Introduction
Blod-hjerne-barrieren adskiller det systemiske kredsløb fra centralnervesystemet (CNS) 1 - 3 ud. Det giver en fysisk barriere, der hæmmer den frie bevægelighed for celler og udbredelsen af vandopløselige molekyler og beskytter hjernen mod patogener og potentielt skadelige stoffer. Ud over sin barrierefunktion, BBB muliggør levering af ilt og næringsstoffer til hjernen parenkym, der sikrer et velfungerende neuronalt væv. Funktionelle egenskaber af BBB er stærkt reguleret af dens cellulære og acellulære komponenter, med højt specialiseret EC'er er dens vigtigste strukturelement. EC'er af BBB er karakteriseret ved tilstedeværelsen af tight junctions (TJ) komplekser, manglen på fenestrationer, ekstremt lav pinocytic aktivitet, og permanent aktive transportmekanismer. Andre dele af BBB EF basalmembran, pericytter indlejring endotelet, astrocytiske ende fødder og = associeret parienchymal basalmembran også bidrage til udvikling, vedligeholdelse og funktion af BBB 2,4 - 6 og sammen med neuroner og mikroglia, danner neurovaskulære enhed (NVU), som gør det muligt velfungerende CNS 7-9.
I en række neurologiske sygdomme, såsom neurodegenerative, inflammatoriske eller infektiøse sygdomme, er funktionen af BBB kompromitteret 2,5,10. Dysregulering af TJ komplekser og molekylære mekanismer transport fører til øget BBB-permeabilitet, leukocyt-ekstravasation, inflammation og neuronbeskadigelse. For at studere BBB egenskaber under sådanne patofysiologiske tilstande, har forskellige in vitro BBB-modeller fastslået 9,11,12. Sammen har de givet værdifuld indsigt i ændringerne i barriere integritet, permeabilitet samt transportmekanismer. Disse modeller anvender endotelceller fra mennesker, mus, rotte, svin eller b forfår oprindelse 13-18; primære endotelceller eller cellelinier dyrkes enten som en monokultur eller sammen med pericyter og / eller astrocytter for at efterligne nærmere BBB in vivo 19 - 25 år. I de senere år har måling af transendotelmigrering elektrisk modstand (TEER) blevet en bredt accepteret redskab til at vurdere endotel barriereegenskaber 26,27.
TEER afspejler impedans til ion flux hen cellemonolaget, og dens fald tilvejebringer et følsomt mål for kompromitteret endothelial barriere integritet og dermed øget permeabilitet. Forskellige TEER målesystemer er blevet udviklet, herunder Epithelial Voltohmmeter (EVOM), Elektrisk Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS), og real-time-celle analyse 15,28 - 30. TEER afspejler modstanden mod ionstrøm mellem hosliggende EC'er (paracellulær vej) og er direkte proportional medbarriereintegritet. I impedans spektroskopi 27,31, er kompleks samlede impedans (Z) målt, som giver yderligere oplysninger om barriere integritet ved at måle Ccl. CCL angår den kapacitive strøm gennem cellemembranen (transcellulær vej): cellelaget fungerer som en kondensator i den ækvivalente elektriske kredsløb, adskillelse af afgifter på begge sider af membranen og er omvendt proportional med barriere integritet. Når dyrket på permeable indsatser, EC'er klæbe, formere sig og spredes over mikroporøs membran. Dette modstår baggrunden kapacitive strøm af indsatsen (som i sig selv virker som en kondensator), og fører til et fald i kapacitansen, indtil den når sin minimale niveau. Dette efterfølges af etableringen af TJ komplekser, segl fra rummet mellem tilstødende EC'er. Dette begrænser ionstrøm gennem den paracellulære rute, og TEER øges indtil den når sin plateau. Under inflammatoriske tilstande imidlertid endothelial barriere er kompromitteret: TEER falder som TJ komplekser bliver forstyrret og Ccl stiger som den kapacitive komponent af indsatsen stiger igen.
Vores TEER måling bruger den automatiske overvågning celle 32-system: Det følger af princippet om impedans spektroskopi og udvider sine tidligere ansøgninger. Her beskriver vi en in vitro BBB model, der muliggør studiet af barriereegenskaberne, herunder interaktionen af hjernen endotel med immunceller; især aktiverede T-celler. Observeres sådanne patofysiologiske tilstande i autoimmune sygdomme i CNS, såsom multipel sklerose og dens dyremodel eksperimentel autoimmun encephalomyelitis 33 -. 37 Her et afgørende skridt er sjælevandring af encephalitogene, myelin-specifikke T-celler på tværs af BBB. Dette er efterfulgt af deres reaktivering i perivaskulære rum og indtræden i hjerneparenkym, hvor de rekrutterer andre immunceller og migdiat inflammation og efterfølgende demyelinering 1,35,38. Imidlertid molekylære mekanismer for interaktionen mellem sådanne T-celler og endotelceller, de vigtigste bestanddele af BBB, er ikke godt forstået. Vores protokol har til formål at udfylde dette hul og give nye indsigter i konsekvenserne på endotelceller (dvs. barriere integritet og permeabilitet) efter deres direkte kontakt og komplekse samspil med aktiverede T-celler.
