Introduction
Гематоэнцефалический барьер отделяет системный кровоток от центральной нервной системы (ЦНС) , 1 - 3. Она обеспечивает физический барьер, который препятствует свободному движению клеток и диффузии водорастворимых молекул и защищает мозг от патогенов и потенциально опасных веществ. В дополнение к барьерной функции, ГЭБ обеспечивает доставку кислорода и питательных веществ к паренхиме головного мозга, что обеспечивает надлежащее функционирование нервной ткани. Функциональные свойства ГЭБ высоко регулируются его клеточных и межклеточных компонентов, с узкоспециализированными КЭ является ее основным структурным элементом. КЭ ГЭБ характеризуются наличием плотного контакта (TJ) комплексов, отсутствие фенестраций, крайне низкой пиноцитозные активностью и постоянно активных транспортных механизмов. Другие компоненты ВВВ базальная мембрана EC, перицитов вложения эндотелий, астроцитов концевые ноги и = ассоциированных парenchymal базальная мембрана также внести свой вклад в развитие, поддержание и функции ВВВ 2,4 - 6 и, вместе с нейронами и микроглии, образуют сосудисто - нервный узел (НВУ), что позволяет надлежащее функционирование ЦНС 7 - 9.
В различных неврологических заболеваний, таких как нейродегенеративные, воспалительные или инфекционные заболевания, функция ГЭБ скомпрометирован 2,5,10. Дисрегуляция TJ комплексов и механизмов молекулярных транспорта приводит к повышению проницаемости ГЭБ, лейкоцитов, воспаление и повреждение нейронов. Для изучения свойств ГЭБ при таких патофизиологических условиях, различные модели в пробирке ВВВ были установлены 9,11,12. Вместе они предоставили ценную информацию о изменениях целостности барьера, проницаемости, а также транспортных механизмов. Эти модели используют эндотелиальные клетки человека, мыши, крысы, свиньи или бовечьего происхождения 13 - 18; Первичные эндотелиальные клетки или клеточные линии культивируют либо в виде монокультуры или вместе с перицитов и / или астроцитов, чтобы более точно имитировать ГЭБ в естественных условиях 19 - 25. В последние годы, измерение трансэндотелиальном электрического сопротивления (Тир) стала широко распространенным инструментом для оценки эндотелиальной барьерных свойств 26,27.
TEER отражает полное сопротивление ионного потока через клеточный монослой и его снижение обеспечивает чувствительное измерение целостности эндотелиальной скомпрометированы барьера и, следовательно, повышенной проницаемости. Различные системы измерения Teer были разработаны, в том числе эпителиальной Voltohmmeter (EVOM), электрический Cell-подложка импеданса зондированию (ВЕ) и клеточного анализа в реальном масштабе времени 15,28 - 30. TEER отражает сопротивление потока ионов между соседними КЭ (парацеллюлярная маршрута) и прямо пропорциональнацелостности барьера. В импедансной спектроскопии 27,31, комплексное полное сопротивление (Z) измеряется, которая обеспечивает дополнительную информацию о целостности барьера путем измерения CCL. Ccl относится к емкостной ток через клеточную мембрану (трансцеллюлярного маршрут): Клеточный слой действует как конденсатор в эквивалентной электрической цепи, разделяющей заряды на обеих сторонах мембраны и обратно пропорционален целостности барьера. При выращивании на проницаемые вставок, КЭ прилипать, пролиферируют и распространяются на микропористой мембраны. Это противодействует фоновый емкостного тока вставки (который сам по себе действует как конденсатор) и приводит к уменьшению емкости до тех пор, пока не достигнет своего минимального уровня. За этим следует путем создания TJ комплексов, которые перекрывают пространство между соседними КЧС. Это ограничивает поток ионов через маршрут парацеллюлярной и ТЭЭУ увеличивается, пока не достигнет своего плато. При воспалительных процессах, однако, endotheliаль барьер скомпрометирована: TEER уменьшается по мере TJ комплексы получают нарушается и Ccl возрастает по мере емкостной составляющей вставки снова поднимается.
Наше измерение TEER использует автоматизированную систему мониторинга ячейки 32: он следует принципу импедансной спектроскопии и расширяет свои предыдущие приложения. Здесь мы опишем экстракорпорального ВВВ модели в том , что позволяет исследовать барьерных свойств, в том числе взаимодействие мозга эндотелий с иммунными клетками; в частности, активированных Т-клеток. Такие патофизиологических условиях наблюдаются при аутоиммунных заболеваниях центральной нервной системы , таких как рассеянный склероз и его модели для животных экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита 33 - 37. Здесь решающим шагом является трансмиграция энцефалитогенных, миелин-специфических Т-клеток через ВВВ. Это сопровождается их реактивации в периваскулярной пространстве и вступление в паренхиме головного мозга, где они принимают на работу других иммунных клеток и меняственной воспаления и последующего демиелинизация 1,35,38. Однако молекулярные механизмы взаимодействия таких Т-клеток и эндотелиальных клеток, основными составляющими ГЭБ, не до конца понятны. Наш протокол призван восполнить этот пробел и дать новое понимание последствий на эндотелиальных клетках (то есть, целостность барьера и проницаемости) при их непосредственном контакте и взаимодействии с комплексным активированными Т - клетками.
