべきは、TEER値は、必ずしもMBMECs（ 図3E）全体のT細胞の遊出の間に減少しないことがあります。以前に39,44観察されているように、これは、免疫細胞が移住の際に使用することができ経細胞経路を反映している可能性が。
活性化T細胞は、共培養中のEC機能障害を誘発するように、TEERは、同じ条件で実験を横切る匹敵する安定した予測可能な低下を示しています。 TEERのより大きな減少は、通常、CCLのより大きな同時増加を伴っています。まれに、しかし、CCLの増加は、TEER（ 図4C）の対応する減少から予想されるよりもより顕著であることができます。この不一致は、EC単層破壊のさまざまな側面を反映している可能性があります。電気部品は、バリア破壊の間に形成されたギャップを埋めるためにしようとして、彼らはのダイナミックな変化を受けることができますこのような突起を形成し、CCLの劇的かつ急激な増加に寄与することができる全ては、それらの全表面積を増大させるような形態および運動性。これは、TEERの変化に比べて、CCLの変化が少なく、予測可能になります。したがって、TEERの低下のレベルが損なわ障壁の完全性の最も信頼性の高い代表的な指標のまま。
このアッセイは、内皮バリア性を調査するために他の技術によって補完することができます。これは、破壊されたEC単層44を介して拡散する異なるサイズの分子の量を測定する透過性アッセイによって追跡することができます。この目的のために、例えば、フルオレセイン、テキサスレッドなどの蛍光標識デキストランコンジュゲートを使用することができます。他の分子トレーサーも利用可能である（ 例えば、ショ糖、マンニトール、アルブミン、エバンスブルーおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ）26。また、免疫蛍光顕微鏡検査は、タンパク質発現の変化を調べるために使用することができそしてTJおよび細胞接着分子の細胞局在。提示BBBモデルは非常に単純であるが、それを用いて得られた結果は、より生理学的条件下でさらなるアッセイのための貴重な配向を提供することができます。そのようなアッセイは、（限定されるものではないが）、BBBの完全な複雑性を考慮するために、マウス生体内に静的条件下でエバンスブルー注射によるインビボ透過性アッセイで得られたTEER測定を補完するためのin vitroせん断フローアッセイ。
高感度かつ信頼性の高いが、ここで説明する方法は、特別な注意に値するいくつかの制限があります。私たちの実験で測定された最大TEER値は35から40Ωcm2台の値に達します。これらのTEER値は、異なる細胞型および無細胞の成分がBBBの完全性に寄与する生体内におけるよりもはるかに低いですが、彼らはまた、TEERがin vitro BBBモデルでいくつかの他に得られた値ほど高くはありません<SUP> 26,45,46。 49 -これは、顕著なバリア特性27,47を増強することが示されているEC媒体のヒドロコルチゾンを添加することによって改善することができます。しかしながら、このような物質の使用 - 抗炎症および免疫抑制効果を有することが知られている - すべての機能的アッセイのためには適していません。この特定のプロトコルの焦点は障壁の完全性のEC-T細胞相互作用の結果であるように、解釈はヒドロコルチゾンの添加によって阻害されるであろう。従って、ここで提示されたプロトコルを使用してEC障壁機能障害を引き起こす刺激されたT細胞の真の炎症性ポテンシャルの評価を可能にします。これは、文献に報告異なるTEER値の直接比較は、慎重に行われるべきであることは注目にも価値があります。このような値は、実験に大きく依存しており、それらは、（細胞密度、培地、細胞増殖の領域、及びTEER測定システムを播種、異なる細胞型で得られる、例えば</ em>の、電極の設計およびサイズ）。
より密接にin vivoでの状況を模倣するためには、複雑なインビトロ BBBモデルは、電気部品は、インサート膜の反対側の周皮細胞と共培養されている場合には、確立されている、または周皮細胞とアストロサイトは、ウェルの底に成長されている場合52 - 12,25,50。このような共培養システムでは、異なる細胞型の間のクロストークは、三重共培養は、 インビボでの状況に似ているので、最も高いTEER値を提供する際に最良であるとバリアの強い締め付けを可能にします。これらのシステムの複雑さは、一方で、 インビトロ BBBモデルとしての広い用途に制限をもたらします。
このモデルのもう一つの制限は、障壁の完全性53,54を改善することが示された剪断応力の欠如です。この問題を克服するために、新しい動的BBBモデルは、最近導入された：ECsは中空繊維で培養し、拍動流の条件に付し、 インビボ 55,56 に 、より密接に微小血管系を模倣します。
要約すると、このプロトコルは、インピーダンス分光法に基づいて、BBBのin vitroモデルを説明しています。活性化T細胞と一次マウス脳内皮細胞との相互作用に着目し、この方法は、直接接触時にバリア特性を研究することを可能にします。これは、BBBが脳炎誘発性T細胞とのECの相互作用の間に妥協される多発性硬化症およびその動物モデルEAE、炎症性CNS疾患の発達における重要なステップを理解するために特に重要です。記載されたアッセイは、抗体、サイトカインおよびT細胞活性化の阻害剤を遮断するような物質の広い範囲を使用して、このような相互作用の標的変調の結果の調査を可能にします。本方法は、敏感な信頼性の高い、非侵襲aはND TEERとCCLの測定は、自動化された方法で行われています。このすべては、それBBBモデルの豊富なボディに新しいレイヤーを追加して有用かつ汎用性の高いツールになります。それは具体的には、MSなどの自己免疫疾患で観察された病態生理学的条件の下で、BBBの特性についての我々の知識を拡大することができます。
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Acknowledgments
私たちは、TEERの測定に関する有用な議論のためのアニカEngbers及びそれらの優れた技術サポートのためのフランク・クルトと博士はマーカス・シェーファー（nanoAnalytics GmbH社）に感謝しています。この作品は、ドイツ学術協会（DFG）によってサポートされていました、HWとLKへSFB1009プロジェクトA03、CRC TR128は、A08を投影します。 LKにZ1とB01 LKとHWに、臨床研究のための学際センター（ミュンスターの医学部）認可番号KL2 / 14分の2015。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
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