Introduction
A barreira sangue-cérebro separa a circulação sistémica a partir do sistema nervoso central (SNC) 1-3. Ele fornece uma barreira física que inibe a livre circulação das células e à difusão de moléculas solúveis em água e protege o cérebro de agentes patogênicos e substâncias potencialmente nocivas. Para além da sua função de barreira, o BBB permite o fornecimento de oxigénio e nutrientes para o parênquima cerebral, o que assegura o bom funcionamento do tecido neuronal. As propriedades funcionais da certificação são altamente regulados pelos seus componentes celulares e acelulares, com ECs altamente especializada sendo o seu principal elemento estrutural. CEs da certificação são caracterizados pela presença de junção estanque (TJ) complexos, falta de fenestrações, extremamente baixa actividade pinocytic, e mecanismos de transporte permanentemente activas. Outros componentes da certificação da membrana basal CE, pericitos incorporação do endotélio, pés terminais astrocíticos e = par associadomembrana basal enchymal também contribuir para o desenvolvimento, manutenção e função da BHE 2,4 - 6 e, em conjunto com os neurónios e microglia, formam a unidade neurovascular (NVU), que permite o bom funcionamento do SNC 7-9.
Numa variedade de doenças neurológicas, tais como neurodegenerativas, doenças inflamatórias ou infecciosas, a função da BHE está comprometida 2,5,10. A desregulação de TJ e complexos mecanismos de transporte moleculares leva ao aumento da permeabilidade a certificação, o extravasamento de leucócitos, a inflamação e dano neuronal. A fim de estudar as propriedades de BBB sob tais condições fisiopatológicas, vários modelos in vitro da BBB foram estabelecidas 9,11,12. Juntos, eles têm fornecido informações valiosas sobre as mudanças da integridade da barreira, a permeabilidade, bem como mecanismos de transporte. Estes modelos utilizam células endoteliais de origem humana, de ratinho, rato, porcino ou bovina 13-18; células endoteliais primárias ou linhas celulares são cultivadas quer como uma monocultura ou em conjunto com os pericitos e / ou astrócitos para imitar mais de perto a certificação in vivo 19-25. Nos últimos anos, a medição da resistência eléctrica transendotelial (TEER) tornou-se uma ferramenta amplamente aceito para avaliar as propriedades de barreira endotelial 26,27.
TEER reflecte a impedância ao fluxo de iões através da monocamada de células e a sua redução proporciona uma medida sensível da integridade da barreira endotelial comprometida e, por conseguinte, aumento da permeabilidade. Vários sistemas de medição TEER têm sido desenvolvidos, incluindo epitelial Voltohmmeter (Evom), Cell-substrato Eléctrica Impedância de detecção (ECIS), e análise de células em tempo real 15,28 - 30. TEER reflecte a resistência ao fluxo de iões entre CEs adjacentes (via paracelular) e é directamente proporcional àa integridade da barreira. Em espectroscopia de impedância 27,31, impedância total complexo de (Z) é medida, que fornece informações adicionais sobre a integridade da barreira medindo Ccl. Ccl relaciona-se com a corrente capacitiva através da membrana celular (via transcelular): a camada de células actua como um condensador no circuito eléctrico equivalente, que separa as cargas em ambos os lados da membrana e é inversamente proporcional à integridade da barreira. Quando cultivadas em inserções permeáveis, ECs aderir, proliferar e espalhar sobre a membrana microporosa. Isto resiste a corrente capacitiva fundo da inserção (que por sua vez actua como um condensador) e leva a uma diminuição na capacitância até que atinge o seu nível mínimo. Isso é seguido pelo estabelecimento de TJ complexos que vedar o espaço entre as células endoteliais adjacentes. Isso restringe o fluxo de iões através da via paracelular, e TEER aumenta até atingir o planalto. Sob condições inflamatórias, no entanto, o endotheliai barreira está comprometida: TEER diminui à medida que TJ complexos são interrompidos e Ccl aumenta à medida que o componente capacitivo da inserção sobe novamente.
