Introduction
De bloed-hersenbarrière scheidt de systemische circulatie van het centrale zenuwstelsel (CNS) 1-3. Het voorziet in een fysieke barrière die het vrije verkeer van cellen en de verspreiding van in water oplosbare moleculen remt en beschermt de hersenen tegen pathogenen en potentieel schadelijke stoffen. Naast de barrièrefunctie de BBB maakt de overdracht van zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen parenchym waardoor de correcte werking van het neuronaal weefsel waarborgt. Functionele eigenschappen van de BBB wordt sterk gereguleerd door zijn cellulaire en acellulaire componenten, met zeer gespecialiseerde EC dat is haar belangrijkste structurele element. EC van de BBB wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van tight junction (TJ) complexen, het gebrek aan fenestrations, pinocytose extreem lage activiteit en permanent actieve transportmechanismen. Andere componenten van de BBB de EC basaal membraan, pericytes het inbedden van het endotheel, astrocytaire end voeten en = bijbehorende parenchymal basaalmembraan ook bijdragen aan de ontwikkeling, instandhouding en functie van de BBB 2,4 - 6 en samen met neuronen en microglia, vormen de neurovasculaire eenheid (NVU) waardoor de correcte werking van het CZS 7 maakt - 9.
In verschillende neurologische ziekten zoals neurodegeneratieve, ontstekings- of infectieziekten, is de functie van de BBB gecompromitteerde 2,5,10. Ontregeling van TJ complexen en moleculaire transportmechanismen leidt tot BBB permeabiliteit extravasatie van leukocyten, ontsteking en neuronale schade toe. Om BBB eigenschappen studeren onder dergelijke pathofysiologische omstandigheden, hebben verschillende in vitro BBB modellen vastgesteld 9,11,12. Samen hebben ze waardevolle inzichten in de veranderingen van de barrière integriteit, doorlaatbaarheid evenals transport mechanismen. Deze modellen maken gebruik endotheliale cellen van mens, muis, rat, varken of bschapen afkomst 13-18; primaire endotheliale cellen of cellijnen worden gekweekt hetzij als monocultuur of samen met pericyten en / of astrocyten om nauwer bootsen de BBB in vivo 19-25. De laatste jaren is het meten van transendotheliale elektrische weerstand (TEER) wordt een algemeen aanvaarde instrument om endotheliale barrière-eigenschappen 26,27 beoordelen.
TEER weerspiegelt de impedantie op de ionenflux over de cel monolaag en de afname verschaft een gevoelige maatstaf van gecompromitteerde endotheliale barrière integriteit en derhalve verhoogde permeabiliteit. Diverse TEER meetsystemen zijn ontwikkeld, waaronder epitheliale Voltohmmeter (EVOM), elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS), en real-time cell analyse 15,28 - 30. TEER weerspiegelt de weerstand tegen ion flux tussen aangrenzende EC (paracellulaire route) en is recht evenredig met debarrière integriteit. In impedantie spectroscopie 27,31, is complex totale impedantie (Z) gemeten, die meer informatie over de barrière integriteit door het meten van Ccl biedt. Ccl betreft de capacitieve stroom door het celmembraan (transcellulaire route): de cellaag fungeert als een condensator in het equivalente elektrische circuit, het scheiden van de lasten aan beide zijden van het membraan en is omgekeerd evenredig met de barrière integriteit. Wanneer geteeld op doorlatende inserts, EC hechten, vermenigvuldigen en verspreid over het microporeuze membraan. Dit weerstaat de achtergrond capacitieve stroom van het inzetstuk (die zelf werkt als een condensator) en leidt tot een afname van de capaciteit tot aan de minimale niveau bereikt. Dit wordt gevolgd door de instelling van TJ complexen die afdichting van de ruimte tussen aangrenzende EC. Dit beperkt de ion flux door de paracellulaire route en TEER verhoogt tot het zijn plateau bereikt. Onder ontstekingstoestanden, maar de endothelial barrière in het gedrang komt: TEER afneemt als TJ complexen krijgen verstoord en Ccl toeneemt naarmate de capacitieve component van het inzetstuk weer stijgt.
Onze TEER meting maakt gebruik van de geautomatiseerde celbewaking 32 systeem: het volgt het principe van impedantie spectroscopie en breidt haar eerdere aanvragen. Hier beschrijven we een in vitro model BBB dat de studie van de barrière-eigenschappen, zoals de interactie van hersenen endotheel met immuuncellen mogelijk maakt; met name geactiveerde T-cellen. Zulke pathofysiologische aandoeningen zijn waargenomen bij auto-immuunziekten van het CZS, zoals multiple sclerose en diermodel experimentele autoimmune encefalomyelitis 33-37. Hier, een cruciale stap is de transmigratie van encefalitogene, myeline-specifieke T-cellen over de BBB. Dit wordt gevolgd door reactivering in de perivasculaire ruimte en het in het hersenparenchym, waar ze rekruteren andere immuuncellen en melijke ontsteking en daaropvolgende demyelinatie 1,35,38. Echter, de moleculaire mechanismen van de interactie tussen deze T-cellen en endotheelcellen, de hoofdbestanddelen van de BBB, zijn niet goed begrepen. Ons protocol is bedoeld om deze leemte op te vullen en geeft nieuwe inzichten in de gevolgen op endotheelcellen (dat wil zeggen, barrière integriteit en permeabiliteit) op hun directe contact en de complexe interactie met geactiveerde T-cellen.