Протокол, описанный здесь, использует первичный мозга мыши микрососудистой эндотелиальных клеток, выращенных в виде монослоя на проницаемых вставках с микропористым мембранам. Эндотелиальные клетки культивировании совместно с CD4 + Т - клеток, которые могут быть предварительно активированными либо поликлонально или в моде антиген-специфической. Совместное культивирование MBMECs с предварительно активированные, но не наивным Т-клеток индуцирует снижение TEER и увеличение в БКК, которая обеспечивает количественную меру дисфункции и разрушения барьера MBMEC. техникаявляется неинвазивным: он использует встроенный вместо Chopstick электродов, которые предотвращают серьезное нарушение общественного порядка монослоя ЕС; он может быть использован для мониторинга барьерной функции без использования клеточных маркеров. Это делает непрерывные измерения в автоматическом режиме и позволяет провести независимую оценку двух параметров барьера (Тир и CCL) одновременно с течением времени. Этот метод также достаточно чувствителен, чтобы различать разные уровни активации Т-клеток и эффектов таких Т-клеток на КЧС.
Он может быть использован в широком диапазоне функциональных анализов: различные цитокины и / или хемокины замешанные в воспалительных процессах могут быть добавлены к совместной культуре MBMECs и Т-клеток; можно использовать блокирующие антитела против молекул клеточной адгезии либо на ЕС или стороне Т-клеток; и ингибиторы маркеров активации Т-клеток или их цитолитического свойств могут быть добавлены во время примирования Т-клеток или их совместном культивировании с КЧС. Анализ также полезен для Т-клеток переселенииАнализы, так как он может служить в качестве контроля качества целостности монослоя MBMEC перед добавлением Т-клеток. Все это делает этот метод универсальный и надежный инструмент для изучения ГЭБ в пробирке, с акцентом на эффекте активированных Т - клеток на целостность монослоя EC. Это имеет особое значение для понимания механизмов нарушения ГЭБ в патогенезе аутоиммунных заболеваний, таких как MS и его животной модели EAE, где самореактивными, энцефалитогенных Т-клетки проникает через ГЭБ и вызывать воспаление и повреждение нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для всех экспериментов мышей разводили и поддерживали под конкретного патогена условий в центральном виварии в Университете Мюнстера, в соответствии с немецкими руководящими принципами для ухода за животными. Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике экспериментальных животных и одобрены местными властями земли Северный Рейн-Вестфалия, Германия (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).
1. MBMEC Выделение и культура
Примечание: Изолировать MBMECs , как описано выше в деталях 14 со следующими изменениями:
- Жертвоприношение 20 взрослых мышей C57BL / 6 (6-8 недель) с помощью CO 2 ингаляции и подтвердить их смерть и установления сердечной остановки дыхания.
- Ополосните мышь с 70% этанола и обезглавить его с помощью ножниц; удалить кожу головы с помощью пинцета и ножниц. Сделайте надрезы на левой и правой стороне черепа, начиная от затылочного отверстия. Поднимите череп с его стороны хвостового и Takе из головного мозга с пинцетом.
- Под капотом ламинарного потока, используйте стерильного пинцета поместить мозг в чашку Петри и удалить ствол мозга, мозжечок и таламус, сохраняя только кору головного мозга.
Примечание: Использование микроскопа не является необходимым для любого из этих шагов. - Поместите корку на кусок стерильной Вестерн-блоттинга бумаги и раскатайте его осторожно пинцетом до тех пор, пока Оболочек больше не видны.
- После механического и ферментативного расщепления ( в соответствии с протоколом 14), собирают эндотелиальные клетки от градиента плотности с помощью длинной, стерильной иглой и 5 мл плунжера. Эндотелиальные клетки появляются в мутном слое над красным кольцом с эритроцитами. Передача 20-25 мл этого слоя в новый 50 мл центрифужную пробирку; долить трубку с DMEM.
- После двух циклов промывки 14, клетки вновь суспендируют в 6 мл среды , содержащей пуромицин MBMEC (4 мкг / мл) и семя их на шесть лунок 24-луночного планшета; оставить их в тканикультура инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 (упоминается как 'инкубаторе' , начиная с) в течение трех дней.
Примечание: Для получения дополнительной информации раствора покрытия MBMEC см Материалы табл. - Изменение среды путем добавления 1 мл в каждую лунку свежей MBMEC среды без пуромицин; положил пластину обратно при 37 ° С и 5% CO 2 в течение еще двух дней.
2. Заготовка MBMECs
- На пятый день после MBMEC изоляции, предварительно пальто проницаемые вставки с MBMEC раствором для нанесения покрытия: добавить 80 мкл раствора на вставку и оставить их при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 3 часов.
- Тщательно пипеткой из раствора для покрытия, и пусть Вставки высушенного на воздухе в течение 30 мин. Добавить 2 мл комнатной температуре (RT) PBS в каждую лунку планшета, используя MBMECs мыть среды; повторите этот шаг. Добавить 0,05% трипсин-ЭДТА (300 мкл на лунку) и оставить пластину в инкубаторе в течение 5-10 мин.
- Добавляют 2 мл MBMEC среды в каждую лунку, чтобы остановитьтрипсинизации. Передача собранных клеток в 15 мл центрифужную пробирку и в отцентрифугированы при 700 х г в течение 8 мин при 4 ° C. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 1 мл среды MBMEC без пуромицин.