Protokollen beskrevet her gør brug af primære musehjerne mikrovaskulære endotelceller dyrket som et monolag på permeable skær med mikroporøse membraner. Endotelceller samdyrkes med CD4 + -T-celler, som kan være præ-aktiverede enten polyklonalt eller et antigen-specifik måde. Co-kultur af MBMECs med præ-aktiverede, men ikke naive T-celler inducerer et fald i TEER og en stigning i Ccl, som tilvejebringer et kvantitativt mål for MBMEC dysfunktion og barrierenedbrydning. teknikkener ikke-invasiv: det bruger indbygget i stedet for spisepind elektroder, som forhindrer større forstyrrelse af EF-monolag; det kan bruges til at overvåge barrierefunktion uden brug af cellemarkører. Det gør kontinuerlige målinger i en automatiseret måde og muliggør en uafhængig vurdering af de to barriere parametre (TEER og CCL) samtidigt over tid. Metoden er også følsom nok til at skelne mellem forskellige niveauer af T-celle aktivering og effekter af sådanne T-celler på EC'er.
Det kan bruges i en lang række funktionelle assays: kan tilsættes forskellige cytokiner og / eller chemokiner impliceret i inflammatoriske processer til co-kultur af MBMECs og T-celler; kan anvendes blokerende antistoffer mod celleadhæsionsmolekyler på enten EF eller T-celle side; og inhibitorer af T-celleaktivering markører eller deres cytolytiske egenskaber kan tilsættes under T-celle-priming eller deres co-kultur med EC'er. Assayet er ligeledes nyttig til T-celle-transmigrationassays, da det kan tjene som en kvalitetskontrol af MBMEC monolag integritet inden tilsætningen af T celler. Alt dette gør denne metode et alsidigt og pålideligt værktøj til at studere BBB in vitro, med fokus på effekten af aktiverede T-celler på EF monolag integritet. Dette er af særlig betydning for at forstå mekanismerne i BBB forstyrrelser i patogenesen af autoimmune sygdomme, såsom MS og dens dyremodel EAE, hvor selvnedbrydende, encephalitogene T-celler krydser BBB og forårsage betændelse og neuronal beskadigelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For alle eksperimenter blev mus avlet og holdt under specifikke patogenfrie forhold i den centrale dyr facilitet ved universitetet i Münster, efter tyske retningslinjer for dyr pleje. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i dyreeksperimentelle etiske udvalg og godkendt af de lokale myndigheder i Nordrhein-Westfalen, Tyskland (LANUV AZ 84-02.05.20.12.217).
1. MBMEC Isolering og Kultur
BEMÆRK: Isoler MBMECs som tidligere beskrevet i detaljer 14 med følgende ændringer:
- Sacrifice 20 voksne C57BL / 6 mus (6-8 uger gamle) af CO 2 indånding og bekræfte deres død ved konstatere hjerte- og respirationsstop.
- Skyl mus med 70% ethanol og halshugge den med saks; fjerne hovedbunden ved hjælp af pincet og saks. Lav indsnit i venstre og højre side af kraniet, startende fra foramen magnum. Løft kraniet fra dens caudale side og take ud hjernen med pincet.
- Under en laminær strømning, brug steril pincet til at placere hjernen i en petriskål og fjern hjernestammen, cerebellum og thalamus, holder kun cortex.
Bemærk: Brug af et mikroskop er ikke nødvendig for nogen af disse trin. - Placer cortex på et stykke sterilt Western blotting papir og rul det forsigtigt med en pincet, indtil meninges ikke længere er synlige.
- Efter mekanisk og enzymatisk fordøjelse (ifølge protokollen 14), indsamle endotelceller fra densitetsgradient ved anvendelse af en lang, steril nål og en 5 ml stemplet. Endotelceller vises som en mørk lag over den røde ring med erythrocytter. Overførsel 20-25 ml af dette lag til en ny 50 ml centrifugerør; top op i røret med DMEM.
- Efter to runder af vask 14, resuspender cellerne i 6 ml MBMEC medium indeholdende puromycin (4 ug / ml) og frø dem på seks overtrukne brønde i en plade med 24 brønde; efterlade dem i et vævkultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 (benævnt "incubator" herfra) i tre dage.
BEMÆRK: Yderligere oplysninger om MBMEC belægning løsning, se Materialer tabel. - Skift mediet ved tilsætning af 1 ml til hver brønd af frisk MBMEC medium uden puromycin; sætte pladen tilbage ved 37 ° C og 5% CO2 i yderligere to dage.
2. Høst MBMECs
- På dag fem efter MBMEC isolation, pre-coat permeable skær med MBMEC belægningsopløsning: tilføje 80 pi opløsning pr insert og efterlade dem ved 37 ° C og 5% CO2 i 3 timer.
- pipette forsigtigt belægningsopløsningen og lad indsatsene lufttørre i 30 minutter. Tilsættes 2 ml stuetemperatur (RT) PBS til hver brønd af pladen, ved hjælp MBMECs at vaske mediet; gentage dette trin. Tilføj 0,05% trypsin-EDTA (300 pi per brønd) og lad pladen i inkubatoren i 5-10 min.
- Tilsæt 2 ml MBMEC medium til hver brønd for at standsetrypsinisering. Overfør de indsamlede celler til et 15 ml centrifugerør og centrifugeres dem ved 700 xg i 8 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml MBMEC medium uden Puromycin.
