Introduction
מחסום דם-המוח מפריד בין המחזור המערכתי ממערכת העצבים המרכזית (CNS) 1 - 3. הוא מספק מכשול פיזי מעכב את התנועה החופשית של תאים ואת דיפוזיה של מולקולות מסיסות במים מגן על המוח מפני פתוגנים ואפשרות חומרים מזיקים. בנוסף תפקוד המחסום שלה, BBB מאפשרת אספקה של חמצן וחומרים מזינים את המוח parenchyma, אשר מבטיח תפקוד תקין של רקמות עצביות. תכונות פעילות של BBB מוסדרות מאוד על ידי המרכיבים התאיים ו acellular שלה, עם ECS מאוד מיוחדת להיות האלמנט המבני העיקרי שלה. ECS של BBB מאופיינת על ידי הנוכחות של צומת חזק (TJ) מתחמים, חוסר fenestrations, פעילות pinocytic נמוכה מאוד, ואת מנגנוני הובלה פעילים באופן קבוע. רכיבים אחרים של BBB קרום המרתף EC, pericytes הטבעה האנדותל, הרגליים בסוף astrocytic ו = נקוב הקשוריםקרום במרתף enchymal גם לתרום לפיתוח, תחזוקה ותפקוד של BBB 2,4 - 6, ויחד עם נוירונים microglia, מהווים את יחידת העצבים וכלי הדם (NVU), המאפשר תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית 7 - 9.
במגוון מחלות נוירולוגיות, כגון ניווניות, מחלות דלקתיות או זיהומיות, הפונקציה של BBB נפגעת 2,5,10. חוסר וויסות של TJ מתחמי מנגנוני הובלה מולקולרי מוביל גדל חדירות BBB, extravasation לויקוציטים, דלקת ופגיעה עצבית. על מנת ללמוד נכסים BBB בתנאים pathophysiological כאלה, שונים במבחנה מודלים BBB הוקמו 9,11,12. יחד הם סיפקו תובנות רבות ערך את השינויים של מחסום שלמות, חדירות וכן מנגנוני הובלה. מודלים אלה מעסיקים תאי אנדותל של אדם, עכבר, חולדה, חזירי או בהמוצא כבש 13 - 18; תאי אנדותל ראשוני או שורות תאים בתרבית או כמו monoculture או יחד עם pericytes ו / או האסטרוציטים כדי לחקות באופן הדוק יותר את BBB in vivo 19 - 25. בשנים האחרונות, מדידת ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) הפכה לכלי מקובל להעריך נכסי מכשול אנדותל 26,27.
TEER משקף את עכבת שטף היונים על פני בשכבת תא הירידה שלה מספקת מדד רגיש של שלמות מחסום אנדותל שנפרץ ומכאן חדירות מוגברת. מערכות המדידה TEER שונים פותחו, כולל אפיתל Voltohmmeter (EVOM), חישה עכבה Cell-המצע חשמלי (ECIS), וניתוח התא בזמן אמת 15,28 - 30. TEER משקף את התנגדות שטף היון בין ECS הסמוכים (מסלול paracellular) והוא ביחס ישרמחסום שלמות. הספקטרוסקופיה עכבת 27,31, עכבה הכוללת מורכבת (Z) נמדדה, אשר מספקת מידע נוסף על שלמות המחסום ידי מדידת Ccl. Ccl מתייחס נוכחי קיבולי דרך קרום תא (מסלול transcellular): שכבת התאים מתנהגת כמו קבלים במעגל השווה החשמלי, הפרדת האישומים משני צידי הממברנה ואת עומדת ביחס הפוך על שלמות המכשול. כאשר גדל על מוסיף חדיר, ECS לדבוק, להתרבות על פני קרום microporous. זה מתנגד זרם קיבולי הרקע של הכנס (שבעצמו מתנהג כמו קבלים) ומוביל לירידת הקיבול עד שהוא מגיע לרמה המינימאלית שלה. זה ואחריו הקמת TJ מתחמים כי חותם מן החלל בין ECS הסמוך. זה מגביל את שטף היון דרך מסלול paracellular, ו TEER מגדילה עד שהוא מגיע לרמה שלה. בתנאים דלקתיים, אולם endotheliמחסום אל נפגע: TEER יורדת ככל TJ קומפלקסים לקבל שיבש Ccl מתחזקת ככל רכיב הקיבולים של הכנס עולה שוב.
מדידת TEER שלנו עושה שימוש במערכת תא ניטור 32 אוטומטית: מסקנה היא עיקרון ספקטרוסקופיה עכבה ומרחיב הבקשות הקודמות שלה. כאן אנו מתארים מודל BBB במבחנה המאפשר חקר תכונותיהם המחסום, כולל האינטראקציה של האנדותל מוח עם תאי חיסון; בפרט תאי T מופעלים. תנאי pathophysiological כאלה הם נצפו מחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית, כגון טרשת נפוצה ודלקת encephalomyelitis אוטואימוניות הניסוי במודל חיה שלה 33 - 37. כאן, צעד חיוני הוא הגלגול של encephalitogenic, תאי T ספציפי-המיאלין ברחבי BBB. זה ואחריו מחדש שלהם במרחב perivascular וכניסת parenchyma המוח, שם הם מגייסים תאי חיסון אחרים ואותידלקת diate ו demyelination עוקבת 1,35,38. עם זאת, מנגנונים מולקולריים של האינטראקציה בין תאי T כגון ותאי האנדותל, המרכיבים העיקריים של BBB, אינם מובנים היטב. הפרוטוקול שלנו שואף למלא את הפער הזה ולתת תובנה חדשות על ההשלכות על תאי האנדותל (כלומר, שלמות מחסום וחדירות) במגע הישיר שלהם גומלין מורכב עם תאי T מופעלים.
הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש בתאי אנדותל כלי הדם במוח העכבר העיקרי, גדל כמו בשכבה על מוסיף חדיר עם ממברנות microporous. תאי האנדותל הם שיתוף תרבותי עם תאי CD4 + T, אשר ניתן המופעל מראש או polyclonally או בצורה אנטיגן ספציפי. עמית תרבות MBMECs עם המופעל מראש, אבל לא נאיבי בתאי T גורם לירידה TEER וגידול Ccl, אשר מספק מדד כמותי של הפרעה בתפקוד מחסום MBMEC. הטכניקהפולשני הוא: היא משתמשת מובנהית במקום אלקטרודות מקל, אשר למנוע הפרעה עיקרית של monolayer EC; ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תפקוד מחסום ללא שימוש סמני תא. זה גורם מדידה רציפה באופן אוטומטי ומאפשר הערכה עצמאית של שני פרמטרים מחסומים (TEER ו CCL) בו זמנית לאורך זמן. השיטה היא גם רגיש מספיק כדי להבחין בין רמות שונות של הפעלת תא T ואפקטים של תאי T כזה על ECS.
ניתן להשתמש בו במגוון רחב של מבחנים תפקודיים: ציטוקינים שונים ו / או כמוקינים מעורבים בתהליכים דלקתיים ניתן להוסיף גם את התרבות המשותפת של MBMECs ותאי T; נוגדנים חוסמים נגד מולקולות הידבקות התא משני האיחוד האירופי או בצד T-cell יכול לשמש; ומעכבים של סמנים הפעלה תא T או נכסי cytolytic שלהם ניתן להוסיף במהלך יחול תאי T או שיתוף התרבות שלהם עם ECS. Assay הוא שימושי גם עבור גלגול T-cellמבחנים, כפי שהוא יכול לשמש בקרת איכות של שלמות monolayer MBMEC לפני התוספת של תאי T. כל זה הופך שיטה זו כלי תכליתי ואמין ללמוד את BBB במבחנה, תוך שימת דגש על ההשפעה של תאי T מופעלים על שלמות monolayer EC. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת להבנת המנגנונים של שיבוש BBB בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה במודל חיה שלה EAE, שבו תגובתי עצמית, תאי T encephalitogenic לחצות את BBB ולגרום דלקת ונזק עצבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבור כל הניסויים, עכברים גדלו ומתוחזק בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים במתקן החיה המרכזי באונ' מינסטר, על פי הנחיות גרמניות לטיפול בבעלי חיים. כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות ועדת האתיקה ניסיון בעלי החיים ואושר על ידי הרשויות המקומיות של נורדריין-וסטפאליה, גרמניה (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).
1. ניתוק MBMEC ותרבות
הערה: לבודד MBMECs כפי שתואר לעיל בפירוט 14 בשינויים הבאים:
- להקריב 20 מבוגרים C57BL / 6 עכברים (6-8 שבועות) משאיפת CO 2 ולאשר מותם ידי בירור מדום לב ונשימה.
- יש לשטוף את העכבר עם 70% אתנול ו לערוף אותו במספריים; להסיר את הקרקפת בעזרת מלקחיים ומספריים. ודא חתכים בצד שמאל וימין של הגולגולת, החל מגנום foramen. הרם את הגולגולת מצד הזנב שלה takדואר את המוח עם מלקחיים.
- מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית, להשתמש במלקחיים סטרילי כדי למקם את המוח בצלחת פטרי ולהסיר את גזע המוח, המוח הקטן, ו התלמוס, והותירה רק את הקליפה.
הערה: השימוש במיקרוסקופ אינו הכרחי עבור כל אחד משלבים אלה. - מניח את הקליפה על גבי פיסת נייר סופג המערבי סטרילי ולגלגל אותו בעדינות עם מלקחיים עד קרומי המוח אינם גלויים.
- לאחר עיכול מכני אנזימטיות (בעקבות פרוטוקול 14), לאסוף תאי האנדותל מן שיפוע צפיפות באמצעות מחט ארוכה, סטרילי הבוכנה 5 מ"ל. תאי האנדותל להופיע כשכבה עכורים מעל הטבעת האדומה עם אריתרוציטים. העברה 20-25 מ"ל של שכבה זו לתוך צינור צנטריפוגה חדשה 50 מ"ל; למעלה מעלה את הצינור עם DMEM.
- אחרי שני סיבובים של כביסה 14, resuspend תאי 6 מיליליטר של מדיום MBMEC המכיל puromycin (4 מיקרוגרם / מיליליטר) וזרע אותם על שש בארות מצופות של צלחת 24 גם; להשאיר אותם בתוך רקמותתרבות חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (המכונה 'החממה' מכאן ולהבא) במשך שלושה ימים.
הערה: לפרטים של פתרון הציפוי MBMEC, ראה חומרים טבלה. - שינוי המדיום על ידי הוספת 1 מ"ל היטב בכל מדיום MBMEC טריים ללא puromycin; לשים את הצלחת בחזרה 37 ° C ו 5% CO 2 במשך יומיים נוספים.
2. קציר MBMECs
- ביום חמש לאחר בידוד MBMEC, מוסיף חדיר טרום מעיל עם פתרון הציפוי MBMEC: להוסיף 80 μl של פתרון לכל הכנס ולהשאיר אותם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 שעות.
- בזהירות פיפטה את פתרון הציפוי ולתת להתייבש באוויר מוסיף למשך 30 דקות. הוסף 2 מ"ל של בטמפרטורת החדר (RT) PBS היטב בכל צלחת, באמצעות MBMECs לשטוף המדיום; חזור על שלב זה. להוסיף 0.05% טריפסין- EDTA (300 μl לכל היטב) ולהשאיר את הצלחת בחממה במשך 5-10 דקות.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום MBMEC היטב כל להפסיקtrypsinization. העברת התאים שנאספו לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ו צנטריפוגות אותם ב 700 XG במשך 8 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של מדיום MBMEC ללא puromycin.
- ספירת התאים; לערבב 10 μl של ההשעיה תא עם 90 μl של 0.04% Trypan כחול (10x דילול של תאים). פיפטה 10 μl של תערובת זו בין כיסוי זכוכית תא ספירת תאים (hemocytometer). רוזן Trypan תאים הכחול-חינם בכל ארבעת הרביעים של החדר (N) ולקבוע את המספר הממוצע של תאים ספרתיים (N ') כדלקמן: N' = N / 4.