- Граф клеток; смешать 10 мкл клеточной суспензии с 90 мкл 0,04% трипановым синим (10x разведения клеток). Внесите 10 мкл этой смеси между стеклянной крышкой и счетной ячейки камеры (гемоцитометра). Граф Трипановый Blue-свободных ячеек во всех четырех квадрантах камеры (N) и определяют среднее число подсчитанных клеток (N ') следующим образом: N' = N / 4.
- Вычислить концентрацию клеток (в 10 6 клеток / мл) , используя следующую формулу: C = N 'х 10 4 х 10, где 10 4 задается размерами гемоцитометра и 10 коэффициент разбавления с шага 2.4.
- Затравочного монокристалла 2 х 10 4 клеток в объеме 260 мкл на вставку. Добавьте 810 мкл среды MBMEC в нижнем отсеке каждой лунки, Поместите пластину со вставками в инкубаторе до готовности приступить к разделу 4.
Примечание: Объемы для верхнего и нижнего отсека являются вставки конкретных и не работают для всех форматов 24-а.
3. CD4 + T Выделение клеток и стимуляция
- CD4 + Т - клеток изоляции
- Жертвоприношение одного взрослого мышь (6-8 недель) с помощью CO 2 ингаляции и подтвердить свою смерть от установления сердца и остановка дыхания.
- Поместите мышь на спине на чистую рассечение борту и промыть его 70% -ным этанолом; использовать стерильные ножницы и пинцет, чтобы открыть брюшины и удалить селезенку и лимфатические узлы (паховые, подмышечные, плечевое и шейки матки); И, наконец, перевести ткани в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую 5 мл PBS на льду.
- Под капотом ламинарного потока, переноса ткани путем декантации PBS с тканью в центрифужную пробирку объемом 50 мл с ситом клеток на вершине 70 мкм; гомогенизироватьткань, нажав на нее с 1 мл плунжером через сито.
- Добавьте 30 мл FACS буфера и центрифугируйте при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и клетки вновь суспендируют в 10 мл буфера FACS. Суспензию фильтруют через сито 40 ячейки мкм, добавляют еще 20 мл буфера FACS в пробирку.
- Центрифугируйте при 500g в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 500 мкл буфера FACS.
- Добавьте 20 мкл мыши CD4 магнитных микрогранул, хорошо перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Добавьте 25 мл FACS буфера и центрифугируйте при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- В то же время, поместите разделительную колонку LS в магнит и промойте его с 3 мл буфера FACS. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 3 мл буфера FACS.
- Добавить клетки в колонну. Промыть колонку с 3 мл FACS буфера три раза. Удалить столбец из магнита и поместите его на новый Centri 15 млfugation трубки. Добавляют 5 мл буфера FACS, вымывать меченые клетки с плунжером колонку и центрифугируйте при 500 мкг в течение 5 мин 4 ° C.
- Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 3 мл среды Т-клеток. Граф клеток , как описано в 2.4 и семени 1 × 10 5 клеток в 100 мкл среды на лунку.
- CD4 + Т - стимуляции клеток
- Стимуляция поликлональных CD4 + Т - клеток
- Предварительное покрытие с круглым дном 96-луночный планшет с очищенным анти-мышиного CD3-антителом (клон 145-2С11) в PBS, при желаемой конечной концентрации. Например, для предварительного покрытия полная пластина с альфа-CD3 при 1 мкг / мл, смешивают 10 мкл антитела (концентрация запас = 0,5 мг / мл) с 5 мл PBS, вихря и добавляют 50 мкл смеси для каждую лунку с помощью многоканальной пипетки.
- Оставьте пластину в инкубаторе в течение 3 часов. После выделения Т-клеток, мыть пластины с предварительным покрытием в два раза с PBS. Добавить очищенные анти-CD28-антитела (клон37,51) к изолированным Т - клеток в желаемой конечной концентрации (например, при концентрации 1 мкг / мл); хорошо перемешать. Семенной Т-клетки, и оставить их в инкубаторе в течение двух-трех дней.
- Антиген-специфическая стимуляция клеток CD4 + T с дендритные клетки (ДК)
Примечание: Если контроллеры домена используют в качестве антиген-представляющих клеток (АРС), следовать протоколу для изоляции Т-клеток, со следующими исключениями:- Перед гомогенизацией селезенку, вводят его с 1 мл коллагеназы типа IA в PBS при 0,5 мг / мл и переносят его в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Инкубировать в водяной бане при температуре 37 ° С в течение 15 мин. После промывания PBS, ресуспендируют осадок в буфере FACS и добавить 20 мкл мышь CD11c магнитных микросфер, вместо CD4 микрошарики.
- Используйте разделительную колонну МС и соответствующие объемы: полоскание колонку с 1 мл буфера FACS; Ресуспендируют клеток в 1 мл буфера FACS и колонку промывают 1 мл FACS буфера в три раза.
- Объявлениеd антиген выбора для контроллеров домена (например, миелин олигодендроцитов гликопротеин (MOG) аа 35-55 при 20 мкг / мл), хорошо перемешать и семя 5 × 10 4 клеток в 100 мкл Т клеточной культуральной среды на 96-раундовом-низ- Что ж.
- Добавить 1 × 10 5 Т - клеток в 100 мкл Т клеточной культуральной среды на 96-круглым дном-колодца в конце, как описано в Протоколе для Т выделения клеток.