- Tæl cellerne; blande 10 pi af cellesuspensionen med 90 pi 0,04% trypanblåt (10x fortynding af celler). Afpipetteres 10 pi af denne blanding mellem glasset dækslet og celletælling kammer (hæmocytometer). Count trypanblåt-frie celler i alle fire kvadranter af kammeret (N) og bestemme det gennemsnitlige antal optalte celler (N ') som følger: N' = N / 4.
- Beregne koncentrationen celle (i 10 6 celler / ml) under anvendelse af følgende formel: C = N 'x 10 4 x 10, hvor 10 4 er givet ved dimensionerne af hæmocytometer og 10 er fortyndingsfaktoren fra trin 2.4.
- Seed 2 x 10 4 celler i et volumen på 260 pi pr insert. Tilføj 810 pi MBMEC medium til det nedre rum af hver brønd. Pladen anbringes med skær i inkubatoren indtil den er klar til at gå videre med punkt 4.
BEMÆRK: bind for den øvre og nedre rum er insert-specifikke og ikke arbejde for alle 24 brønde formater.
3. CD4 + T-celle Isolering og stimulering
- CD4 + T-celle Isolation
- Sacrifice en voksen mus (6-8 uger gamle) af CO 2 indånding og bekræfte sin død ved konstatere hjerte- og respirationsstop.
- Placer musen på ryggen på en ren dissektion bord og skyl den med 70% ethanol; bruge steril saks og pincet til at åbne bughinden og fjern milt og lymfeknuder (lyskebrok, aksil, brachialis og livmoderhalskræft); Endelig overføre vævet i et 15 ml centrifugerør indeholdende 5 ml PBS på is.
- Under laminar flow hætte, overføre vævet ved dekantering PBS med vævet i et 50 ml centrifugerør med en 70 um cellefilter oven; homogeniserevævet ved at trykke på den med en 1 ml stempel gennem sien.
- 30 ml af FACS buffer og centrifugeres den ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten kasseres og cellerne resuspenderes i 10 ml FACS buffer. Filtreres suspensionen gennem et 40 um cellefilter, tilsættes yderligere 20 ml FACS buffer til røret.
- Centrifugeres det ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 500 pi FACS buffer.
- Tilsæt 20 pi muse CD4 magnetiske mikroperler, bland godt og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C. Tilsættes 25 ml FACS buffer og centrifugeres den ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C.
- I mellemtiden, placere en LS adskillelse kolonne i magneten og skyl det med 3 ml FACS-buffer. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 3 ml FACS buffer.
- Tilføj celler til søjlen. Kolonnen udvaskes med 3 ml FACS buffer tre gange. Fjern kolonnen fra magneten og placere den på en ny 15 ml centrifugation rør. Der tilsættes 5 ml FACS buffer, skylle de mærkede celler med kolonnen stemplet og centrifugeres den ved 500 xg i 5 min 4 ° C.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 3 ml T-celle-medium. Tæl celler som beskrevet i 2.4 og frø 1 x 10 5 celler i 100 pi medium per brønd.
- CD4 + T-cellestimulering
- Polyklonale CD4 + T-celle-stimulering
- Precoaten en rundbundet 96-brønds plade med oprenset anti-muse CD3-antistof (klon 145-2C11) i PBS, ved en ønsket slutkoncentration. For eksempel, at pre-coat fuld plade med α-CD3 ved 1 ug / ml, bland 10 gl af antistoffet (stamkoncentration = 0,5 mg / ml) med 5 ml PBS, vortex og tilsættes 50 ul af blandingen til hver brønd med en multikanalpipette.
- Efterlad pladen i inkubatoren i 3 timer. Efter isolering af T-celler, vask præ-overtrukne plade to gange med PBS. Tilføj oprenset anti-CD28 antistof (klon37.51) til isolerede T-celler i en ønsket slutkoncentration (f.eks ved 1 ug / ml); bland godt. Seed T-cellerne og efterlade dem i inkubatoren i to til tre dage.
- Antigen-specifikke CD4 + T-celle-stimulering med dendritiske celler (DC'er)
BEMÆRK: Hvis der anvendes udviklingslandene som antigen-præsenterende celler (APC'er), skal du følge protokollen for T-celle isolation med disse undtagelser:- Før homogenisering milten, injicere det med 1 ml collagenase type IA i PBS ved 0,5 mg / ml og overføre det til en 15 ml centrifugerør.
- Der inkuberes i vandbad ved 37 ° C i 15 minutter. Efter vask med PBS, pellet resuspenderes i FACS buffer og tilsættes 20 pi muse CD11c magnetiske mikroperler, i stedet for CD4 mikroperler.
- Brug en MS separationskolonnen og passende mængder: Skyl kolonnen med 1 ml FACS buffer; resuspender cellerne i 1 ml FACS buffer og vask af søjlen med 1 ml FACS buffer tre gange.
- Add antigen ønsker, til DC'er (f.eks myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG) aa 35-55 ved 20 ug / ml), bland godt og frø 5 x 10 4 celler i 100 pi T-celle dyrkningsmedium pr 96-round-bottom godt.
- Tilsæt 1 x 10 5 T-celler i 100 pi T-celle dyrkningsmedium pr 96-rundbundet brønd i slutningen, som beskrevet i protokollen for T-celle-isolation.