De hier beschreven protocol maakt gebruik van primaire muizenhersenen microvasculaire endotheliale cellen, gekweekt als een monolaag op permeabele inserts met microporeuze membranen. Endotheelcellen samen gekweekt met CD4 + T-cellen, die vooraf worden geactiveerd hetzij polyklonaal of een antigeen-specifieke wijze. Co-cultuur van MBMECs met pre-geactiveerde, maar niet naïeve T-cellen induceert een daling van TEER en een toename van Ccl die een kwantitatieve meting van de MBMEC dysfunctie en barrièrebeschadiging verschaft. de techniekis non-invasief: het gebruikt ingebouwde plaats van eetstokje elektroden, die belangrijke verstoring van de EC monolaag te voorkomen; het kan worden gebruikt om de barrièrefunctie te controleren zonder het gebruik van celmarkers. Het maakt continue metingen op een geautomatiseerde manier en maakt een onafhankelijke beoordeling van de twee barrière parameters (TEER en Ccl) tegelijkertijd in de tijd. De werkwijze is gevoelig genoeg om onderscheid te maken tussen verschillende T cel activering en werking van dergelijke T-cellen op EC.
Het kan worden gebruikt in een breed scala aan functionele testen: verschillende cytokinen en / of chemokinen betrokken bij ontstekingsprocessen kunnen de co-cultuur van MBMECs en T-cellen worden toegevoegd; blokkerende antilichamen tegen celadhesie moleculen aan beide EG of T-cel zijde kan worden gebruikt; en inhibitoren van T-cel activatie merkers of hun cytolytische eigenschappen kunnen tijdens de T-cel priming of de co-kweek met EC's worden toegevoegd. De test is ook bruikbaar voor T-cel transmigratieassays, omdat het als een kwaliteitscontrole van de integriteit MBMEC monolaag voorafgaande aan de toevoeging van T-cellen kunnen dienen. Dit alles maakt deze methode een veelzijdig en betrouwbaar instrument om de BBB in vitro onderzoek, met een focus op het effect van geactiveerde T-cellen op monolaag integriteit EC. Dit is van bijzonder belang voor het begrijpen van de mechanismen van de BBB verstoring in de pathogenese van auto-immuunziekten, zoals MS en EAE diermodel, waarbij autoreactieve, encefalitogene T-cellen steek de BBB en ontsteking en neuronale schade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor alle experimenten werden muizen gefokt en onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden bij de centrale dierenverblijf van de Universiteit van Munster gehandhaafd volgens de Duitse richtlijnen voor dierverzorging. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het dier experimentele ethische commissie en door de plaatselijke autoriteiten van Noord-Rijnland-Westfalen, Duitsland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) goedgekeurd.
1. MBMEC Isolatie en Cultuur
LET OP: Isoleer MBMECs zoals eerder in detail 14 beschreven met de volgende wijzigingen:
- Sacrifice 20 volwassen C57BL / 6 muizen (6-8 weken oud) door CO 2 inademing en bevestigen hun dood door het vaststellen van hart- en ademstilstand.
- Spoel de muis met 70% ethanol en onthoofden met behulp van een schaar; Verwijder de hoofdhuid met behulp van pincet en een schaar. Maak insnijdingen aan de linker- en rechterzijde van de schedel, vanaf het foramen magnum. Til de schedel van zijn staart kant en take van de hersenen met een tang.
- Onder een laminaire stroming kap Gebruik steriele tang om de hersenen te plaatsen in een petrischaal en verwijder de hersenstam, het cerebellum en thalamus, die slechts de cortex.
Opmerking: Het gebruik van een microscoop is niet nodig voor een van deze stappen. - Plaats de cortex op een stuk van steriele Western blotting papier en rol het voorzichtig met een pincet totdat hersenvliezen zijn niet meer zichtbaar.
- Na mechanische en enzymatische digestie (volgens het protocol 14), verzamelen endotheelcellen van de dichtheidsgradiënt met een lange, steriele naald en een 5 ml plunjer. Endotheelcellen verschijnen als een duistere laag boven de rode ring met erytrocyten. Overdracht 20-25 ml van deze laag in een nieuwe 50 ml centrifugebuis; bijvullen van de buis met DMEM.
- Na twee wassen 14, resuspendeer de cellen in 6 ml MBMEC medium dat Puromycine (4 ug / ml) en zaden ze op zes beklede putjes van een 24-puts plaat; laat ze in een tissueincubator bij 37 ° C en 5% CO 2 (hierna broedplaats vanaf hier) gedurende drie dagen.
LET OP: Voor meer informatie over MBMEC coating oplossing, zie materialen tabel. - Verander het medium door toevoeging van 1 ml aan elk putje van vers medium zonder MBMEC Puromycine; zet de plaat weer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende twee dagen.
2. Oogsten MBMECs
- Op dag vijf na MBMEC isolatie voorbekleding doorlatende inzetstukken met MBMEC bekledingsoplossing: voeg 80 ul oplossing per wisselplaat en laat ze bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 uur.
- pipet voorzichtig uit de coating-oplossing en laat de inserts lucht drogen gedurende 30 min. Voeg 2 ml van kamertemperatuur (KT) PBS aan elk putje van de plaat met behulp MBMECs aan het medium was; herhaalt u deze stap. Voeg 0,05% trypsine-EDTA (300 gl per putje) en laat de plaat in de incubator gedurende 5-10 minuten.
- Voeg 2 ml MBMEC medium aan elk putje stoppentrypsine. Breng de verzamelde cellen naar een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer ze bij 700 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml medium zonder MBMEC Puromycine.
- Tel de cellen; meng 10 pl celsuspensie met 90 pi 0,04% trypan blauw (10x verdunning van cellen). Pipet 10 ul van deze mix tussen het glazen deksel en de cel telkamer (hemocytometer). Aantal Trypan Blue-vrije cellen in alle vier de kwadranten van de kamer (N) en het gemiddelde aantal getelde cellen (N ') te bepalen als volgt: N = N / 4.