- Антиген-специфическая стимуляция CD4 + Т - клеток с В - клетками
Примечание: Если В-клетки используются в качестве АРС, следовать протокол для изоляции Т-клеток, со следующими исключениями:- Используйте селезенок от трансгенных мышей, B - клетки являются антиген-специфические (например, IgH MOG (Th) мышей, чьи B - клетки специфически распознают MOG 35-55).
- Используйте антиген-специфические Т - клетки (например, от TCR MOG (2D2) мышей). Добавьте 20 мкл мыши CD19 магнитных микросфер вместо CD4 микрошарики.
- Добавляют выбранного антигена к B CELLs (например, MOG 35-55 при 20 мкг / мл), хорошо перемешать и семя 5 × 10 4 клеток в 100 мкл B клеточной культуральной среды на 96-круглым дном, хорошо.
- Добавить 1 × 10 5 Т - клеток в 100 мкл Т - клеточной культуральной среды на 96-круглым дном, хорошо, как описано в протоколе для выделения Т - клеток.
- Стимуляция поликлональных CD4 + Т - клеток
4. Настройка и измерение Выполнение Teer
- Поместите модуль 24-луночного прибора Тир под капотом ламинарного потока. Снять крышки и место вставки с MBMECs в приборе с помощью щипцов.
- Пипетировать 810 мкл свежей среды в нижний отсек модуля скважин: добавить его тщательно между вставкой и стенкой модуля скважины.
- Закройте крышки и поместите прибор в инкубатор. Подключите прибор к своему компьютеру; включите контроллер прибора и откройте программное обеспечение.
- Выберите 'новое измерение' в всплывающем окне. Ческ 'шоу TEER' и коробки 'Show CCL'; затем нажмите кнопку "Старт". После завершения первого измерения, выберите "проверить все ячейки" на вкладке "Результаты", чтобы увидеть все значения Тир и CCL.
- Сохраните файл: Файл> Сохранить как> 'имя файла'.
Примечание: Как TEER и Ccl непрерывно измеряются в автоматическом режиме, контролировать свои ценности в течение трех-пяти дней. Изменение среды не является необходимым, если жизнеспособность клеток не является неоптимальным, а визуализируются отсутствием увеличения TEER. - Выберите момент времени для совместного культивирования MBMECs с Т - клетками , когда Ccl является стабильным и менее 1 мкФ / см 2 и TEER достигла своего максимального уровня.
- Тщательно осмотрите абсолютные значения Тир и CCL и исключить скважины, в которых MBMECs не разработаны вырожденные достаточно монослоев отключив таких скважин.
- Группа остальные лунки: щелкните правой кнопкой мыши на лунку и выберите "хорошо добавить к новой средней скважины. Наме его в всплывающем окне; сделать то же самое для всех индивидуальных скважин, которые будут сгруппированы.
- Проверьте все средние колодцы, чтобы подтвердить, что все они имеют одинаковые начальные условия перед совместной культуры. Если некоторые из них существенно отличаются абсолютные значения Тир или TEER склонах, или стандартные ошибки слишком велики, повторить группировку.
Примечание: Оптимальная группировка скважин обеспечивает минимальное изменение в значениях Тир, как внутри, так и между экспериментальными группами. - На вкладке «эксперимент», нажмите 'пауза', отключите прибор и выньте его из инкубатора. Снять крышки под капотом ламинарного потока.
- Подготовка предварительно активирован, и / или наивные Т-клетки с добавлением или без специфических цитокинов, антител или других веществ, как хотелось бы: Например: Смешать очищенный NA / Л.Е. анти-мышиных ИФН-γ-антителом (клон XGM1.2) с подготовленной T клетки, в 20 мкг / мл на лунку прибора Тир.
Примечание: Если вещества, такие как ингибитор гранзимом B используются, они являютсяdded к культуре клеток Т в начале Т стимуляции клеток: например, Гранзим Ингибитор II (Калбиохем) смешивают с изолированными Т - клетками при конечной концентрации 10 мкМ в диметилсульфоксиде. Смотрите материалы и оборудование для получения более подробной информации. - Удалите часть среды из вставки (верхний отсек хорошо): например, тщательно пипеткой из 150 мкл (удаление всех среды следует избегать , поскольку это может нарушить монослой MBMEC).
- Добавить Т - клетки MBMECs осторожно пипеткой 150 мкл среды , содержащей 2 × 10 5 клеток / вставки.
Примечание: При заготовке предварительно активированные Т-клетки, рассчитывать только взрывные, Трипановый Blue-свободных ячеек. - Закройте крышки и поместите инструмент обратно в инкубатор. Снова подключите прибор и нажмите 'измерения резюме'. Через 24 часа, нажмите 'стоп' на вкладке «эксперимент» и сохраните файл (File> Save).
5. Экспорт данных и статистический анализ
- Экспорт результатов, выбрав Файл> Экспорт.
- На вкладке "Настройки" во всплывающем окне выберите ".dot" в опции "Десятичный разделитель" и "табулятором" в опции "разделителя полей".
- На вкладке "Экспорт результатов", введите имя файла, проверьте все скважины, которые будут экспортированы, и установите флажок "TEER" и ящики "CCL" в "выбрать данные" вариант.
- Нажмите кнопку "Экспорт данных" открыть экспортированный файл, а затем скопировать данные в электронную таблицу.