Nossa medição TEER usa o sistema automatizado de monitorização das células 32: segue-se o princípio da espectroscopia de impedância e estende suas aplicações anteriores. Aqui, nós descrevemos um modelo in vitro a certificação que permite o estudo das propriedades de barreira, incluindo a interacção de endotélio cerebral com células do sistema imune; em particular células T activadas. Tais condições fisiopatológicas são observadas em doenças auto-imunes do sistema nervoso central, tais como a esclerose múltipla e o seu modelo animal experimental de encefalomielite auto-imune 33-37. Aqui, um passo crucial é a transmigração de células T encefalitogénicas, específicos de mielina em todo o BBB. Isto é seguido pela sua reactivação no espaço perivascular e entrada dentro do parênquima do cérebro, onde se recrutar outras células do sistema imunológico e meinflamação diate e subsequente desmielinização 1,35,38. No entanto, os mecanismos moleculares da interacção entre estas células T e as células endoteliais, os principais constituintes da BBB, não são bem compreendidos. Nosso protocolo visa preencher esta lacuna e dar novos insights sobre as consequências sobre as células endoteliais (ou seja, a integridade da barreira e permeabilidade) mediante o seu contacto directo e complexa interação com as células T ativadas.
O protocolo aqui descrito faz uso de células endoteliais microvasculares cerebrais de rato primária, cultivadas como uma monocamada em inserções permeáveis com membranas microporosas. As células endoteliais são co-cultivadas com células T CD4 +, que podem ser pré-activados quer policlonal ou de um modo específico do antigénio. Co-cultura de células T com MBMECs pré-activado, mas não ingénuos induz uma diminuição da TEER e um aumento em CCL, a qual fornece uma medida quantitativa da disfunção e barreira perturbação MBMEC. a técnicaé não-invasivo: ele usa built-in em vez de eletrodos pauzinho, que impedem a grande perturbação da monocamada CE; ele pode ser utilizado para monitorizar a função de barreira, sem a utilização de marcadores de células. Faz medições contínuas em uma forma automatizada e permite uma avaliação independente dos dois parâmetros de barreira (TEER e CCL), simultaneamente, ao longo do tempo. O método também é suficientemente sensível para distinguir entre diferentes níveis de activação de células T e os efeitos de tais células T na ECS.
Ele pode ser usado numa grande variedade de ensaios funcionais diferentes: as citocinas e / ou quimiocinas implicados em processos inflamatórios podem ser adicionadas à co-cultura de células T e MBMECs; anticorpos bloqueadores contra moléculas de adesão celular em ambos o lado CE ou de células T pode ser utilizado; e inibidores de marcadores de activação das células T ou de suas propriedades citolíticas pode ser adicionado durante a iniciação de células T ou a sua co-cultura com células endoteliais. O ensaio é também útil para a transmigração de células Tensaios, uma vez que pode servir como um controlo da integridade monocamada MBMEC antes da adição de células T qualidade. Tudo isto torna este método uma ferramenta versátil e fiável para estudar a certificação in vitro, com um foco no efeito de células T activadas na integridade monocamada CE. Isto é de particular importância para a compreensão dos mecanismos de certificação da interrupção na patogénese de doenças auto-imunes, como a esclerose múltipla e o seu modelo animal de EAE, em que, as células T auto-reactivas encefalitogénicas atravessar a BHE e causar inflamação e dano neuronal.
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Protocol
Para todas as experiências, os ratinhos foram criados e mantidos sob condições específicas isentas de agentes patogénicos em instalações para animais Central da Universidade de Munster, de acordo com as directrizes alemães para cuidados animais. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações do comitê de animais ética experimental e aprovado pelas autoridades locais de North Rhine-Westphalia, Alemanha (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).
1. MBMEC Isolamento e Cultura
NOTA: Isolar MBMECs como previamente descrito em detalhe 14 com as seguintes modificações:
- Sacrificar 20 adultos C57BL 6 ratos / (6-8 semanas de idade) por inalação de CO 2 e confirmar a sua morte por determinação parada cardíaca e respiratória.