- Bereken de celconcentratie (in 10 6 cellen / ml) met de volgende formule: C = N 'x 10 x 10 4, waarbij 4 10 wordt gegeven door de afmetingen van de hemocytometer en 10 is de verdunningsfactor stap 2,4.
- Zaad 2 x 10 4 cellen in een volume van 260 gl per insert. Voeg 810 ul van MBMEC medium naar het onderste compartiment van elk putje. Plaats de plaat met inzetstukken in de couveuse tot klaar om verder te gaan met deel 4.
OPMERKING: De volumes van de bovenste en onderste compartiment insert-specifieke en werken niet voor alle 24-well formaat.
3. CD4 + T Cell Isolatie en stimulatie
- CD4 + T Cell Isolation
- Offer een volwassen muis (6-8 weken oud) door CO 2 inademing en bevestig de dood door het vaststellen van hart- en ademstilstand.
- Plaats de muis op zijn rug op een schone dissectie board en spoel het met 70% ethanol; Gebruik steriele schaar en een tang om het buikvlies te openen en verwijder de milt en lymfeklieren (lies, oksel, arm en baarmoederhalskanker); Breng tenslotte het weefsel in een 15 ml centrifugebuis met 5 ml PBS op ijs.
- Onder de laminaire stroming kap, de overdracht van de weefsel door decanteren PBS met het weefsel in een 50 ml centrifugebuis met een 70 micrometer cel zeef op de top; homogeniserenhet weefsel door te drukken met 1 ml plunjer door de zeef.
- Voeg 30 ml FACS buffer en centrifugeer in bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml van FACS-buffer. Filtreer de suspensie door een 40 um cel zeef, voeg 20 nog ml FACS-buffer aan de buis.
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 ui FACS-buffer.
- Voeg 20 ul van muis CD4 magnetische microkralen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Voeg 25 ml FACS buffer en centrifugeer in bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Ondertussen plaats een LS scheidingskolom in de magneet en spoel met 3 ml van FACS-buffer. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml FACS-buffer.
- cellen toevoegen aan de kolom. Was de kolom met 3 ml FACS buffer driemaal. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats het op een nieuwe 15 ml Centrifugation buis. Voeg 5 ml FACS-buffer, spoel de gemerkte cellen met de kolom plunjer en Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 min 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml T-celmedium. Tel de cellen zoals is beschreven in 2,4 en zaden 1 x 10 5 cellen in 100 pl medium per well.
- CD4 + T cel stimulatie
- Polyklonale CD4 + T-cel stimulatie
- Voorbekleding een ronde bodem 96-well plaat met gezuiverd anti-muis CD3 antilichaam (kloon 145-2C11) in PBS, op een gewenste eindconcentratie. Bijvoorbeeld, een pre-coat volledige plaat met α-CD3 bij 1 ug / ml meng 10 pl van het antilichaam (stock concentratie = 0,5 mg / ml) met 5 ml PBS, vortex en voeg 50 ul van het mengsel tot elk putje met een multichannel pipet.
- Laat de plaat in de incubator gedurende 3 uur. Na isoleren van de T-cellen, was de pre-beklede plaat tweemaal met PBS. Add gezuiverd anti-CD28-antilichaam (kloon37,51) van geïsoleerde T-cellen met een gewenste eindconcentratie (bijvoorbeeld bij 1 ug / ml); goed mengen. Zaad de T-cellen en laat ze in de incubator gedurende 2-3 dagen.
- Antigeenspecifieke CD4 + T-cel stimulatie met dendritische cellen (DCs)
LET OP: Als DCs worden gebruikt als antigeen presenterende cellen (APC's), volg het protocol voor de T-cel isolatie, met deze uitzonderingen:- Voordat het homogeniseren van de milt, injecteren met 1 ml collagenase type IA in PBS bij 0,5 mg / ml en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis.
- Incubeer in het waterbad bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Na wassen met PBS, resuspendeer de pellet in FACS buffer en voeg 20 ul van muis CD11c magnetische microkralen plaats van CD4 microkralen.
- Gebruik een scheidingskolom MS en de passende hoeveelheden: Spoel de kolom met 1 ml FACS buffer; resuspendeer cellen in 1 ml FACS buffer en spoel de kolom met 1 ml FACS buffer driemaal.
- Advertentied antigeen keuze naar DCs (bijvoorbeeld myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) aa 35-55 bij 20 ug / ml), mengen en zaad 5 x 10 4 cellen in 100 gl T celkweekmedium per 96-round-bottom goed.
- Voeg 1 x 10 5 T-cellen in 100 gl T celkweekmedium per 96-rondbodem putjes aan het einde, zoals beschreven in het protocol voor T celisolatie.
- Antigeenspecifieke CD4 + T-cel stimulatie met B-cellen
LET OP: Als B-cellen worden gebruikt als APC's, volgt het protocol voor T-cel isolatie, met deze uitzonderingen:- Gebruik milt van transgene muizen waarvan B-cellen zijn antigeenspecifieke (bijv IgH MOG (Th) muizen, waarvan de B-cellen herkennen specifiek MOG 35-55).
- Gebruik antigenspecifieke T-cellen (bijvoorbeeld van TCR MOG (2D2) muizen). Voeg 20 ul van muis CD19 magnetische microkralen plaats van CD4 microkralen.
- Voeg het antigen van keuze om de B cells (bijvoorbeeld MOG 35-55 bij 20 ug / ml), mengen en zaad 5 x 10 4 cellen in 100 gl kweekmedium B-cel per 96-round-bottom putjes.