- Нормализация экспортируемые данные (отсортированы по каждой повторности, со значениями Тир и CCL данных для каждого прогона (измерение)): Set Тир и CCL значения последнего момента времени до начала совместной культуры до 100% и изменить соответствующим образом значения для всех остальных работает, по отношению к перспективе '100%'.
- Копирование нормализованные данные в программное обеспечение выбора для создания графика, с использованием отдельных скважин и отображать стандартную ошибку среднего для каждой группы обработки.
- пerform Двусторонний ANOVA статистический тест с коррекцией Бонферрони для множественных сравнений, с помощью статистического программного обеспечения выбора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 представлен общий обзор модели в пробирке ВВВ используется для изучения взаимодействия между Т - клеток и эндотелиальных клеток. Эксперимент состоит из трех основных этапов. Первым шагом является выделение первичных MBMECs из коры головного мозга головного мозга, и их культура в течение пяти дней. Когда они достигают впадения в клеточной культуральной пластины, MBMECs трипсином и пересевали на проницаемые вставки, которые затем помещают в прибор Тир. TEER и Ccl из MBMECs непрерывно измеряют и контролируют в течение трех-пяти дней. В то же время, Т-клетки выделяют, стимулируется (этап 2), и культивировали в течение от двух до пяти дней, тип и силы раздражителя. На этапе 3, Т-клетки добавляют и культивировали совместно с MBMECs когда Ccl находится на стабильном низком уровне, а TEER находится на своем максимальном уровне. Выбирая этот момент времени для совместной культуры, когда TEER все еще находится на своем плато имеет решающее значение для успехавсего измерения. Таким образом, чрезвычайно важно, чтобы точка времени для выделения Т-клеток и стимуляции тщательно подобраны так, что Т-клетки достигают желаемого уровня активации по времени их дополнение к КЧС. После добавления Т-клеток, измерение возобновляется еще на один день и проанализированы результаты.
После первоначального пятидневной культуры, MBMECs легко показать характерную веретенообразную морфологию (рис 2А, левая панель) и экспресс - маркеры эндотелиальных клеток специфические , такие как PECAM-1 и Claudin-5 (рис 2А, средней и правой панелей). Тем не менее, это само по себе не дает достаточных доказательств их полного слияния и надлежащей целостности барьера. Импедансной спектроскопии, с другой стороны, дает хорошую оценку целостности монослоя и служит в качестве контроля качества каждой лунки перед выполнением функционального анализа. На фигуре 2В, большинстволунки содержали MBMECs, значения CCL были стабильными и низкими, и их значения Teer достигли плато. Эти скважины были использованы для последующих экспериментов с совместным культивированием. Они были сгруппированы таким образом , что разница в пределах и между группами было минимальным перед добавлением Т - клеток (рис 2С). Скважины, значения которых TEER существенно отличались от остальных (например, синей кривой , указанной на рисунке 2B) не были использованы, так как они приводят к неоднозначным результатам или неправильной интерпретации данных.
При условии, что первоначальные требования к MBMEC культуре и стимуляции Т-клеток, были выполнены, импедансной спектроскопии может дать ценную информацию о взаимодействии Т-клеток-EC. Измерение ТЭЭУ может служить в качестве основного считывании такого взаимодействия и меры клеточного дисфункции Т EC, как показано на фигуре 3А и 3В. В этом случае MBMECs выращивают на вставках с микропорами 0,4мкм в диаметре, который не позволяет Т-клетки, проходить через мембрану вставки. На фиг.3А показывает , что только стимулировало, но не наивные Т - клетки способны вызывать дисфункцию EC, как определено снижением TEER и увеличения в БКК. Наивные Т-клетки, таким образом, может служить в качестве отрицательного контроля, так как TEER и Ccl во время совместного культивирования с наивным Т-клетки остаются на своих начальных уровнях. Исключением является пик в самом начале совместной культуры, вызванной переноской инструмента (подъем крышки, добавляя новую среду с клетками, которые могут иметь несколько различных температур и значений рН, и закрытие крышки). Этот артефакт появляется со всеми видами измерений Тир и игнорируется при анализе. Добавление провоспалительных цитокинов IFN-gamma и TNF-alpha (при 100-500 ед / мл), которые, как известно, способны вызывать воспаление EC, может быть использован в качестве положительного контроля. На фигуре 3А, MOG 35-55 -специфический CD4
Для того, чтобы исследовать механизмы описанного нарушения монослоя MBMEC, могут быть использованы различные подходы. Результаты на рисунке 3C показывают , что стимулированные Т - клетки, но не их супернатанты вызывали значительный ущерб MBMECs, указывая , что непосредственный контакт между Т - клетками и MBMECs имеет решающее значение для разрушения барьера. Кроме того, добавление нейтрализующего a-IFN-γ антитела во время измерения Teer лишь незначительно улучшена MBMEC барьерными свойствами, предполагая, что ИФН-γ не может быть основной причиной этого срыва. С другой стороны, добавление гранзимом Ингибитор II к культуре клеток Т (рис 3D) восстановлена целостность MBMEC в большей степени, указывая на эту цитолитического молекулу в качестве важного игрока в причинение вреда MBMEC и последующее уменьшение TEER.