- חשב את הריכוז התא (ב 10 6 תאים / מ"ל) באמצעות הנוסחה הבאה: C = N 'x 10 x 10 4, שבו 10 4 ניתנת על ידי ממדים של hemocytometer ו -10 הוא גורם לדילול משלב 2.4.
- Seed 2 x 10 4 תאים בנפח של 260 μl לכל כנס. להוסיף 810 μl של מדיום MBMEC לתא התחתון של כל טוב. מניח את הצלחת עם מוסיף בחממה עד מוכן להמשיך עם סעיף 4.
הערה: הכרכים עבור התא העליון ותחתון הם כנס ספציפי ואינו פועלים בכל פורמטי 24 גם.
בידוד גירוי תא 3. CD4 + T
- בידוד תא CD4 + T
- קורבן עכבר בוגר אחד (6-8 שבועות) משאיפת CO 2 ולאשר למוות על ידי בירור מדום לב ונשימה.
- מניחים את העכבר על גבו על קרש החיתוך נקי ולשטוף אותו עם 70% אתנול; להשתמש מספרי מלקחיים סטרילית כדי לפתוח את הצפק ולהסיר את בלוטות הטחול הלימפה (מפשעתי, בבית השחי, זרוע ואת צוואר רחם); ולבסוף, להעביר את הרקמה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS על הקרח.
- מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית, להעביר את רקמות באמצעות אחסון PBS עם רקמה לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם מסננת תא 70 מיקרומטר על גבי; homogenizeאת הרקמה על ידי לחיצה אותו עם הבוכנה 1 מ"ל דרך מסננת.
- הוסף 30 מ"ל של חיץ צנטריפוגות FACS זה ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant ו resuspend התאים ב 10 מ"ל של חיץ FACS. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר, להוסיף עוד 20 מ"ל של חיץ FACS אל הצינור.
- צנטריפוגה זה ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant ו resuspend התאים 500 μl של חיץ FACS.
- הוסף 20 μl של microbeads מגנטי העכבר CD4, מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 °. הוסף 25 מ"ל של חיץ צנטריפוגות FACS זה ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
- בינתיים, למקם עמודת הפרדה LS לתוך המגנט ולשטוף אותו עם 3 מ"ל של חיץ FACS. בטל supernatant ו resuspend התאים ב 3 מ"ל של חיץ FACS.
- הוספת תאים לעמודה. לשטוף את העמודה עם 3 מ"ל של חיץ FACS שלוש פעמים. הסר את העמודה המגנט ומניחים אותו על גבי centri חדש 15 מ"לצינור fugation. הוסף 5 מ"ל של חיץ FACS, לשטוף את התאים שכותרתו עם הבוכנה עמודה צנטריפוגות זה ב XG 500 עבור C ° 5 דקות 4.
- בטל supernatant ו resuspend התאים ב 3 מ"ל של המדיום הסלולרי T. ספירת התאים כמתואר 2.4 וזרעי 1 x 10 5 תאים ב 100 μl של מדיום בכל טוב.
- גירוי תא T מסוג CD4 +
- גירוי התאים Polyclonal CD4 + T
- מעיל טרום צלחת 96-היטב מסביב לתחתית עם נוגדן אנטי עכבר CD3 מטוהרים (שיבוט 145-2C11) ב- PBS, בריכוז הסופי הרצוי. לדוגמה, מראש לצפות את צלחת מלאה עם α-CD3 ב 1 מיקרוגרם / מ"ל, לערבב 10 μl של הנוגדן (ריכוז המניות = 0.5 מ"ג / מ"ל) עם 5 מ"ל של PBS, מערבולת ולהוסיף 50 μl של תערובת כל טוב עם טפטפת רב.
- השאר את הצלחת בחממה במשך 3 שעות. לאחר לבודד את תאי ה- T, לשטוף את הצלחת מראש מצופה פעמים עם PBS. הוסף נוגדן אנטי CD28 מטוהר (שיבוט37.51) לתאי T מבודדים בריכוז סופי רצוי (למשל, 1 מיקרוגרם / מיליליטר); לערבב היטב. זרעים תאי T ולהשאיר אותם בחממה במשך יומיים עד שלושה ימים.
- אנטיגן ספציפי גירוי תא CD4 + T עם תאים דנדריטים (DCS)
הערה: אם DCs משמש תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים), בצע את פרוטוקול בידוד תא T, עם חריגים אלה:- לפני שמאחד את הטחול, להזריק אותו עם 1 מ"ל של Collagenase סוג IA PBS ב 0.5 מ"ג / מ"ל ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר שטיפה עם PBS, resuspend גלולה במאגר FACS ולהוסיף 20 μl של microbeads המגנטי CD11c העכבר, במקום microbeads CD4.
- השתמש בעמודה ההפרדה MS והיקפי המתאים: לשטוף את העמודה עם 1 מ"ל של חיץ FACS; תאים גלולה ב 1 מ"ל של חיץ FACS ולשטוף את העמודה עם 1 מ"ל של חיץ FACS שלוש פעמים.
- מוֹדָעָהאנטיגן D של הבחירה DCS (למשל, גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (ש"א) aa 35-55 ב 20 מיקרוגרם / מ"ל) בינוני תרבות, מערבבים היטב זרע 5 x 10 4 תאים 100 μl של תא T לכל 96 סיבוב-קרקעית הנהר טוֹב.
- הוסף 1 x 10 5 T תאים 100 μl של מדיום תרבית תאי T שידורים גם 96-מסביב לתחתית בסוף, כמתואר בידוד תא פרוטוקול T.
- אנטיגן ספציפי גירוי תא CD4 + T עם תאי B
הערה: אם תאי B משמשים נגמ"שים, בצע את פרוטוקול בידוד תא T, עם חריגים אלה:- השתמש טחול מעכברים מהונדס B אשר התאים אנטיגן ספציפי (למשל, IGH ש"א (Th) עכברים, תאי B אשר במיוחד להכיר MOG 35-55).
- השתמש בתאי T אנטיגן ספציפי (למשל, מ TCR ש"א (2D2) עכברים). הוסף 20 μl של microbeads מגנטי העכבר CD19 במקום microbeads CD4.