- Voeg 1 x 10 5 T-cellen in 100 gl T celkweekmedium per 96-rondbodem putjes, zoals beschreven in het protocol voor T celisolatie.
- Polyklonale CD4 + T-cel stimulatie
4. Opstellen en uitvoeren TEER Measurement
- Plaats de 24-well module van de TEER instrument onder de laminaire stroming kap. Verwijder de deksels en plaats wisselplaten met MBMECs in het instrument met behulp van een tang.
- Pipetteer 810 ul vers medium aan het onderste compartiment van de module putten voorzichtig toevoegen tussen het inzetstuk en de wand van de module ook.
- Sluit de deksels en zet het instrument in de incubator. Sluit het instrument op zijn computer; zet het instrument controller en de software opent.
- Selecteer 'nieuwe meting' in het pop-up venster. Check 'Toon TEER' en 'Toon Ccl' vakken; Druk vervolgens op 'start'. Na het voltooien van de eerste meting, selecteer 'check alle putjes' in het tabblad 'resultaten' om alle TEER en Ccl waarden zien.
- Sla het bestand op: Bestand> Opslaan als> 'de naam van het bestand'.
LET OP: Als TEER en Ccl continu worden gemeten op een geautomatiseerde manier, hun waarden te volgen over een periode van drie tot vijf dagen. Waarbij het medium is niet nodig, tenzij cellevensvatbaarheid niet optimaal zijn, zoals gevisualiseerd door een gebrek aan toename TEER. - Kies het tijdstip om samen cultuur MBMECs met T-cellen wanneer Ccl is stabiel en lager dan 1 uF / cm 2 en TEER heeft zijn maximum bereikt.
- Inspecteer absolute TEER en Ccl waarden zijn exclusief de putten waarin MBMECs niet genoeg samenvloeiende monolagen hebben ontwikkeld door het vinkje dergelijke putten.
- Groep de rest van de putten: klik met de rechtermuisknop op een goed en selecteer 'goed toe te voegen aan de nieuwe gemiddelde goed'. Name in het pop-up venster; Doe hetzelfde voor alle afzonderlijke putjes worden gegroepeerd.
- Controleer alle gemiddelde putten om te bevestigen dat ze allemaal dezelfde oorspronkelijke voorwaarden voor de co-cultuur. Als sommige hebben significant verschillende absolute waarden TEER TEER of hellingen, of de standaard fouten zijn te groot, opnieuw de groepering.
LET OP: De optimale combinatie van waterputten biedt minimale variatie in TEER waarden, zowel binnen als tussen de experimentele groepen. - In het tabblad 'experiment', drukt u op 'pauze', de stekker uit het instrument en neem het uit de incubator. Verwijder de deksels onder de laminaire stroming kap.
- Bereid vooraf geactiveerd en / of naïeve T-cellen, met of zonder specifieke cytokinen, antilichamen of andere stoffen, zoals gewenst: Bijvoorbeeld: mix gezuiverd NA / LE rat anti-muis IFN-γ-antilichaam (kloon XGM1.2) met voorbereide T cellen, bij 20 ug / ml per putje van de TEER instrument.
NB: Als stoffen zoals granzyme B remmer gebruikt worden, zijn ze eenT OEGEVOEGDE naar T celkweek begin van T-cel stimulatie: bijvoorbeeld, Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) wordt gemengd met geïsoleerde T-cellen in een eindconcentratie van 10 uM in DMSO. Zie materialen en apparatuur voor meer details. - Verwijder een deel van het medium van de insert (het bovenste compartiment goed): bv, voorzichtig pipet uit 150 ul (het verwijderen van al het medium dient te worden vermeden omdat dit de MBMEC monolaag kunnen verstoren).
- Voeg T-cellen aan MBMECs door voorzichtig pipetteren 150 ul medium dat 2 x 10 5 cellen / insert.
LET OP: Bij het oogsten van pre-geactiveerde T-cellen, tellen alleen stralen, Trypan Blue-vrije cellen. - Sluit de deksels en zet het instrument terug naar de incubator. Sluit het instrument en druk op 'resume meting'. Na 24 uur, drukt u op 'stop' in het tabblad 'experiment' en sla het bestand op (Bestand> Opslaan).
5. De gegevens exporteren en statistische analyse
- Exporteer de resultaten door te kiezen voor Bestand> Exporteren.
- In het tabblad "instellingen" van het pop-up venster, selecteer ".dot" in de optie "decimaalteken" en "tabulator" in de optie 'veldscheidingsteken ".
- In het tabblad "export resultaten", de naam van het bestand, laat U alle putten uit te voeren, en controleer de "TEER" en "Ccl" dozen in de "kiest data" optie.
- Druk op 'gegevens exporteren', opent u het geëxporteerde bestand, en de gegevens te kopiëren naar een spreadsheet.
- Normaliseren van de geëxporteerde gegevens (naargelang elk repliceren, met TEER en Ccl waarden voor elke run (meting)): Set TEER en Ccl waarden van het laatste tijdstip voor de co-cultuur tot 100% en wijzigt bijgevolg de waarden voor alle andere runs, ten opzichte van de '100%' run.
- Kopiëren genormaliseerde gegevens naar een software naar keuze een grafiek te genereren met afzonderlijke putjes en tonen de standaardfout van het gemiddelde voor elke behandelingsgroep.