- Antigen-specifikke CD4 + T-celle-stimulering med B-celler
BEMÆRK: Hvis der anvendes B-celler som APC, følg protokollen for T-celle isolation med disse undtagelser:- Brug milte fra transgene mus, hvis B-celler er antigen-specifik (fx IgH MOG (Th) mus, hvis B-celler specifikt at genkende MOG 35-55).
- Brug antigenspecifikke T-celler (f.eks fra TCR MOG (2D2) mus). Tilsæt 20 pi muse CD19 magnetiske mikroperler stedet for CD4 mikroperler.
- Tilsæt valgte antigen til B cells (f.eks MOG 35-55 ved 20 ug / ml), bland godt og frø 5 x 10 4 celler i 100 pi B-celle dyrkningsmedium pr 96-rundbundet brønd.
- Tilsæt 1 x 10 5 T-celler i 100 pi T-celle dyrkningsmedium pr 96-rundbundet brønde, som beskrevet i protokollen for T-celle isolation.
- Polyklonale CD4 + T-celle-stimulering
4. Opsætning og Performing TEER Måling
- Placer 24 brønde modul af TEER instrument under laminar flow hætte. Fjern låg og sted indsatser med MBMECs i instrumentet ved hjælp af pincet.
- Pipette 810 pi frisk medium til det nedre rum af modulet brønde: tilføje den omhyggeligt mellem indsatsen og væggen af modulet godt.
- Luk lågene og placere instrumentet i inkubatoren. Tilslut instrumentet til sin computer; tænde instrumentet controller og åbne softwaren.
- Vælg 'ny måling "i pop-up vindue. Check «show TEER" og "show CCL 'kasser; derefter trykke på 'start'. Efter at have afsluttet den første måling, skal du vælge 'check alle brønde' i fanen resultater 'for at se alle TEER og CCL værdier.
- Gem filen: Filer> Gem som> 'navnet på din fil'.
BEMÆRK: Som TEER og Ccl løbende måles i en automatiseret måde, overvåge deres værdier over en periode på tre til fem dage. Ændring af medium er ikke nødvendig, medmindre cellelevedygtigheden er suboptimal, som visualiseret ved manglende stigning i TEER. - Vælg det tidspunkt til at co-kultur MBMECs med T-celler, når Ccl er stabil og lavere end en uF / cm2 og TEER har nået sit maksimale niveau.
- Kontrollér omhyggeligt absolutte TEER og CCL værdier, og udelukke brøndene, hvor MBMECs ikke har udviklet sammenflydende nok monolag ved at fjerne markeringen sådanne brønde.
- Gruppe resten af brøndene: højreklik på en brønd, og vælg 'tilføje godt til nye gennemsnit godt «. Name det i pop-up-vinduet; gøre det samme for alle individuelle brønde, der skal grupperes.
- Kontrollér alle gennemsnitlige brønde for at bekræfte, at alle af dem har de samme oprindelige betingelser før co-kultur. Hvis nogle har markant forskellige absolutte TEER-værdier eller TEER skråninger, eller de standardafvigelser er for store, redo grupperingen.
BEMÆRK: Den optimale gruppering af brønde giver minimal variation i TEER værdier, både inden for og mellem forsøgsgrupper. - I fanebladet 'eksperiment' Tryk på 'pause', afbryde instrumentet og tage den ud af kuvøsen. Fjern lågene under laminar flow hætte.
- Forbered præaktiveret og / eller naive T-celler, med eller uden specifikke cytokiner, antistoffer eller andre stoffer, som ønsket: For eksempel: mix oprenset NA / LE rotte antimus IFN-γ antistof (klon XGM1.2) med parat t celler, ved 20 ug / ml pr brønd af TEER instrumentet.
BEMÆRK: Hvis der anvendes stoffer som granzym B-hæmmer, de er endded til T-celle-kultur i begyndelsen af T-celle stimulation: for eksempel, er Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) blandet med isolerede T-celler i en slutkoncentration på 10 uM i DMSO. Se materialer og udstyr til flere detaljer. - Fjerne noget af mediet fra indsatsen (den øvre brønd rum): for eksempel, omhyggeligt pipette ud 150 pi (fjerne alle mediet bør undgås, da det kunne forstyrre MBMEC monolag).
- Tilføj T-celler til MBMECs ved omhyggeligt at pipettere 150 pi medium indeholdende 2 x 10 5 celler / insert.
BEMÆRK: Når man høster præ-aktiverede T-celler, tæller kun sprængning, Trypan Blue-frie celler. - Luk lågene og placere instrumentet tilbage til kuvøsen. Tilslut instrumentet og tryk på 'CV måling ". Efter 24 timer, skal du trykke på "stop" i fanen 'eksperiment' og gem filen (Filer> Gem).
5. Data Export og statistisk analyse
- Eksportere resultaterne ved at vælge Filer> Eksporter.
- I "Indstillinger" fanen i pop-up vindue, skal du vælge ".dot" i "decimaladskiller", og "tabulator" i "feltet afgrænser" valgmulighed.
- I fanen "eksport resultater", navngive filen, find ud af alle brønde, der skal eksporteres, og tjek "TEER" og "CCL" kasser i "vælg data" valgmulighed.
- Tryk på "eksportere data," åbne den eksporterede fil, og kopiere data til et regneark.