- מוסיפים את האנטיגן של בחירה על cel Bls (למשל, MOG 35-55 ב 20 מיקרוגרם / מ"ל), מערבבים היטב זרע 5 x 10 4 תאים 100 μl של המדיום תרבית תאים B לכל 96-מסביב לתחתית היטב.
- הוסף 1 x 10 5 T תאים 100 μl של מדיום תרבית תאי T לכל 96-מסביב לתחתית היטב, כמתואר בפרוטוקול בידוד תא T.
- גירוי התאים Polyclonal CD4 + T
4. הגדרה וביצוע מדידת TEER
- מניחים את מודול 24 גם של המכשיר TEER מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. הסר את המכסים ותוספות מקום עם MBMECs במכשיר באמצעות מלקחיים.
- פיפטה 810 μl של מדיום חדש לתא התחתון של בארות מודול: להוסיף אותו בזהירות בין הכנס ואת הקיר של מודול היטב.
- סגור את המכסים ומניחים המכשיר בחממה. חברו את המכשיר למחשב שלה; להפעיל את בקר המכשיר ולפתוח את התוכנה.
- בחר "מדידה חדשה 'בחלון המוקפץ. צ'הck "להראות TEER 'ותיבות' הצג Ccl '; ולאחר מכן הקש 'להתחיל'. לאחר סיום המדידה הראשונה, בחר 'לבדוק את כל הבארות' בכרטיסייה 'התוצאות' כדי לראות את כל ערכי TEER ו Ccl.
- שמור את הקובץ: קובץ> שמור בשם> "בשם הקובץ שלך '.
הערה: כפי TEER ו Ccl נמדדים בצורה רציפה בצורה אוטומטית, לפקח ערכיהם על פני תקופה של שלושה עד חמישה ימים. שינוי המדיום הוא לא הכרחי, אלא אם כדאיות התא הוא הכי מוצלח, כמו דמיינו ידי חוסר הגידול TEER. - בחר את נקודת הזמן לשתף תרבות MBMECs עם תאי T כאשר Ccl יציב ונמוך 1 μF / 2 ס"מ TEER הגיע לרמה המקסימלית שלה.
- בזהירות לבדוק ערכי TEER ו Ccl מוחלטים שולל את הבארות שבו MBMECs לא פתח monolayers מספיק ומחוברות על ידי ביטול סימון בארות כאלה.
- קבוצה שאר הבארות: לחץ לחיצה ימנית על באר ובחר 'להוסיף לבאר ממוצע חדש'. נאמתידואר אותו בחלון המוקפץ; לעשות את אותו הדבר עבור להיות מקובצים כל הבארות הבודדות.
- בדקו את כל הבארות הממוצעות לאשר כי כולם יש את אותו תנאי ההתחלה לפני לתרבות המשותפת. אם יש כמה ערכים מוחלטים TEER שונה מהותית או TEER המדרונות, או סטיות התקן הם גדולים מדי, לעשות שוב את הקיבוץ.
הערה: הקיבוץ האופטימלי של בארות מספק וריאציה מינימאלית בערכי TEER, הוא בתוך ובין קבוצות ניסוי. - בלשונית 'ניסוי', 'השהה' העיתונות, נתק את המכשיר ולקחת אותו מתוך האינקובטור. הסר את המכסים מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית.
- הכן מראש מופעל ו / או תאי T נאיבי, עם או בלי ציטוקינים ספציפיים, נוגדנים או חומרים אחרים, לפי הצורך: לדוגמא: לערבב מטוהרים NA / LE עכברוש אנטי עכבר IFN-γ נוגדן (שיבוט XGM1.2) עם מוכן T תאים, ב 20 מיקרוגרם / מ"ל לכל טוב של המכשיר TEER.
הערה: אם חומרים כגון מעכבי granzyme B משמשים, הםdded לתרבות תאי T בתחילת גירוי תא T: למשל, II B המונע Granzyme (Calbiochem) מעורבב עם תאי T מבודדים בריכוז של 10 מיקרומטר סופי DMSO. ראה חומרים וציוד לקבלת פרטים נוספים. - הסר חלק המדיום מן הכנס (תא היטב העליון): למשל, בזהירות פיפטה מתוך 150 μl (הסרת כל מדיום יש להימנע ככל שזה יכול להפריע בשכבה MBMEC).
- הוספת תאי T כדי MBMECs ידי pipetting בזהירות 150 μl של מדיום המכיל 2 x 10 5 תאים / להוסיף.
הערה: בעת קצירת תאים טרום מופעל T, לספור רק פיצוץ, Trypan תאים כחול-חינם. - סגור את המכסים ומניחים את הכלי מהר בחזרה אל האינקובטור. חבר מחדש את המכשיר ולחץ על 'מדידת קורות חיים'. לאחר 24 שעות, לחץ על 'עצור' בלשונית 'ניסוי' ולשמור את הקובץ (File> Save).
5. ייצוא נתונים וניתוח סטטיסטי
- לייצא את התוצאות על ידי בחירת קובץ> יצוא.
- בכרטיסייה "הגדרות" של חלון מוקפץ, בחר ".dot" באפשרות "המפריד העשרוני" ו "טַבלָר" באפשרות "תוחם השדות".
- בלשונית "תוצאות יצוא", שם הקובץ, לבדוק את כל הבארות להיות מיוצאות, וסמנו את "TEER" ו "Ccl" תיבות "נתונים לבחור" האפשרות.
- לחץ "נתוני היצוא," לפתוח את הקובץ המיוצא, ולהעתיק את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
- לנרמל את הנתונים המיוצאים (הממוינים לפי כל לשכפל, עם ערכי TEER ו Ccl הנתון עבור כל מחזור (מדידה)): סט TEER ו Ccl ערכים של הנקודה בפעם האחרונה לפני שיתוף התרבות עד 100% ולשנות בהתאם את הערכים עבור כל האחרים ריצות, ביחס בטווח '100%'.
- העתיקו נתונים מנורמלים תוכנה של בחירה כדי ליצור גרף, באמצעות בארות בודדות ולהציג את סטיית ההתקן של הממוצע עבור כל קבוצת טיפול.