- Perform Two-way ANOVA statistische test met een Bonferroni correctie voor meerdere vergelijkingen, met behulp van de statistische software van uw keuze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft een algemeen overzicht van de in vitro BBB model gebruikt om de interactie tussen T-cellen en endotheliale cellen te bestuderen. Het experiment bestaat uit drie belangrijke stappen. De eerste stap is de isolatie van primaire MBMECs van hersenen cortex en hun cultuur gedurende vijf dagen. Wanneer ze samenvloeiing bereiken in de celcultuur plaat, worden MBMECs getrypsiniseerd en opnieuw uitgezet op doorlatende inzetstukken, die vervolgens in de TEER instrument zijn geplaatst. De TEER en Ccl van MBMECs worden continu gemeten en gemonitord over een periode van drie tot vijf dagen. Ondertussen T-cellen worden geïsoleerd, gestimuleerd (stap 2), en gekweekt gedurende 2-5 dagen, het type en de sterkte van de stimulus. In stap 3, worden T-cellen toegevoegd en co-gekweekt met MBMECs wanneer Ccl is een stabiele laag en de TEER op zijn maximum. Kiezen voor dit tijdstip voor de co-cultuur als de TEER is nog steeds op het plateau is van cruciaal belang voor het welslagenvan de gehele meting. Derhalve is het uiterst belangrijk dat de tijd voor T cel isolatie en stimulatie zorgvuldig gekozen, zodat T-cellen de gewenste mate van activering door het tijdstip van toevoeging aan de EC bereikt. Na toevoeging van T-cellen, wordt de meting hervat één dag en de resultaten worden geanalyseerd.
Na de eerste vijf-daagse cultuur MBMECs direct zichtbaar karakteristieke spoelvormige morfologie (Figuur 2A, linker paneel) en een automatische endotheliale celspecifieke markers zoals PECAM-1 en Claudin-5 (Figuur 2A, middelste en rechter panelen). Echter, dit alleen niet voldoende bewijs van hun volledige samenvloeiing en de juiste barrière integriteit. Impedantiespectroscopie, anderzijds, geeft een goede schatting van de monolaag integriteit en dient als een kwaliteitscontrole van elk putje voor de voorstelling van een functionele assay. In figuur 2B meestewells bevatte MBMECs waarvan Ccl waarden waren stabiel en laag, en hun TEER waarden bereikte een plateau. Deze putjes werden gebruikt voor daaropvolgende co-kweek-experimenten. Ze werden gegroepeerd zodanig dat variantie binnen en tussen groepen was minimaal voor het toevoegen van T-cellen (Figuur 2C). De putjes waarvan TEER waarden significant van de rust (zoals de blauwe curve aangegeven in Figuur 2B) niet gebruikt, die zouden leiden tot dubbelzinnige resultaten of verkeerde interpretatie van de gegevens.
Op voorwaarde dat de eerste vereisten voor MBMEC cultuur en T-cel stimulatie is voldaan, kan impedantie spectroscopie waardevolle inzichten in de T-cel-EC interactie geven. TEER meting kan dienen als primaire aflezing voor deze interactie en meting van de T-cel gemedieerde EC disfunctie, zoals getoond in figuur 3A en 3B. In dit geval worden MBMECs geteeld op inzetstukken met microporiën 0,4urn in diameter, dat niet toelaat T cellen door het inzetstuk membraan te passen. Figuur 3A toont dat alleen gestimuleerd, maar niet naïeve T-cellen kunnen induceren EG disfunctie, zoals bepaald door een afname in TEER en toename Ccl. Naïeve T-cellen kan dus dienen als een negatieve controle, omdat TEER en Ccl tijdens de co-cultuur met naïeve T-cellen verblijven in hun oorspronkelijke niveau. De uitzondering is de piek bij het begin van de co-cultuur, door behandeling van het instrument (tillen de deksels, toevoegen van nieuw medium met cellen die enigszins verschillende temperaturen en pH waarden kunnen hebben, en sluiten van de deksels). Dit artefact verschijnt met allerlei TEER metingen en wordt genegeerd tijdens de analyse. De toevoeging van het pro-inflammatoire cytokines IFN-γ en TNF-α (bij 100-500 U / ml), waarvan bekend is kan induceren EG ontsteking is, kan worden gebruikt als positieve controle. In figuur 3A, MOG 35-55 -specifieke CD4
Om de mechanismen van de beschreven MBMEC monolaag verstoring onderzoeken kunnen verschillende benaderingen worden toegepast. Resultaten in Figuur 3C tonen dat de gestimuleerde T-cellen, maar niet hun supernatanten veroorzaakte een aanzienlijke schade aan de MBMECs geven dat direct contact tussen T-cellen en MBMECs is essentieel voor barrièrebeschadiging. Bovendien, het toevoegen van een neutraliserend α-IFN-γ antilichaam tijdens de TEER meting slechts licht verbeterd MBMEC barrière-eigenschappen, wat suggereert dat IFN-γ niet de primaire oorzaak van deze verstoring kan zijn. Anderzijds, het toevoegen granzyme B Inhibitor II tot T cellen (figuur 3D) herstelde MBMEC integriteit in grotere mate, dat naar het cytolytische molecuul als belangrijke speler in MBMEC veroorzaken schade en daaropvolgende afname in TEER.