- Lavar o rato com 70% de etanol e decapitá-lo com uma tesoura; remover o couro cabeludo usando uma pinça e tesouras. Fazer incisões no lado esquerdo e direito do crânio, a partir do forame magno. Levante o crânio do seu lado caudal e takde e para fora do cérebro com uma pinça.
- Dentro de uma câmara de fluxo laminar, utilizar uma pinça estéril para colocar o cérebro em uma placa de Petri e remover o tronco cerebral, cerebelo e tálamo, mantendo apenas o córtex.
NOTA: O uso de um microscópio não é necessária para qualquer um destes passos. - Coloque o córtex sobre um pedaço de papel Western blot estéril e enrolá-lo suavemente com uma pinça até meninges não são mais visíveis.
- Após a digestão enzimática e mecânica (seguindo o protocolo 14), recolher as células endoteliais a partir do gradiente de densidade usando, uma agulha estéril de comprimento e um êmbolo 5 ml. As células endoteliais aparecer como uma camada escura acima do anel vermelho com eritrócitos. Transferência de 20-25 ml desta camada para um novo tubo de 50 ml de centrifugação; encher o tubo com DMEM.
- Após dois ciclos de lavagem 14, ressuspender as células em 6 ml de meio contendo puromicina MBMEC (4 ug / ml) e semear-los para seis cavidades de uma placa de 24 poços; deixá-los em um tecidoincubador de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 (referido como 'incubadora' daqui em diante) durante três dias.
NOTA: Para mais informações sobre solução de revestimento MBMEC, consulte a Tabela de Materiais. - Alterar a forma através da adição de 1 ml a cada poço de meio fresco sem MBMEC puromicina; colocar a placa de volta a 37 ° C e 5% de CO 2 durante mais dois dias.
2. A colheita MBMECs
- No dia cinco após isolamento MBMEC, pré-revestimento com inserções permeáveis MBMEC solução de revestimento de: adicionar 80 ul de solução por pastilha e deixá-los a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 h.
- Cuidadosamente pipeta a solução de revestimento e deixar o inserções de ar seco durante 30 minutos. Adicionar 2 ml de temperatura ambiente (TA) de PBS a cada poço da placa, utilizando MBMECs para lavar a forma; repita este passo. Adicionar 0,05% de tripsina-EDTA (300 uL por poço) e deixar a placa na incubadora durante 5-10 min.
- Adicionar 2 ml de meio MBMEC a cada poço para parartripsinização. Transferir as células recolhidas para um tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a 700 xg los durante 8 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio MBMEC sem puromicina.
- Contar as células; misturar 10 ul de suspensão celular com 90 ul de 0,04% de Azul de Tripano (10X de diluição de células). Pipetar 10 ul desta mistura entre a cobertura de vidro e a câmara de contagem de células (hemocitômetro). Contagem de células tripano azul-livre em todos os quatro quadrantes da câmara (N) e determinar o número médio de células contadas (N ') como se segue: N' = N / 4.
- Calcula-se a concentração celular (em 10 6 células / ml), utilizando a seguinte fórmula: C = N 'x 10 4 x 10, em que 10 4 é dada pelas dimensões do hemocitómetro e 10 é o factor de diluição do passo 2.4.
- Semente de 2 x 10 4 células num volume de 260 ul por pastilha. Adicionar 810 ul de meio MBMEC para o compartimento inferior de cada poço. Coloque a placa com inserções na incubadora até que esteja pronto para prosseguir com o ponto 4.
NOTA: Os volumes para o compartimento superior e inferior são de inserção específica e não funcionam para todos os formatos de 24 poços.
3. CD4 + T e isolamento das células Estimulação
- T CD4 + de isolamento de células
- Sacrificar um rato adulto (6-8 semanas de idade) por inalação de CO 2 e confirmar a sua morte por determinação parada cardíaca e respiratória.