- Perform מבחן סטטיסטי ANOVA דו כיוונית עם תיקון Bonferroni להשוואות מרובות, באמצעות תוכנת הבחירה הסטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מספק סקירה כללית של המודל במבחנה BBB לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי T ותאי האנדותל. הניסוי מורכב משלושה שלבים עיקריים. הצעד הראשון הוא הבדידות של MBMECs ראשית ממנהל בקורטקס המוח, ותרבותם במשך חמישה ימים. כשהם מגיעים למפגש בצלחת תרבית תאים, MBMECs הוא trypsinized ו reseeded על מוסיף חדיר, אשר ממוקמים אז מכשיר TEER. TEER ו Ccl של MBMECs נמדדים בצורה רציפה פיקוח על פני תקופה של שלושה עד חמישה ימים. בינתיים, תאי T הם מבודדים, מגורה (שלב 2), ותרבותי עבור יומיים עד חמישה ימים, סוג של כוח הגירוי. בשלב 3, תאי T מתווספים ושיתוף תרבותי עם MBMECs כאשר Ccl הוא ברמה נמוכה ויציבה ואת TEER הוא ברמה המקסימלית שלה. בחירה זה נקודת זמן עבור שיתוף התרבות כאשר TEER הוא עדיין הרמה שלה היא קריטית להצלחההמדידה כולה. לכן, חשוב מאוד כי נקודת זמן בידוד תא T והגירוי נבחרה בקפידה, כך שתאי T להגיע לרמה הרצויה של הפעלה על ידי בזמן ובצירופן אל ECS. לאחר הוספת תאי T, המדידה תתחדש ליום אחד יותר ואת התוצאות מנותחות.
לאחר התרבות של חמישה ימים הראשוניים, MBMECs להראות מורפולוגיה בצורת כישור מאפיין בקלות (איור 2 א, פנל משמאל) ולהביע סמני תא ספציפי האנדותל כגון PECAM-1 ו- Claudin-5 (איור 2 א, אמצע לוחות מימין). עם זאת, זה לבדו אינו מספק ראיות מספיקות של המפגש שלהם המלא ושלמות מחסום נאות. ספקטרוסקופיה עכבה, ומצד שני, נותנת הערכה טובה של שלמות monolayer ומשמשת בקרת איכות של כל טוב לפני ההופעה של assay תפקודית. באיור 2B, רובבארות כלולות MBMECs שערכיה Ccl היו יציבים ונמוכים, וערכי TEER שלהם קפאו. בארות אלה שימשו לניסויים שיתוף התרבות שלאחר מכן. הם קובצו בצורה כזאת כי השונות בתוך ובין הקבוצות היה מינימלי לפני הוספת תאי T (איור 2 ג). הבארות שערכיה TEER שונים משמעותי משאר (כגון עקומת הכחול מופיעה באיור 2B) לא שמשו, כפי שהם יביאו לתוצאות מעורפלות או פרשנות שגויה של הנתונים.
ובלבד דרישות ראשוניות לתרבות MBMEC וגירוי תאי T מולאו, ספקטרוסקופיה העכבה יכולה לתת תובנה חשובות לגבי אינטראקצית התא-EC T. מדידת TEER יכולה לשמש את ההודעה העיקרית אינטראקציה כזו מידה של חוסר תפקוד EC T תא בתיווך, כפי שמוצגת באיור 3 א ו 3 ב. במקרה זה, MBMECs גדל על מוסיף עם micropores 0.4מיקרומטר קוטר, אשר אינו מאפשר תאי T לעבור דרך הממברנה הכנס. איור 3 א מציג זה דרבן בלבד, אך לא נאיבי ותאי T הם מסוגלים גרימת תפקוד EC, כפי שנקבעו על-ידי ירידת TEER ועליית Ccl. תאים הנאיביים T ולכן יכולים לשמש כביקורת שלילית, מאז TEER ו Ccl במהלך שיתוף התרבות עם תאי T נאיביים להישאר ברמות הראשוניות שלהם. היוצא מן הכלל הוא השיא בתחילת מאוד של שיתוף תרבות, הנגרמת על ידי טיפול המכשיר (הרמת העפעפיים, הוספת מדיום חדש עם תאים שיש בהם טמפרטורות מעט שונה וערכים pH, וסגירת העפעפיים). חפץ זה מופיע עם כל מיני מדידות TEER והוא התעלם במהלך הניתוח. התוספת של הפרו דלקתי ציטוקינים IFN-γ ו- TNF-α (ב 100-500 U / ml), אשר ידועים להיות מסוגל גרימת דלקת EC, יכול לשמש כביקורת חיובית. באיור 3 א, MOG 35-55 CD4 -specific
על מנת לחקור את המנגנונים של השיבוש בשכבת MBMEC תאר, גישות שונות ניתן להשתמש. תוצאות באיור 3C מראים כי תאי T מגורה, אבל לא supernatants שלהם גרמה נזק משמעותי MBMECs, המציין כי מגע ישיר בין תאי T ו MBMECs הוא קריטי עבור שיבוש מחסום. יתר על כן, תוספת של נטרול α-ליFN-γ נוגדנים במהלך המדידה TEER רק השתפר מעט נכסים MBMEC מחסום, דבר המצביע על כך IFN-γ לא יכול להיות הגורם העיקרי של שיבוש זה. מצד השני, הוספת granzyme B המונע שני לתרבות תאי T (האיור 3D) משוחזר שלמות MBMEC במידה רבה יותר, מצביע על מולקולת cytolytic זה כשחקן חשוב בגרימת ניזק MBMEC והירידה הבאה ב TEER.