Naast het gebruik als primaire aflezing voor het effect van T-cellen op monolaag integriteit EG kan TEER metingen ook worden gebruikt als een kwaliteitscontrole barrière integriteit vóór andere tests, zoals T-cel-assay transmigratie. In dit geval voegt microporiën van 3 urn in diameter gebruikt. In Figuur 3E, werd TEER meting uitgevoerd zodat MBMEC monolaag van hetzelfde niveau van integriteit in alle putjes vóór de toevoeging van T-cellen voor daaropvolgende transmigration assay. Dit werd gevolgd door oogsten van T-cellen van het onderste compartiment van het instrument putjes, kleuring T-cellen met α-CD4 antilichaam en flow cytometrische analyse met behulp celtellingen kralen absolute aantallen transmigrated T cellen te bepalen; figuur 3E, midden en rechts). Merk op dat T cellen voor transmigratie veroorzaakte geen aanzienlijke afname TEER gestimuleerd, hoewel zij vooraf geactiveerd zoals in figuur 3A. Dit kan tijdens de transcellulaire route immuuncellen kan tijdens de transmigratie, zoals eerder 39 waargenomen. In Figuur 3F, de helft van de putjes met MBMECs zijn verhit met IFN-γ en TNF-α (niet-ontstoken vs. Ontstoken), en later werden naïeve T-cellen toegevoegd beoordeling van transmigratory activiteit. In dit geval TEER meting overeenkomstig een aanwijzing over hoe sterk de ontsteking met cytokinen is en wanneer T-cellen worden toegevoegd voor transmigration.
Figuur 4 toont enkele van de meest voorkomende situaties die kunnen leiden tot verkeerde interpretatie van TEER resultaten. In figuur 4A bijvoorbeeld niet alle MBMECs ontwikkelde een volledig confluente monolaag tegelijk. Één van de groepen (naïeve T-cellen - uitgesloten ") bevatte MBMECs waarvan TJ complexen rijpen met een andere snelheid dan de andere groepen net vóór de toevoeging van T-cellen. Deze groep bijgevolg TEER waarden boven 100% ontwikkeld tijdens het experiment en werd uitgesloten van verdere analyse. Dus de helling van de curve TEER (percentage TJ rijping) voor het experiment is even belangrijk als absolute TEER waarden voor de juiste interpretatie van gegevens. Figuur 4B toont dat het starten van de co-cultuur niet alleen te vroeg, maar ook te laat kan leiden tot verkeerde resultaten. Hier, in zowel de groep gestimuleerde T-cellen en de negatieve controlegroep (gemiddeld Change) zijn TEER waarden al voorbij hun plateau en begon onafhankelijk dalen van de experimentele conditie dus aangeeft suboptimale kweekomstandigheden voor en tijdens het experiment. Dergelijke groepen moeten niet worden opgenomen in de analyse. Tot slot, hoewel TEER en Ccl gewoonlijk de waarden zodanig dat een grotere afname in TEER gepaard gaat met een grotere toename van Ccl veranderen, dit niet altijd het geval. In figuur 4C, gestimuleerde T-cellen B veroorzaakt een grotere daling van de TEER, maar een kleinere toename van Ccl dan gestimuleerde T-cellen A deed.
Figuur 1: Algemeen overzicht van de techniek. Na de eerste cultuur worden MBMECs reseeded op doorlatende inserts en geplaatst in de geautomatiseerde cel-monitor; TEER en Ccl worden elk uur gemeten voor 4-5 dagen. Ondertussen worden T-cellen geactiveerd in vitro 40. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: MBMECs ontwikkelen van een confluente monolaag geschikt is voor een in vitro model BBB. (A) As-vormige morfologie (links) en immunofluorescentie kleuring van PECAM-1 (midden) en Claudin-5 (rechts) vijf dagen na MBMEC isolatie. (B en C) en Ccl TEER waarden voor (B) en na (C) groepering van afzonderlijke putjes voorafgaand to toevoeging van T-cellen. De blauwe kromme in (B) wordt niet gebruikt voor het experiment, aangezien MBMECs in dit goed niet zo hoog als in de andere putten ontwikkeld TEER. Gegevens in (C) tonen gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten. (AD) Veranderingen in TEER als primaire maatstaf voor MBMEC disfunctie na interactie met T-cellen. (A) MOG-specifieke T-cellen werden geactiveerd door MOG-specifieke B-cellen in aanwezigheid van MOG 35-55 peptide gedurende vijf dagen. Naïeve T-cellen en cytokines IFN-γ en TNF-α (beide 100 U / ml) diende als negatieve en positieve controles, respectievelijk. (B) T-cellen werden gestimuleerd met CD3 en α-α-CD28 antilichamen (1 ug / ml elk) gedurende twee of drie dagen, zoals aangegeven, alvorens ze toe te voegen aan MBMECs. (C) T-cellen (pre-geactiveerde als in (A)) of de supernatanten, in aanwezigheid van α-IFN-γ-antilichaam of de overeenkomstige isotype controle. (D) T-cellen (pre-geactiveerd zoals in (B)) gedurende twee dagen in aanwezigheid van granzyme B remmer II of het verdunningsmiddel DMSO. (E en F) TEER meting alleen als kwaliteitscontrole voor belemmering integriteit voorafgaand aan T-cel transmigratie. MBMECs werden gekweekt op inserties met poriën van 3 urn in diameter. (E) T-cellen, gestimuleerd zoals beschreven in (A), werden verhuurd aan transmigreren 18 uur (links). Vervolgens werden zij geoogst en gekleurd voor α-CD4-antilichaam (kloon RM4-4) en middels flowcytometrie geanalyseerd middels celtellingen kralen (midden rechts). (F)Monitoring van MBMEC monolaag integriteit na stimulering met IFN-γ en TNF-α en kiest het geschikte tijdstip voor daaropvolgende toevoeging van T-cellen voor transmigratie assay. (AF) Resultaten Technische drievoud en zijn representatief voor alle drie onafhankelijke experimenten. Uit de