- Normalisere eksporterede data (ordnet efter hver gentagelse, med TEER og CCL værdier for hver kørsel (måling)): Set TEER og CCL værdier sidste tidspunkt før co-kultur til 100% og ændres tilsvarende værdier for alle andre kørsler, i forhold til den "100%" run.
- Kopier normaliserede data til en software valg at generere et diagram med individuelle brønde og vise standardfejlen på middelværdien for hver behandlingsgruppe.
- Perform Tovejs ANOVA statistisk test med en Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger, ved hjælp af statistisk software af valg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 giver et generelt overblik af in vitro BBB model anvendt til at undersøge interaktionen mellem T-celler og endotelceller. Eksperimentet består af tre store skridt. Det første skridt er isolering af primære MBMECs fra hjernen cortex, og deres kultur i fem dage. Når de når konfluens i celledyrkningspladen, er MBMECs trypsiniseret og podet på permeable skær, som dernæst anbringes i TEER instrumentet. Den TEER og Ccl af MBMECs løbende måles og overvåges over en periode på tre til fem dage. I mellemtiden, T-celler isoleres, stimuleret (trin 2), og dyrket i to til fem dage, type og styrken af stimulus. I trin 3, er T-celler tilsættes til og co-dyrkes med MBMECs når Ccl er på et stabilt lavt niveau, og TEER er på sit maksimale niveau. At vælge dette tidspunkt for co-kultur, når TEER er stadig på sit plateau er afgørende for succesaf hele målingen. Således er det yderst vigtigt, at tidspunktet for T celleisolering og stimulation er omhyggeligt valgt, således at T-celler nå det ønskede niveau af aktivering ved tidspunktet for deres tilsætning til ECS. Efter tilsætning T-celler, er målingen genoptages for en dag mere og resultaterne analyseres.
Efter den første fem-dages kultur, MBMECs viser let karakteristiske spindel-formet morfologi (figur 2A, venstre felt) og hurtig endotelcellespecifikke markører, såsom PECAM-1 og Claudin-5 (figur 2A, midterste og højre paneler). Men dette alene giver ikke tilstrækkelig dokumentation for deres fuldstændige sammenløb og korrekt barriere integritet. Impedans spektroskopi, på den anden side, giver et godt estimat af monolaget integritet og tjener som en kvalitetskontrol af hver brønd før udførelsen af et funktionelt assay. I figur 2B, de fleste afbrønde indeholdt MBMECs hvis CCL værdier var stabil og lav, og deres TEER værdier nået et plateau. Disse brønde blev anvendt til efterfølgende samdyrkning eksperimenter. De blev grupperet på en sådan måde, at variansen i og mellem grupperne var minimal før tilsætning T-celler (Figur 2C). Brøndene hvis TEER værdier afveg markant fra resten (såsom blå kurve angivet i figur 2B) blev ikke brugt, da de ville føre til tvetydige resultater eller fejlfortolkning af data.
Forudsat at de første krav til MBMEC kultur og T-celle stimulation er opfyldt, kan impedans spektroskopi giver et værdifuldt indblik i T-celle-EF-interaktion. TEER måling kan tjene som den primære udlæsning for en sådan interaktion og en måling af T-cellemedieret EF dysfunktion, som vist i figur 3A og 3B. I dette tilfælde er MBMECs dyrkes på indsatser med mikroporer 0,4um i diameter, som ikke tillader T-celler at passere gennem indsatsen membranen. Figur 3A viser, at kun stimuleres, men ikke naive T-celler er i stand til at inducere EF dysfunktion, som bestemt ved et fald i TEER og forøgelse Ccl. Naive T-celler kan således tjene som en negativ kontrol, eftersom TEER og Ccl under co-dyrkning med naive T-celler sig ved deres oprindelige niveau. Undtagelsen er toppen ved begyndelsen af co-kultur, der skyldes håndtering af instrumentet (løfte lågene, tilføje nye medie med celler, der kan have lidt forskellige temperaturer og pH-værdier, og lukke lågene). Denne artefakt vises med alle former for TEER målinger og ignoreres under analysen. Tilsætningen af de pro-inflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-a (ved 100-500 U / ml), som vides at være i stand til at inducere EF inflammation, kan anvendes som positiv kontrol. I figur 3A, MOG 35-55-specifikke CD4
For at undersøge mekanismerne i den beskrevne MBMEC monolag forstyrrelser kan forskellige tilgange anvendes. Resultater i figur 3C viser, at de stimulerede T-celler, men ikke deres supernatanter forårsagede en betydelig skade på MBMECs, hvilket indikerer, at direkte kontakt mellem T-celler og MBMECs er kritisk for barriere forstyrrelser. Endvidere tilsætning af et neutraliserende α-IFN-γ antistof under TEER målingen kun let forbedret MBMEC barriereegenskaber, hvilket antyder, at IFN-γ ikke kan være den primære årsag til denne forstyrrelse. På den anden side, tilføjer granzym B Inhibitor II til T-celle kultur (figur 3D) restaurerede MBMEC integritet i højere grad, der peger på denne cytolytisk molekyle som en vigtig aktør i at forårsage MBMEC skader og efterfølgende fald i TEER.