מלבד השימוש בו בתור הודעה עיקרית השפעת תאי T על שלמות monolayer EC, מדידת TEER יכולה לשמש גם כשלט איכות שלמות מכשול בטרם מבחנים אחרים, כגון assay גלגול T-cell. במקרה זה, מחדיר עם micropores של 3 מיקרומטר בקוטר משמש. באיור 3E, מדידת TEER בוצעה על מנת להבטיח כי monolayer MBMEC היה של באותה הרמה של שלמות בכל הבארות לפני התוספת של תאי T עבור transmigratio עוקבתassay n. זאת בעקבות קצירה של תאי T מהתא התחתון של בארות המכשיר, מכתים תאי T עם נוגדן α-CD4 וזרימת ניתוח cytometric, באמצעות חרוזי ספירת תאים כדי לקבוע במספרים מוחלטים של תאי T transmigrated; שמוצג באיור 3E, באמצע וימין). הערה זה דרבן תאי T משמשים גלגול לא לגרום לירידה משמעותית TEER, למרות שהם היו מראש מופעל כמו איור 3 א. זה יכול לשקף את מסלול transcellular תאי חיסון עשויים להשתמש במהלך הגלגול, כמו נצפה בעבר 39. באיור 3F, מחצית הבארות עם MBMECs היו דלוקות עם-γ IFN ו- TNF-α (uninflamed vs. מודלק), ובהמשך, תאי T נאיבי נוספו להערכת פעילות transmigratory. במקרה זה, מדידת TEER ספקה רמז לגבי אופן חזק הדלקת עם ציטוקינים הייתה וכאשר תאי T יש להוסיף עבור transmigration.
איור 4 מראה חלק מהמצבים הנפוצים ביותר שעשויה להוביל לפרשנות שגויה של תוצאות TEER. באיור 4 א, למשל, לא כל MBMECs פיתח monolayer ומחוברות במלואו בעת ובעונה אחת. אחת הקבוצות ( "תאי T נאיבי - נשלל ') הכיל MBMECs אשר מתחמי TJ היו התבגרות בקצב שונה לעומת הקבוצות האחרות רק לפני תוספת של תאי T. קבוצה זו וכתוצאה מכך פיתחה ערכים TEER מעל 100% במהלך הניסוי ואת הוצא ניתוח נוסף. לכן, השיפוע של העקום TEER (השיעור של התבגרות TJ) לפני הניסוי חשוב כמו ערכי TEER מוחלטים נתונים לפרשנות נכונה. איור 4B מראה כי החל שיתוף התרבות לא רק מוקדם מדי אבל גם מאוחר מדי יכול להוביל לתוצאות שווא. כאן, היא הקבוצה עם תאי T מגורים לבין קבוצת הביקורת השלילית (בינוני צ'אנגה), ערכי TEER כבר עברו הרמה שלהם והחלו להקטין במנותק תנאי הניסוי, ולכן מציין תנאי תרבות לא טובים לפני ובמהלך הניסוי. קבוצות כאלה לא צריכים להיכלל בניתוח. לבסוף, למרות TEER ו Ccl בדרך כלל לשנות את ערכיהם בצורה כזו כי ירידה גדולה יותר TEER מלווה לעלייה גדולה יותר Ccl, זה לא תמיד המקרה. באיור 4C, מגורה תאי T B גרמו לירידה גדולה יותר TEER, אך גידול קטן יותר Ccl מאשר תאי T ועורר בה עשה.
איור 1: סקירה כללית של הטכניקה. לאחר התרבות הראשונית, MBMECs הוא reseeded על מוסיף חדיר והניח לתוך צג התא האוטומטי; TEER ו Ccl נמדדים כל שעה למשך 4-5 ימים. בינתיים, תאי T מופעלים במבחנה 40. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: MBMECs לפתח בשכבה ומחוברות מתאימה מודל במבחנת BBB. (א) מורפולוגיה ציר-צורה (משמאל) מכתים immunofluorescent של PECAM-1 (באמצע) Claudin-5 (מימין) חמישה ימים לאחר בידוד MBMEC. (B ו- C) TEER ו Ccl ערכים לפני (B) ואחרי (ג) קיבוץ בארות בודדות, לא לפניבנוסף o של תאי T. העקומה הכחולה (B) אינה משמשת לצורך הניסוי, מאז MBMECs היטב זה לא פתח TEER גבוה ככל בבארות האחרות. הנתונים (C) הצג ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: נציג תוצאות. שינויים (AD) ב TEER כאמצעי עיקרי של חוסר תפקוד MBMEC על אינטראקציה עם תאי T. (א) תאי T MOG ספציפי הופעלו כתוצאה תאי B MOG ספציפי בנוכחות פפטיד MOG 35-55 במשך חמישה ימים. תאי T נאיביים הפר דלקתי ציטוקינים IFN-γ ו- TNF-α (שניהם ב 100 U / ml) שמשו כביקורת שלילית וחיובית, בהתאמה. (B) תאי T היו מגורה עם α-CD3 ונוגדנים α-CD28 (1 מיקרוגרם / מ"ל כל אחד) עבור שניים או שלושה ימים, כפי שצוין, לפני הוספתם MBMECs. (C) ותאי T (טרום מופעלים כמו ב (א)) או supernatants שלהם, בנוכחות נוגדנים α-IFN-γ או באמצעות שלט אלוטיפ המקביל. (ד) תאי T (מראש להפעילם מספר בלתי מוגבל (ב)) במשך יומיים, בנוכחות מעכב granzyme B II או DMSO diluent שלה. (E ו- F) מדידה TEER לשמש רק כאמצעי בקרת איכות עבור שלמות המכשול בטרם גלגול T-cell. MBMECs גדל על מוסיף עם נקבוביות 3 מיקרומטר קוטר. (E) ותאי T, מגורה כמתואר ב (א), היו מניחים את מתגלגל במשך 18 שעות (משמאל). לאחר מכן, הם נקצרו, מוכתם עבור נוגדן α-CD4 (שיבוט RM4-4) ונותחו על ידי זרימת cytometry, באמצעות חרוזים ספירת תאים (באמצע וימין). (F)ניטור של שלמות monolayer MBMEC על גירוי עם-γ IFN ו- TNF-α, ובחירת נקודת הזמן המתאימה בנוסף בא של תאי T עבור assay גלגול. תוצאות (AF) להראות triplicates טכנית מייצגות שלושה ניסויים בלתי תלויים אחד. הנתונים מראים ממוצע ± SEM. (E, מימין) מזווג, שני זנב מבחן t של סטודנט. **, P <0.01. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: שיקולים פרקטיים נתונים לפרשנות. (א) MBMECs מאחד קבוצת הניסוי (עקומת אדום) לא נכללו בניתוח, שכן קצב ההבשלה של מתחמי junctional שלהם הושווה שונות גר אחריםoups. (ב) דוגמה להוספת תאי T מאוחר מדי, מה שמנע הערכה נכונה של תפקוד לקוי MBMEC. (ג) עם ההפרעה על ידי א 'תאי מגורה T (עקומה שחור), ערכי Ccl של MBMECs הראה עלייה דרמטית יותר ממה שאפשר לצפות מהירידה המקבילה TEER לגרום לאותם תאי T. (AC) תאי T היו מגורה עם α-CD3 ונוגדנים α-CD28 (1 מיקרוגרם / מ"ל כל אחד) במשך יומיים. התוצאות מראות triplicates טכנית מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים אחד. הנתונים מראים ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמה שלבים של הפרוטוקול המתואר חיוניים עבור ניסוי מוצלח. במהלך הבידוד MBMEC הראשונית ותרבות, חשוב כי העבודה נעשית בתנאים סטריליים ככל האפשר, כדי למנוע את הזיהום של תרבית תאים עם נבגי פטריות או חיידקים. על מנת לקבל תרבות טהורה של ECS, מומלץ להשתמש במצע המכיל puromycin עבור שלושת הימים הראשונים, המאפשר הישרדות של ECS, אבל לא סוגי תאים אחרים (במיוחד pericytes) 41,42. עוד צעד קריטי, כי ראוי לתשומת לב מיוחדת הוא זיהוי של נקודת הזמן הנכונה להוספת תאי T מראש הופעלו. במהלך 48 השעות הראשונות של MBMECs מדידת TEER להתרבות על מוסיף חדיר ולסגור את הפערים בין אחד לשנייה. לפיכך, Ccl פוחתת עד שהוא מגיע לרמה יציבה ונמוכה (סביב 0.6 μF / 2 ס"מ). זהו הסימן הראשון של בשכבת EC ומחוברת, אבל הוא עדיין לא סימן של מחסום חזק. רק אחריCcl הגיע לרמה יציבה עושה את TEER להתחיל להגדיל. כאשר מתחמי TJ נוצרים באופן מלא לבין מכשול EC מסוגר לחלוטין, TEER מגיע לרמת המקסימלית שלה. רמה זו בד"כ הגיעה שלושה עד חמישה ימים לאחר הזריעה מחדש ECS והוא מתוחזק על 24 עד 36 שעות אחרות. נקודת הזמן הטובה ביותר להוספת תאי T היא בתחילת הרמה, אשר מבטיחה כי ECS עדיין קיימא מספיק כדי להיות שיתוף תרבותי עם תאי T. כמו הפעלת תא T צריך להיות יזם לפני נקודת הזמן האופטימלית לתרבות משותפת ניתן לחזות בבטחה, זה יכול להיות יתרון לעורר שתי קבוצות של תאי T על ימים שונים על מנת להגדיל את הגמישות של תזמון זה. לבסוף, קיבוץ בארות לשכפל בודדים לפני הוספת תאי T אל MBMECs צריך להיעשות בצורה כזאת, כי השתנות בתוך ובין הקבוצות הן מינימאליות. הדבר מבטיח כי התנאים הראשוניים שווים בין כל הקבוצות במהלך שיתוף התרבות של תאי T ו MBMECs. הפרוטוקול שלנו מתאר מדידת TEER במהלך התרבות המשותפת של ECS מוח עכבר העיקרי עם תאים טרום מופעל CD4 + T. טופס פשוט שלה מאפשר שינויים מרובים, בהתאם לצרכים מדעיים. למשל, הסוג, כוח, ומשך הגירוי יכולים להיות מגוון. אנטיגן הספציפי CD4 + T תאים יכולים להיות מופעלים על ידי אנטיגן מאותו המקור שלהם, בנוכחות תאי מציגי אנטיגן המתאימים (נגמ"שים); לחילופין, תאי T יכול להיות מופעל על ידי polyclonally α-CD3 ונוגדנים-CD28 α. את מצב ההפעלה תא T יכול להיות מווסת על ידי ציטוקינים שונים, חסימת נוגדנים, מעכבים. החלפת ECS המוח העיקרית עם שורות תאים האנדותל אינה מומלצת, עם זאת, כפי שהוא מוכר שהמופע האחרון פחות מגביל מתחמי TJ וחדירות גבוהה לעומת התאים הראשוניים 43. בנוסף למדידת TEER כמו את ההודעה הראשית, פרוטוקול זה מספק בקרת איכות טובה של monolay ECאה שלמות לפני assay גלגול T-cell (איור 3E, F). מן הראוי לציין כי ערכי TEER לא בהכרח לרדת במהלך גלגול של תאי T ברחבי MBMECs (איור 3E): זה יכול לשקף את המסלול transcellular תאי חיסון עשויים להשתמש במהלך גלגול, כמו נצפתה בעבר 39,44.
כמו תאי T מופעלים לגרום בעיות בתפקוד EC במהלך שיתוף התרבות, TEER מצביע על ירידה קבועה, צפויה, דומה על פני ניסויים עם אותם התנאים. ירידה גדולה יותר TEER מלווה בדרך כלל על ידי הגדלה מקבילה יותר Ccl. במקרים נדירים, עם זאת, גידול Ccl יכול להיות בולט יותר ממה שאפשר לצפות מן הירידה המקבילה TEER (האיור 4C). פער זה עשוי לשקף היבטים שונים של הפרעת monolayer EC. כפי ECS לנסות לסגור את הפערים שנוצרו במהלך שיבוש המחסום, הם יכולים לעבור שינויים דינמייםמורפולוגיה ותנועתיות כגון להרכיב בליטות והגדלת שטח הפנים הכולל שלהם, כל אחד מהם יכול לתרום עלייה דרמטית ומהירה Ccl. זה עושה שינויים Ccl פחות צפוי, בהשוואה לשינויים TEER. לפיכך, רמת הירידה TEER נשאר מדד אמין והייצוגי ביותר של יושרה מחסום נפגעת.