gegevens blijkt gemiddelde ± SEM. (E, rechts) Unpaired, tweezijdig Student's t-test. **, P <0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: praktische overwegingen en interpretatie van de gegevens. (A) MBMECs van de ene experimentele groep (rode curve) werden uitgesloten van de analyse, aangezien de snelheid van rijping van hun junctionele complexen werd anders in vergelijking met andere groups. (B) Een voorbeeld van het toevoegen van T-cellen te laat, die een goede beoordeling van MBMEC dysfunctie voorkomen. (C) Bij verstoring door A gestimuleerde T-cellen (zwarte kromme), Ccl waarden van MBMECs vertoonden een dramatische toename dan zou worden verwacht van de gelijktijdige verlaging van TEER veroorzaakt door dezelfde T-cellen. (AC) T-cellen werden gestimuleerd met CD3 en α-α-CD28 antilichamen (1 ug / ml elk) gedurende twee dagen. Resultaten Technische drievoud en zijn representatief voor alle drie onafhankelijke experimenten. Uit de gegevens blijkt gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende stappen van het beschreven protocol zijn essentieel voor een geslaagd experiment. Tijdens de eerste MBMEC isolatie en kweek, is het cruciaal dat gewerkt wordt onder steriele omstandigheden zo veel mogelijk om de verontreiniging van de celkweek met schimmelsporen en bacteriën te voorkomen. Om een reincultuur van EC te verkrijgen, wordt aanbevolen een medium dat Puromycine voor de eerste drie dagen, die overleving van EC maakt, maar geen andere celtypen (met name pericyten) 41,42 gebruiken. Een andere belangrijke stap die aandacht verdient is de identificatie van de juiste tijd voor het toevoegen van vooraf geactiveerde T-cellen. Tijdens de eerste 48 uur van TEER meting MBMECs verspreiden zich op permeabele inserts en sluit de gaten tussen elkaar. Daarom Ccl af totdat een stabiele en lage niveau (ongeveer 0,6 pF / cm 2) bereikt. Dit is het eerste teken van een confluente monolaag EG, maar is nog geen teken van een strakke barrière. Alleen naCCL heeft een stabiel niveau doet de TEER beginnen te verhogen bereikt. Wanneer TJ complexen volledig gevormd en het EG-barrière is volledig afgesloten, TEER bereikt zijn maximum niveau. Dit plateau wordt gewoonlijk bereikt 3-5 dagen na de inzaaiing EC en gedurende nog 24 tot 36 uur. Het beste tijdstip voor het toevoegen van de T-cellen aan het begin van het plateau, die ervoor zorgt dat de EC nog levensvatbaar genoeg om samen gekweekt met de T-cellen. Aangezien de T-celactivering heeft voor het optimale tijdstip voor co-cultuur kan veilig worden voorspeld wordt ingeleid, kan het voordelig zijn om twee batches van T-cellen stimuleren op twee verschillende dagen om de flexibiliteit van de timing verhogen. Tenslotte groepen gecombineerd herhalingsputjes voor het toevoegen van T cellen aan de MBMECs moet op zodanige wijze dat variabiliteit binnen en tussen de groepen is minimaal. Dit verzekert dat de omstandigheden gelijk zijn bij alle groepen tijdens de gelijktijdige kweek van T-cellen en MBMECs. Ons protocol beschrijft TEER gemeten tijdens de gelijktijdige kweek van primaire muizenhersenen EC met pre-geactiveerde CD4 + T-cellen. De eenvoudige vorm maakt meerdere modificaties volgens de wetenschappelijke behoeften. Bijvoorbeeld kunnen het type, sterkte en duur van de stimulus gevarieerd. Antigeenspecifieke CD4 + T-cellen kunnen worden geactiveerd door hun verwante antigeen in aanwezigheid van geschikte antigeen presenterende cellen (APC's); Alternatief kan T-cellen polyklonaal geactiveerd door α-α CD3 en CD28 antilichamen. De T-cel activatie status kan worden gemoduleerd door verschillende cytokinen, blokkerende antilichamen, remmers. Vervanging van primaire hersentumoren EC met endotheliale cellijnen wordt afgeraden, echter, aangezien het bekend is dat deze toon minder restrictieve TJ complexen en hogere permeabiliteit in vergelijking met de primaire cellen 43. Naast het meten van TEER als de primaire uitlezing, dit protocol zorgt voor een goede kwaliteitscontrole van het EG-monolayer integriteit voor de T-cel transmigratie assay (figuur 3E, F). Opmerkelijk kan TEER waarden niet noodzakelijkerwijs afnemen in de transmigratie van T-cellen in de MBMECs (Figuur 3E): dit kan weerspiegelen de transcellulaire route immuuncellen kan tijdens transmigratie, zoals hiervoor is 39,44 waargenomen.
Geactiveerde T-cellen EC dysfunctie induceren tijdens het gelijktijdig kweken, TEER toont een gestage, voorspelbare daling, vergelijkbaar tussen experimenten onder dezelfde voorwaarden. Een grotere afname in TEER gaat meestal gepaard met een grotere gelijktijdige verhoging Ccl. In zeldzame gevallen echter een toename Ccl kan meer uitgesproken dan zou worden verwacht van de overeenkomstige daling TEER (figuur 4C) zijn. Deze discrepantie kan verschillende aspecten van EC monolaag verstoring weerspiegelen. Zoals EC proberen om de gaten gevormd tijdens de barrière verstoring te sluiten, kunnen ze dynamische veranderingen in ondergaanmorfologie en beweeglijkheid zoals vormende uitsteeksels en de totale oppervlakte, die allemaal kunnen bijdragen aan een drastische en snelle toename Ccl verhogen. Dit maakt veranderingen in Ccl minder voorspelbaar dan veranderingen in TEER. Zo is de mate van afname in TEER blijft de meest betrouwbare en representatieve mate van gecompromitteerde barrière integriteit.