Udover dets anvendelse som en primær udlæsning for virkningen af T-celler på EF monolag integritet, kan TEER måling også anvendes som en kvalitetskontrol af barriereintegritet før andre assays, såsom T-celle transmigration assay. I dette tilfælde indsætter med anvendes mikroporer med 3 um i diameter. I figur 3E blev TEER måling udføres for at sikre, at MBMEC monolag var af samme grad af integritet i alle brønde før tilsætningen af T-celler til efterfølgende transmigration assay. Dette blev efterfulgt af høst af T-celler fra det nedre kammer af instrumentets brønde, farvning T-celler med α-CD4-antistof og flow-cytometri under anvendelse af celletælling perler til bestemmelse absolutte antal af transmigrated T-celler; vist i figur 3E, midterste og højre). Bemærk, at stimulerede T-celler, der anvendes til sjælevandring forårsagede ikke et betydeligt fald i TEER, selv om de var pre-aktiveret som i figur 3A. Dette kunne afspejle transcellulære rute immunceller kan bruge under sjælevandring, som er blevet observeret tidligere 39. I figur 3F blev halvdelen af brøndene med MBMECs betændt med IFN-γ og TNF-α (uninflamed vs. Betændte), og senere blev naive T-celler tilsat til vurdering af transmigratory aktivitet. I dette tilfælde TEER måling forudsat et fingerpeg om, hvor stærk inflammation med cytokiner var, og da T-celler skal tilføjes til transmigration.
Figur 4 viser nogle af de mest almindelige situationer, der kan føre til fejlfortolkning af TEER resultater. I figur 4A, for eksempel, ikke alle MBMECs udviklet en fuldt konfluent monolag på samme tid. En af de grupper ( 'naive T-celler - udelukket') indeholdt MBMECs hvis TJ komplekser modning med en anden hastighed i forhold til de andre grupper lige før tilsætning af T-celler. Denne gruppe derfor udviklede TEER værdier over 100% i løbet af eksperimentet og blev udelukket fra yderligere analyse. Således hældningen på TEER kurven (sats på TJ modning) før forsøget er lige så vigtig som absolutte TEER værdier for korrekt data fortolkning. Figur 4B viser, at der begynder at co-kultur ikke kun for tidligt, men også for sent kan føre til falske resultater. Her, i både gruppen med stimulerede T-celler og den negative kontrolgruppe (medium Change) har TEER værdier allerede bestået deres plateau og begyndte at falde uafhængigt af den eksperimentelle tilstand, dermed indikerer suboptimale dyrkningsbetingelser før og under forsøget. Sådanne grupper bør ikke indgå i analysen. Endelig, selv om TEER og Ccl normalt ændre deres værdier på en sådan måde, at en større fald i TEER er ledsaget af en større stigning i Ccl, kan dette ikke altid være tilfældet. I figur 4C, stimulerede T-celler B forårsagede et større fald i TEER, men en mindre stigning i Ccl end stimulerede T-celler A gjorde.
Figur 1: Generel oversigt over teknikken. Efter den indledende kultur, er MBMECs reseeded på permeable skær og anbringes i den automatiserede celle monitor; TEER og Ccl måles hver time i 4-5 dage. I mellemtiden er T-celler aktiveres in vitro 40. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: MBMECs udvikle et konfluent monolag er egnet til en in vitro BBB model. (A) Spindel-form morfologi (venstre) og immunfluorescensfarvning af PECAM-1 (midten) og Claudin-5 (højre) fem dage efter MBMEC isolation. (B og C) TEER og CCL-værdier før (B) og efter (C) grupper af individuelle brønde, forudgående to tilsætning af T celler. Den blå kurve i (B) ikke blevet anvendt til forsøget, da MBMECs i dette godt ikke har udviklet TEER så høj som i de andre brønde. Data i (c) viser middel ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative resultater. (AD) Ændringer i TEER som primær mål for MBMEC dysfunktion ved interaktion med T-celler. (A) MOG-specifikke T-celler blev aktiveret ved MOG-specifikke B-celler i nærvær af MOG 35-55 peptid i fem dage. Naive T-celler og pro-inflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-a (begge ved 100 U / ml) tjente som en negativ og positiv kontrol hhv. (B) T-celler blev stimuleret med α-CD3 og α-CD28-antistoffer (1 pg / ml hver) i to eller tre dage, som er angivet, før du tilføjer dem til MBMECs. (C) T-celler (præ-aktiverede som i (a)) eller deres supernatanter i nærvær af α-IFN-γ antistof eller det tilsvarende isotype kontrol. (D) T-celler (præ-aktiverede som i (B)) i to dage, i nærværelse af granzym B hæmmer II eller dets fortyndingsmiddel DMSO. (E og F) TEER måling kun brugt som en kvalitetskontrol for barriere integritet før T-celle transmigration. MBMECs blev dyrket på inserter med porer på 3 um i diameter. (E) T-celler, stimuleret som beskrevet i (A), lodes der vandrer i 18 timer (til venstre). Derefter blev de høstet, farvet for α-CD4-antistof (klon RM4-4) og analyseret ved flowcytometri under anvendelse af celletælling perler (midten og højre). (F)Overvågning af MBMEC monolag integritet ved stimulering med IFN-γ og TNF-α, og vælge den passende tidspunkt for efterfølgende tilsætning af T-celler til transmigration assay. (AF) Resultater viser tekniske tredobbelte og er repræsentative