assay זה יכול להיות כהשלמת טכניקות אחרות כדי לחקור נכסי מכשול האנדותל. זה יכול להיות מלווה על ידי assay החדיר, אשר מודד את כמות מולקולות בגדלים שונים כי לנטרל באמצעות בשכבת EC שבש 44. לשם כך, conjugates dextran שכותרתו fluorescently, כגון והעמסה ו אדום טקסס יכול לשמש; קליעים נותבים מולקולריים אחרים זמינים גם (למשל, סוכרוז, מניטול, אלבומין, כחול אוונס peroxidase חזרת) 26. יתר על כן, מיקרוסקופיה immunofluorescence יכול לשמש כדי לחקור את השינויים בביטוי חלבוןואת הלוקליזציה הסלולר של מולקולות דבקות TJ ותא. למרות מודל BBB המוצג הנו פשוט מאוד, התוצאות שהושגו עם זה יכול לספק אורינטצית ערך עבור מבחנים נוספים בתנאים פיסיולוגיים יותר. מבחנים אלו כוללים (אך לא רק) במבחנת assay זרימת גזירה להשלים מדידת TEER שהושגה בתנאים סטטיים ב assay החדירה vivo עם הזרקה הכחולה אוונס לתוך חי עכברים כדי להסביר את המלוא המורכב של BBB.
למרות רגיש ואמין, השיטה המתוארת כאן יש מגבלות מסוימות מצדיקות התייחסות מיוחדת. ערכי TEER המרביים שנמדדו ההתקנה הניסיונית שלנו מגיעים לערכים של 35-40 Ωcm 2. ערכי TEER אלה נמוכים בהרבה in vivo, שבו תאים מסוגים שונים ורכיבי acellular לתרום השלמות של BBB, אבל הם גם לא גבוהים ככל TEER וערכים מושגים בחלק אחר במבחנת מודלי BBB <sup> 26,45,46. זה יכול להיות משופר על ידי התוספת של הידרוקורטיזון למדיום EC, אשר הוכח במידה ניכרת כדי לשפר נכסי מכשול 27,47 - 49. עם זאת, השימוש בחומרים אלו - ידועים כבעל השפעות אנטי דלקתיות אימונוסופרסיבי - הוא לא מתאים לכל מבחנים התפקודיים. כמוקד של פרוטוקול המסוים הזה הוא על ההשלכות של אינטראקציות תא EC-T על שלמות מחסום, פרשנות תהיה הקשתה על ידי התוספת של הידרוקורטיזון. באמצעות הפרוטוקול המובא כאן ובכך מאפשר הערכת הפוטנציאל הדלקתי האמיתי של תאי T מגורים לגרום לבעיות מחסום EC. כמו כן ראוי לציין כי השוואה ישירה של ערכי TEER שונים ממדווחים בספרות צריכה להיעשות בזהירות. ערכים כאלה הם תלויים במידה רבה על הגדרת הניסוי, הם מתקבלים עם סוגי תאים שונים, זריעת צפיפות תא, תקשורת, אזורי גידול תא, ומערכות מדידת TEER (למשל </ Em>, העיצוב והגודל של אלקטרודות).
על מנת לחקות את מצב vivo הדוק יותר, מורכב במודלי BBB במבחנה הוקם, שבו ECS הוא שיתוף תרבותי עם pericytes על הצד היריב של הקרום להוסיף, או איפה pericytes האסטרוציטים גדלים על החלק התחתון של הבארות 12,25,50 - 52. במערכות שיתוף התרבות כגון, צולב לדבר בין תאים מסוגים שונים מאפשר הידוק חזק של המכשול, עם שיתוף תרבויות משולשות להיות הטובות ביותר שמזכיר את המצב vivo ובכך לספק את ערכי TEER הגבוהים ביותר. המורכבות של מערכות אלה, מצד שני, מציב מגבלה לשימוש שלהם רחב יותר כמודלים במבחנה BBB.
מגבלה נוספת של מודל זה היא חוסר מאמץ גזירה, אשר הוכח כדי לשפר את מחסום שלמות 53,54. כדי להתגבר על בעיה זו, מודלי BBB דינמיקה חדשים לאחרונה הוכנסו: ECs מתורבת סיבים חלולים נתון בתנאי זרימת pulsatile, מחק יותר מקרוב microvasculature in vivo 55,56.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של BBB מבוסס על ספקטרוסקופיה עכבה. התמקדות על האינטראקציה של תאי אנדותל מוח עכבר עיקרי עם תאי T מופעלים, השיטה מאפשרת לימוד נכסי המכשול במהלך מגע ישיר כזה. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת להבנת צעדים מכריעים בהתפתחות של מחלות מערכת העצבים המרכזית דלקתיות כגון טרשת נפוצה במודל חיה שלה EAE, שבה BBB נפגעת במהלך האינטראקציה של ECS עם תאי T encephalitogenic. Assay המתואר מאפשר חקירת ההשלכות של אפנון ממוקד של אינטראקציה זו באמצעות מגוון רחב של חומרים כגון חסימת נוגדנים, ציטוקינים ומעכבים של הפעלת תא T. השיטה היא רגישה, אמינה לא פולשניתמדידות nd של TEER ו Ccl מבוצעות באופן אוטומטי. כל זה הופך אותו לכלי שימושי תכליתי המוסיפה שכבה חדשה לגוף העשיר של דגמי BBB. זה אולי דווקא להרחיב את הידע שלנו על נכסי BBB בתנאי pathophysiological שנצפו מחלות אוטואימוניות כגון טרשת נפוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים אניקה Engbers ופרנק Kurth לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם ד"ר מרקוס שפר (nanoAnalytics GmbH) לדיונים מועילים לגבי מדידות TEER. עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), A03 פרויקט SFB1009 כדי HW ו LK, CRC TR128, פרויקטי A08; Z1 ו- B01 כדי LK ו HW, ואת המרכז הבינתחומי לחקר קליני (פקולטה לרפואה של מינסטר) מספר מענק Kl2 / 2015/14 עד LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
References
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A.
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S.
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