К тому же его использование в качестве первичного считывания для эффекта Т-клеток на целостность монослоя EC, измерение ТЭЭУ также может быть использован в качестве контроля качества целостности барьера преимущественно перед другими анализов, таких как Т-клеточного анализа переселения. В этом случае вставки с используются микропоры 3 мкм в диаметре. На рисунке 3Е, измерение ТЭЭУ проводили для того , чтобы гарантировать , что MBMEC монослой одного и того же уровня целостности во всех скважинах перед добавлением Т - клеток для последующего transmigratioп анализа. За этим последовало уборки Т-клеток из нижнего отсека приборных колодцев, окрашивая Т-клеток с α-CD4 антитела и анализа проточной цитометрии, с помощью подсчета клеток бусинки для определения абсолютного числа переселенных Т-клеток; показано на рисунке 3Е, средний и правый). Следует отметить , что Т - клетки стимулировали используемые для трансмиграции не вызывало существенное уменьшение TEER, хотя они предварительно активировали , как на фигуре 3А. Это может отражать маршрут трансцеллюлярного иммунные клетки могут использовать в ходе перерождений, как было отмечено ранее 39. На рисунке 3F, половина из скважин с MBMECs разжигались с IFN-gamma и TNF-alpha (uninflamed против. Воспаленной), а затем, наивные Т - клетки были добавлены для оценки transmigratory деятельности. В этом случае измерение ТЭЭУ при условии, ключ к пониманию того, насколько сильно воспаление с цитокинов и, когда Т-клетки должны быть добавлены для transmigratioп.
На рисунке 4 показаны некоторые из наиболее распространенных ситуаций , которые могут привести к неправильной интерпретации результатов Тир. На фиг.4А, например, не все MBMECs разработали полностью сливающийся монослой в то же время. Одна из групп ( 'наивные Т-клетки - исключенные') содержали MBMECs чьи TJ комплексы созревании с разной скоростью по сравнению с другими группами как раз перед добавлением Т-клеток. К этой группе, следовательно, разработаны значения Teer выше 100% в течение эксперимента и был исключен из дальнейшего анализа. Таким образом, наклон кривой Тир (скорость созревания TJ) до эксперимента столь же важно, как абсолютные значения Тир для правильной интерпретации данных. Рисунок 4B показывает , что , начиная со-культуры не только слишком рано , но и слишком поздно может привести к ложным результатам. Здесь, как в группе с индуцированным Т-клетками, и контрольной группой отрицательной (средняя чане), значения Teer уже прошли их плато и начали уменьшаться независимо от условия эксперимента, следовательно, указывает на неоптимальных условий культивирования до и в ходе эксперимента. Такие группы не должны быть включены в анализ. И, наконец, хотя TEER и Ccl обычно изменяют свои значения таким образом, что большее снижение TEER сопровождается большим увеличением в БКК, это может быть не всегда так. На фигуре 4C, стимулировало Т - клетки Б вызвали большее снижение TEER, но меньшее увеличение в БКК , чем стимулированных Т - клеток , устройство А.
Рисунок 1: Общий обзор техники. После начальной культуры, MBMECs пересевают на проницаемых вставках и помещают в автоматизированную монитор клетки; TEER и Ccl измеряются каждый час в течение 4-5 дней. В то же время, Т - клетки активируются в пробирке 40. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: MBMECs разработать сливающийся монослой подходящий для экстракорпорального модели ВВВ. (A) морфология Шпиндель-форма (слева) и иммунофлуоресцентного окрашивания РЕСАМ-1 (средний) и Claudin-5 (справа) через пять дней после MBMEC изоляции. (В и С) Тир и CCL значения до того (В) , и после того, как (С) группировка отдельных скважин, до тO добавление Т-клеток. Синяя кривая в (В) не используется для эксперимента, так как MBMECs в этой скважине не разработали TEER столь же высоко , как и в других скважинах. Данные в (C) показывают среднее значение ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель результаты. (AD) Изменения в TEER в качестве основного показателя MBMEC дисфункции при взаимодействии с Т - клетками. (A) MOG-специфические Т - клетки активировали с помощью MOG-специфических В - клеток в присутствии MOG 35-55 пептида в течение пяти дней. Наивные Т-клетки и провоспалительных цитокинов IFN-gamma и TNF-alpha (как на 100 ед / мл) служили в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно. (В) Т - клетки стимулировали альфа-CD3 и α-CD28 антитела (1 мкг / мл каждого) в течение двух или трех дней, как указано, перед добавлением их в MBMECs. (С) Т - клетки (предварительно активировали , как в (а)) , или их супернатанты, в присутствии альфа-ИФН-γ антитела или соответствующего контрольного изотипа. (D) Т - клетки (предварительно активировали , как в (B)) в течение двух дней, в присутствии ингибитора гранзимом II или его разбавителя ДМСО. (E и F) измерение TEER используется только в качестве контроля качества целостности барьера до уровня Т-клеток переселении. MBMECs выращивали на вставках с порами 3 мкм в диаметре. (Е) Т - клетки, стимулируется , как описано на стадии (а), выпускали переселяться в течение 18 часов (слева). Затем они собирали, окрашивали для α-CD4 антитела (клон RM4-4) и анализировали с помощью проточной цитометрии, с помощью подсчета клеток бусин (средний и правый). (F)Контроль целостности монослоя MBMEC при стимуляции IFN-gamma и TNF-a, и выбрав соответствующий момент времени, для последующего добавления Т-клеток по переселению анализа. (AF) Результаты показывают технические трехкратном повторе и представляют из трех независимых экспериментов каждый. Данные показывают среднее значение ± SEM. (Е, справа) Непарное, двусторонний критерий Стьюдента. **, Р <0,01. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Практические соображения и интерпретации данных. (А) MBMECs из одной экспериментальной группы (красная линия) , были исключены из анализа, так как скорость созревания их комплексов соединительных отличается по сравнению с другими грдов в. (B) Пример добавления Т - клеток , слишком поздно, что не позволило надлежащую оценку MBMEC дисфункции. (С) В случае прерывания по 'A' , стимулированных Т - клеток (черная кривая), значения CCL из MBMECs показали более значительное увеличение , чем можно было бы ожидать от сопутствующим снижением TEER вызывается теми же Т - клеток. (Переменный ток) Т - клетки стимулировали с помощью альфа-CD3 и α-CD28 антитела (1 мкг / мл каждого) в течение двух дней. Результаты показывают технические утраивает и представляют из трех независимых экспериментов каждый. Данные показывают среднее значение ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько шагов описанного протокола имеют важное значение для успешного эксперимента. В ходе первоначальной изоляции и культуры MBMEC, крайне важно, что работа выполняется в стерильных условиях в максимально возможной степени, чтобы предотвратить загрязнение культуры клеток грибковых спор или бактерий. Для того , чтобы получить чистую культуру КЭ, рекомендуется использовать среду , содержащую пуромицин в течение первых трех дней, что дает выживание КЭ, но не другие типы клеток (особенно перицитов) 41,42. Другой важный шаг, который заслуживает особого внимания является определение правильного момента времени для добавления предварительно активированные Т-клетки. В течение первых 48 ч от MBMECs измерения Teer пролиферируют на проницаемых вставках и закрывают промежутки между друг другом. Следовательно, Ccl уменьшается , пока не достигнет стабильного и низкого уровня (около 0,6 мкФ / см 2). Это первый признак сливающийся монослой ЕС, но еще не является признаком плотного барьера. Только послеБКК достигла стабильного уровня делает TEER начинают увеличиваться. Когда TJ комплексы полностью сформированы и барьер ЕС полностью блокированы, TEER достигает своего максимального уровня. Это плато обычно достигается от трех до пяти дней после того, как пересев КЧС и сохраняется в течение еще 24 до 36 ч. Лучший момент времени для добавления Т-клеток в начале плато, которое гарантирует, что КЭ все еще жизнеспособными достаточно, чтобы быть культивировании совместно с Т-клетками. Как должно быть начато до оптимального момента времени для совместной культуры можно смело предсказали активации Т-клеток, может быть предпочтительным, чтобы стимулировать две партии Т-клеток в два разных дня, с тем чтобы повысить гибкость этого времени. И, наконец, группировка отдельных дублированных лунках перед добавлением Т-клеток к MBMECs должно быть сделано таким образом, что изменчивость внутри и между группами было минимальным. Это гарантирует, что начальные условия одинаковы во всех группах во время совместного культивирования Т-клеток и MBMECs. Наш протокол описывает измерение Тир во время совместного культивирования первичных мозга мыши КЕ с предварительно активированных CD4 + Т - клеток. Его простая форма позволяет несколько модификаций, в соответствии с научными потребностями. Например, тип, прочность и длительность стимула может изменяться. Антиген-специфические CD4 + Т - клетки могут быть активированы с помощью их родственным антигеном, в присутствии подходящих антиген-представляющих клеток (АРС); В качестве альтернативы, Т-клетки могут быть активированы с помощью поликлонально альфа-CD3 и α-CD28-антитела. Состояние активации Т-клеток можно модулировать с помощью различных цитокинов, блокирующие антитела, ингибиторы. Замена первичных ECs мозга с клеточных линий эндотелиальных, не рекомендуется, однако , как известно , что последние показывают менее ограничительные TJ комплексы и высокая проницаемость по сравнению с первичными клетками 43. В дополнение к измерению TEER в качестве первичного считывания, этот протокол обеспечивает хороший контроль качества monolay ECЦелостность эр до Т-клеточного анализа переселения (рис 3E, F). Следует отметить, что значения Teer не обязательно может уменьшаться во время трансмиграции Т - клеток поперек MBMECs (Рисунок 3E): это может отражать маршрут трансцеллюлярного иммунные клетки могут использовать во время перерождений, как было отмечено ранее 39,44.
В качестве активированных Т-клеток вызывают дисфункцию EC во время совместной культуры, ТЭЭУ показывает устойчивый, предсказуемый снижение, сравнимое по экспериментам с тех же самых условиях. Большее снижение TEER обычно сопровождается большим сопутствующим увеличением в БКК. В редких случаях, однако, увеличение в БКК может быть более выраженным , чем можно было бы ожидать от соответствующего уменьшения TEER (фиг.4С). Это несоответствие может отражать различные аспекты разрушения монослоя EC. Как КЭ попытаться закрыть пробелы, образовавшиеся во время разрушения барьера, они могут пройти динамические изменения вМорфология и моторики, такие как образующие выступы и увеличение их общей площади поверхности, каждая из которых может способствовать резкому и быстрому увеличению в БКК. Это делает изменения в БКК менее предсказуемы, по сравнению с изменениями в TEER. Таким образом, уровень снижения TEER остается самым надежным и представительным мера целостности барьера скомпрометированы.