for tre uafhængige forsøg hver. Data viser gennemsnit ± SEM. (E, højre)-parret, to-halet Students t-test. **, P <0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Praktiske overvejelser og data fortolkning. (A) MBMECs fra en forsøgsgruppe (rød kurve) blev udelukket fra analysen, da satsen for modningen af deres forbindelsesepitoper komplekser var anderledes i forhold til andre groups. (B) Et eksempel på at tilføje T-celler for sent, som forhindrede korrekt vurdering af MBMEC dysfunktion. (C) Ved afbrydelse af stimulerede T-celler »A« (sort kurve), CCL værdier af MBMECs viste en mere dramatisk stigning end det kunne forventes fra ledsagende fald i TEER forårsaget af den samme T-celler. (AC) T-celler blev stimuleret med α-CD3 og α-CD28-antistoffer (1 ug / ml hver) i to dage. Resultater viser tekniske tredobbelte og er repræsentative for tre uafhængige forsøg hver. Data viser gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere trin af den beskrevne protokol er afgørende for en vellykket eksperiment. Under den indledende MBMEC isolering og dyrkning, er det afgørende, at arbejdet udføres under sterile betingelser så meget som muligt, for at hindre kontaminering af cellekulturen med svampesporer eller bakterier. For at opnå en ren kultur af EC'er, anbefales det at anvende et medium indeholdende puromycin for de første tre dage, hvilket muliggør overlevelse af EC'er, men ikke andre typer celler (især pericytter) 41,42. Et andet kritisk trin, som fortjener særlig opmærksomhed, er identifikationen af den korrekte tidspunkt for tilsætning pre-aktiverede T-celler. Under den første 48 timers af TEER måling MBMECs formere på permeable indsatser og lukke hullerne mellem hinanden. Derfor Ccl falder indtil den når et stabilt og lavt niveau (ca. 0,6 uF / cm2). Dette er det første tegn på et konfluent monolag EF, men er endnu ikke et tegn på en stram barriere. Først efterCCL har nået et stabilt niveau gør TEER begynde at stige. Når TJ komplekser fuldt dannet og EF-barrieren er fuldstændig afspærret, TEER når sit maksimale niveau. Dette plateau nås almindeligvis tre til fem dage efter reseeding ECS og opretholdes i yderligere 24 til 36 timer. Det bedste tidspunkt for tilsætning af T-celler er i begyndelsen af plateauet, som sikrer, at EC'er stadig levedygtige nok til at være co-dyrkes med T-cellerne. Som T-aktivering cellen skal indledes før det optimale tidspunkt for co-dyrkning kan sikkert forudsiges, kan det være fordelagtigt at stimulere to batches af T-celler på to forskellige dage for at øge fleksibiliteten af denne timing. Endelig skal gøres på en sådan måde, at variabilitet inden for og mellem grupperne er minimal gruppering af de enkelte replikater brønde, før du tilføjer T-celler til MBMECs. Dette sikrer, at oprindelige betingelser er ens blandt alle grupper i løbet af co-kultur af T-celler og MBMECs. Vores protokol beskriver TEER måling under co-dyrkning af primært musehjerne EC'er med præ-aktiverede CD4 + -T-celler. Dens simple form giver mulighed for flere modifikationer, i henhold til de videnskabelige behov. For eksempel kan varieres typen, styrke og varighed af stimulus. Antigenspecifikke CD4 + -T-celler kan aktiveres ved deres beslægtede antigen, i nærvær af egnede antigenpræsenterende celler (APC'er); Alternativt kan T-celler polyklonalt aktiveret af α-CD3 og α-CD28-antistoffer. T-celleaktivering status kan moduleres ved forskellige cytokiner, blokerende antistoffer, inhibitorer. Udskiftning primære hjerne EC'er med endotel cellelinjer kan ikke anbefales, men som det er kendt, at sidstnævnte Vis mindre restriktiv TJ komplekser og højere permeabilitet i forhold til de primære celler 43. Ud over at måle TEER som den primære udlæsning, denne protokol giver en god kvalitetskontrol af EF monolayER integritet forud for T-celle-transmigration assay (figur 3E, F). Notatet kan TEER værdier ikke nødvendigvis falde under sjælevandring af T-celler på tværs af MBMECs (Figur 3E): dette kunne afspejle transcellulære rute immunceller kan bruge under sjælevandring, som er blevet observeret tidligere 39,44.
Som aktiverede T-celler inducerer EF dysfunktion under co-kultur, TEER viser en stabil, forudsigelig nedgang, sammenlignelige på tværs eksperimenter med de samme betingelser. Et større fald i TEER er normalt ledsaget af en større samtidig stigning i Ccl. I sjældne tilfælde kan imidlertid en stigning i Ccl være mere udtalt, end det kunne forventes fra det tilsvarende fald i TEER (figur 4C). Denne uoverensstemmelse kan afspejle forskellige aspekter af EF-monolag forstyrrelser. Som EC'er forsøger at lukke de huller, der dannes under barrieren forstyrrelser, kan de gennemgå dynamiske ændringer imorfologi og motilitet, såsom at danne fremspring og øge deres samlede areal, som alle kan bidrage til en dramatisk og hurtig stigning i Ccl. Dette gør ændringer i Ccl mindre forudsigelig i forhold til ændringer i TEER. Således er niveauet for fald i TEER fortsat det mest pålidelige og repræsentative måling af kompromitteret barriere integritet.