Deze test kan worden aangevuld met andere technieken om endotheliale barrière-eigenschappen te onderzoeken. Het zal door een permeabiliteit assay, die de hoeveelheid moleculen van verschillende grootte die diffunderen door de onderbroken EC monolaag 44 meet. Hiertoe kan fluorescent gelabelde dextran conjugaten, zoals fluoresceïne en Texas Red worden gebruikt; andere moleculaire tracers zijn ook beschikbaar (bijvoorbeeld, sucrose, mannitol, albumine, Evans Blue en mierikswortelperoxidase) 26. Bovendien kan immunofluorescentie microscopie worden gebruikt om de veranderingen in eiwitexpressie te onderzoekenen de cellulaire lokalisatie van TJ en celadhesiemoleculen. Hoewel het gepresenteerde BBB model is zeer eenvoudig, kan het verkregen met deze resultaten waardevolle leidraad te verstrekken voor assays onder meer fysiologische omstandigheden. Dergelijke testen omvatten (maar niet uitsluitend) in vitro assay voor schuifkracht TEER gemeten onder statische omstandigheden en permeabiliteit in vivo assay met Evans Blue injectie verkregen in levende muizen vertegenwoordigen de complexiteit van de BBB vullen.
Hoewel gevoelige en betrouwbare, de hier beschreven methode heeft een aantal beperkingen die speciale aandacht verdienen. De maximale TEER gemeten in onze experimentele opstelling bereikt waarden van 35-40 Qcm 2. Deze TEER waarden zijn veel lager dan in vivo, waarbij verschillende celtypen en acellulaire componenten bijdragen tot de integriteit van BBB, maar ze zijn ook niet zo hoog als TEER waarden bereikt anderszins in vitro BBB modellen <sup> 26,45,46. Dit kan worden verbeterd door de toevoeging van hydrocortison de EG medium, dat is aangetoond dat het sterk verbeteren spereigenschappen 27,47 - 49. Echter, het gebruik van dergelijke stoffen - bekende anti-inflammatoire en immunosuppressieve effecten - is niet geschikt voor alle functionele assays. Als de focus van dit protocol is over de gevolgen van de EG-T-cel-interacties op barrière integriteit, zou de interpretatie worden gehinderd door de toevoeging van hydrocortison. Met het protocol hier volgt gepresenteerd maakt de beoordeling van de werkelijke inflammatoire potentieel van gestimuleerde T-cellen om EG barrière disfunctie. Het is ook vermeldenswaardig dat directe vergelijking van verschillende TEER waarden in de literatuur dient te worden betracht. Die waarden zijn sterk afhankelijk van de experimentele opstelling worden deze verkregen met verschillende celtypes, zaaien celdichtheden, media, celgroei gebieden en TEER meetsystemen (bijvoorbeeld </ Em>, de vorm en de grootte van de elektroden).
Om de in vivo situatie beter nabootsen, complex in vitro BBB modellen zijn vastgesteld, waarbij ECs zijn samen gekweekt met pericytes aan de tegenoverliggende zijde van het inzetstuk membraan, of wanneer pericyten en astrocyten worden geteeld op de bodem van de putjes 12,25,50 - 52. In een dergelijke co-kweeksystemen, overspraak tussen de verschillende celtypes in staat stelt sterkere aanscherping van de barrière, met triple co-culturen de beste in die lijkt op de in vivo situatie en dus de hoogste TEER waarden. De complexiteit van deze systemen, anderzijds, vormt een beperking van grootschaliger gebruik ervan in vitro BBB modellen.
Een andere beperking van dit model is het gebrek aan schuifspanning, waarvan is aangetoond dat om de barrière integriteit 53,54 verbeteren. Om dit probleem op te lossen, hebben nieuwe dynamiek BBB modellen onlangs geïntroduceerd: ECs worden gekweekt in holle vezels en onderworpen aan pulsatiele stromingscondities, nabootsen nauwer microvasculatuur in vivo 55,56.
Kortom, dit protocol beschrijft een in vitro model van de BBB basis van impedantie spectroscopie. Gericht op de interactie van primaire muizenhersenen endotheelcellen met geactiveerde T-cellen, de methode maakt het bestuderen van de barrière-eigenschappen tijdens dergelijke direct contact. Dit is van bijzonder belang voor het begrijpen van de cruciale stappen in de ontwikkeling van inflammatoire CNS-ziekten zoals multiple sclerose en EAE diermodel, waarbij de BBB wordt aangetast tijdens een interactie van EC met encefalitogene T-cellen. De beschreven test maakt het onderzoek naar de gevolgen van een gerichte modulatie van dergelijke interactie met uiteenlopende stoffen zoals blokkerende antilichamen, cytokinen en inhibitoren van T-celactivering. De werkwijze is gevoelig, betrouwbare en niet-invasieve and metingen van TEER en Ccl worden uitgevoerd op een geautomatiseerde manier. Dit alles maakt het een nuttig en veelzijdig instrument dat een nieuwe laag toevoegt aan de rijke inhoud van BBB modellen. Het kan bijzonder onze kennis BBB eigenschappen onder pathofysiologische omstandigheden waargenomen bij auto-immuunziekten zoals MS breiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Annika Engbers en Frank Kurth voor hun uitstekende technische ondersteuning en Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) voor nuttige discussies over TEER metingen. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 project A03 HW en LK, CRC TR128, projecteert A08; Z1 en B01 LK en HW, en het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (Medische Faculteit van Münster) subsidie nummer KL2 / 2015/14 naar LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
References
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