Этот анализ может быть дополнен другими методами, чтобы исследовать эндотелиальные барьерные свойства. Это может сопровождаться анализом проницаемость, которая измеряет количество молекул различного размера , которые диффундируют через нарушенного монослоя EC 44. Для этой цели могут быть использованы флуоресцентно меченных декстран-конъюгаты, такие как флуоресцеин и Texas Red; другие молекулярные трассеры также доступны (например, сахароза, маннит, альбумин, синего Эванса и пероксидаза хрена) 26. Кроме того, иммунофлюоресценции микроскопии может быть использован для изучения изменений в экспрессии белкаи клеточная локализация TJ и молекул клеточной адгезии. Хотя представленная модель ВВВ очень проста, результаты, полученные с ним может дать ценную ориентацию для дальнейших анализов при более физиологических условиях. Такие анализы включают в себя (но не ограничиваются ими) анализ потока сдвига в пробирке в дополнение измерение Тир , полученные в статических условиях и в естественных условиях анализа проницаемости с голубого Эванса инъекции в живых мышей , чтобы учесть всю сложность ГЭБ.
Несмотря на то, чувствительный и надежный метод, описанный здесь, имеет определенные ограничения, которые заслуживают особого внимания. Максимальные значения Тир , измеренные в нашей экспериментальной установки достигает значений 35-40 Ом · см 2. Эти значения Teer значительно ниже , чем в естественных условиях, где различные типы и неклеточные компоненты способствуют целостности ГЭБ, но они также не столь высока , как ТЭЭУ значения получены в некоторых других моделях в пробирке ВВВ <SUP> 26,45,46. Это может быть улучшена путем добавления гидрокортизона в среде EC, которое было показано , чтобы заметно повысить барьерные свойства 27,47 - 49. Тем не менее, использование таких веществ - как известно, обладают противовоспалительным и иммунодепрессивное действие - не подходит для всех функциональных анализов. В центре внимания данного конкретного протокола о последствиях взаимодействия EC-Т-клеток на целостность барьера, интерпретация будет затруднена добавлением гидрокортизона. Использование протокола, представленный здесь, таким образом, позволяет производить оценку истинного воспалительного потенциала стимулированных Т-клеток, чтобы вызвать EC барьерную дисфункцию. Также стоит отметить, что прямое сравнение различных значений Тир в литературе следует проводить с осторожностью. Такие значения в значительной степени зависят от экспериментальной установки, они получены с различными типами клеток, высева плотности клеток, носителей, зоны роста клеток, а также системы измерения Тир (например , </ EM>, конструкция и размеры электродов).
Для того , чтобы более точно имитируют ситуацию в естественных условиях, комплекс в пробирке моделей БББ были созданы, где КЭ являются совместно культивировали с перицитах на противоположной стороне вкладыша мембраны, или где перицитов и астроцитов выращивают на дне лунок 12,25,50 - 52. В таких системах совместного культивирования, наводок между различными типами клеток позволяет более сильное ужесточение барьера, с тройным сокультурах быть лучшими в напоминающая ситуацию в естественных условиях и , таким образом , обеспечивая самые высокие значения Тир. Сложность этих систем, с другой стороны, представляет собой ограничение их более широкого использования , как и в пробирке моделей ВВВ.
Другим ограничением этой модели является отсутствие напряжения сдвига, которое было показано для улучшения целостности барьера 53,54. Чтобы преодолеть эту проблему, недавно были введены новые динамические модели ВВВ: ECs культивируют в полых волокон и подвергали пульсирующие условиях потока, имитируя более тесно микрососудов в естественных условиях 55,56.
Таким образом, этот протокол описывает модель ин витро ГЭБ , основанный на импедансной спектроскопии. Сосредоточив внимание на взаимодействии первичного мозга мыши эндотелиальных клеток с активированными Т-клетками, метод позволяет изучать свойства барьера при таком непосредственном контакте. Это имеет особое значение для понимания важнейших шагов в развитии воспалительных заболеваний центральной нервной системы, такие как рассеянный склероз и его животной модели EAE, в которой ВВВ является скомпрометированы во взаимодействии с КЧС энцефалитогенных Т-клеток. Описанный анализ позволяет исследовать последствия целенаправленного модуляции такого взаимодействия с использованием широкого спектра веществ, таких как блокирующие антитела, цитокины и ингибиторы активации Т-клеток. Метод является чувствительным, надежным и неинвазивныего измерения TEER и Ccl выполняются в автоматическом режиме. Все это делает его полезным и универсальным инструментом, который добавляет новый слой к богатому тела моделей ВВВ. Это может определенно расширить наши знания о свойствах ГЭБ при патофизиологических условиях, наблюдаемых при аутоиммунных заболеваниях, таких как MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарны Анника Engbers и Франк Курта за их отличную техническую поддержку и д-р Маркус Шефер (nanoAnalytics GmbH) за полезные обсуждения, касающиеся измерений Тир. Эта работа была поддержана Немецким Исследовательским (DFG), SFB1009 проект A03 к HW и LK, CRC TR128, проекты A08; Z1 и B01 для LK и HW и Межотраслевой Центр клинических исследований (медицинский факультет Мюнстере) Номер гранта kl2 / 2015/14 для LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
References
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A.
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S.
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