Denne analyse kan suppleres med andre teknikker til at undersøge endotel barriereegenskaber. Det kan efterfølges af en permeabilitet assay som måler mængden af molekyler af forskellig størrelse, der diffunderer gennem det sprængte EF monolag 44. Til dette formål kan anvendes fluorescensmærkede dextrankonjugater, såsom fluorescein og Texas Red; andre molekylære sporstoffer er også tilgængelige (fx saccharose, mannitol, albumin, Evans blåt og peberrodsperoxidase) 26. Endvidere kan immunofluorescensmikroskopi anvendes til at undersøge ændringerne i proteinekspressionog den cellulære lokalisering af TJ og celleadhæsionsmolekyler. Selv om den præsenterede BBB model er meget enkel, kan de opnås med det resultat give værdifuld rettesnor for mere assays under mere fysiologiske betingelser. Sådanne assays indbefatter (men er ikke begrænset til) in vitro shear flow assay til at supplere TEER måling opnået under statiske betingelser og in vivo permeabilitet assay med Evans blåt injektion i levende mus for at tage højde for den fulde kompleksitet BBB.
Selv følsomme og pålidelige, den her beskrevne metode har visse begrænsninger, der fortjener særlig opmærksomhed. De maksimale TEER værdier, der måles i vores forsøgsopstilling når værdier på 35-40 Wcm 2. Disse TEER-værdier er meget lavere end in vivo, hvor forskellige celletyper og acellulære komponenter bidrager til integriteten af BBB, men de er heller ikke så høj som TEER værdier opnået på anden in vitro BBB modeller <sup> 26,45,46. Dette kunne forbedres ved tilsætning af hydrocortison til EF-medium, som er blevet vist at markant forbedre barriereegenskaber 27,47 - 49. Men brugen af sådanne stoffer - kendt for at have anti-inflammatoriske og immunosuppressive virkninger - er ikke egnet til alle funktionelle assays. Som det er i fokus for denne særlige protokol om konsekvenserne af EF-T-celle interaktioner på barriere integritet, ville fortolkning blive hæmmet ved tilsætning af hydrocortison. Under anvendelse af protokollen præsenteres her således muliggør en evaluering af den sande inflammatoriske potentiale af stimulerede T-celler til at forårsage EF-barriere-dysfunktion. Det er også værd at bemærke, at direkte sammenligning af forskellige TEER værdier rapporteret i litteraturen bør foretages med forsigtighed. Sådanne værdier er meget afhængige af den eksperimentelle opsætning, er de opnået med forskellige celletyper, såning celledensiteter, medier, celle vækstområder, og TEER målesystemer (f.eks </ Em>, design og størrelse af elektroderne).
For at efterligne in vivo-situationen nærmere, kompleks in vitro BBB modeller er blevet etableret, hvor EC'er dyrkes sammen med pericytter på den modstående side af indsatsen membran, eller hvor pericytter og astrocytter dyrkes på bunden af brøndene 12,25,50 - 52. I sådanne co-kultursystemer, krydstale mellem forskellige celletyper muliggør stærkere stramning af barrieren, med tredobbelt co-kulturer være de bedste på ligner in vivo-situationen og således tilvejebringer de højeste TEER-værdier. Kompleksiteten af disse systemer, på den anden side, udgør en begrænsning for deres bredere anvendelse som in vitro-BBB-modeller.
En anden begrænsning ved denne model er manglen på forskydningsspænding, som har vist sig at forbedre barriereintegritet 53,54. For at overvinde dette problem, er for nylig blevet indført nye dynamiske BBB modeller: ECs dyrkes i hule fibre og udsat for pulserende strømningsforhold, efterligner nærmere mikrovaskulaturen in vivo 55,56.
Sammenfattende denne protokol beskriver en in vitro model af BBB baseret på impedans spektroskopi. Fokuserede på samspillet af primær musehjerne-endotelceller med aktiverede T-celler, hvilken fremgangsmåde giver mulighed for at studere de barriereegenskaber under en sådan direkte kontakt. Dette er særlig vigtigt for at forstå de afgørende skridt i udviklingen af inflammatoriske CNS-sygdomme, såsom multipel sklerose og dens dyremodel EAE, hvor BBB kompromitteres under en interaktion mellem EC'er med encephalitogene T-celler. Den beskrevne assay muliggør undersøgelse af konsekvenserne af en målrettet modulering af en sådan interaktion ved anvendelse af en lang række stoffer såsom blokerende antistoffer, cytokiner og inhibitorer af T-celleaktivering. Metoden er følsom, pålidelig og ikke-invasiv and målinger af TEER og Ccl udføres i en automatiseret måde. Alt dette gør det til et nyttigt og alsidigt værktøj, der tilføjer et nyt lag til de rige krop BBB-modeller. Det kan specifikt udvide vores viden om BBB egenskaber under patofysiologiske tilstande observeret i autoimmune sygdomme, såsom MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Annika Engbers og Frank Kurth for deres fremragende teknisk support og Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) til nyttige diskussioner om TEER målinger. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projekt A03 til HW og LK, CRC TR128, projekter A08; Z1 og B01 til LK og HW, og Interdisciplinært Center for Klinisk Forskning (Medical Faculty of Münster) tilskud nummer KL2 / 2015/14 til LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
References
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