- Posicione o mouse sobre as suas costas em uma placa de dissecação limpa e lave-o com 70% de etanol; usar tesouras e pinças esterilizadas para abrir o peritônio e remover os baço e linfonodos (inguinal, axilar, braquial e cervical); Finalmente, a transferência do tecido para um tubo de centrifugação de 15 ml contendo 5 ml de PBS em gelo.
- Sob a câmara de fluxo laminar, transferir o tecido por decantação PBS com o tecido em um tubo de centrifugação de 50 ml com um filtro celular de 70 uM no topo; homogeneizaro tecido, pressionando-o com um êmbolo de 1 ml através do filtro.
- Adicionar 30 ml de tampão de SCAF e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de tampão de FACS. Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 40 mm, adicionar mais 20 mL de tampão de FACS para o tubo.
- Centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS.
- Adicionar 20 ul de rato CD4 microesferas magnéticas, misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C. Adicionar 25 ml de tampão de SCAF e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Enquanto isso, coloque uma coluna de separação LS para o ímã e lave-o com 3 ml de tampão FACS. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de tampão de FACS.
- Adicionar células para a coluna. Lavar a coluna com 3 ml de tampão de SCAF três vezes. Remova a coluna do ímã e colocá-lo em um novo 15 ml centritubo fugation. Adicionar 5 ml de tampão de FACS, lavar as células marcadas com o êmbolo coluna e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de meio de células T. Contar as células tal como descrito em 2.4 e sementes de 1 x 10 5 células em 100 ul de meio por poço.
- Estimulação de células CD4 + T
- A estimulação das células T CD4 + policlonal
- Pré-revestimento de uma placa de 96 poços de fundo redondo com anticorpo purificado anti-rato CD3 (clone 145-2C11) em PBS, a uma concentração final desejada. Por exemplo, para pré-revestir a placa completamente com α-CD3 a 1 ug / mL, misturar 10 mL do anticorpo (concentração estoque = 0,5 mg / ml) com 5 ml de PBS, vortex e adicionar 50 uL da mistura para cada poço com uma pipeta multicanal.
- Deixar a placa na incubadora durante 3 h. Depois de isolar as células T, lavar a placa pré-revestido duas vezes com PBS. Adicionar anticorpos anti-CD28 purificada (clone37,51) para as células T isoladas a uma concentração final desejado (por exemplo, a 1 ug / ml); misture bem. Semear as células T e deixá-los na incubadora por dois a três dias.
- Estimulação de células específicas de antigénio de células T CD4 + com células dendríticas (DC)
NOTA: Se DCs são usadas como células apresentadoras de antigénio (APCs), seguir o protocolo para o isolamento de células T, com as seguintes excepções:- Antes de se homogeneizar o baço, injectá-la com 1 ml de colagenase de tipo IA em PBS a 0,5 mg / ml e transferi-lo para um tubo de centrifugação de 15 ml.
- Incubar em banho-maria a 37 ° C durante 15 min. Após lavagem com PBS, ressuspender o sedimento em tampão de FACS e adicionar 20 ul de rato CD11c microesferas magnéticas, em vez de microesferas de CD4.
- Usar uma coluna de separação de MS e os volumes apropriados: lavar a coluna com 1 ml de tampão de SCAF; Ressuspender as células em 1 ml de tampão de SCAF e lava-se a coluna com 1 ml de tampão de SCAF três vezes.
- de Anúnciosd antigénio de escolha para DC (por exemplo, glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) AA 35-55 a 20 ug / ml), misturar bem e semente 5 x 10 4 células em 100 ul de meio de cultura de células T por 96-round-bottom bem.
- Adicionar 1 x 10 5 células T em 100 ul de meio de cultura de células T por 96 de fundo redondo de cavidades, com o fim, tal como descrito no protocolo para o isolamento de células T.
- A estimulação das células T CD4 + específicas para o antigénio com as células B
NOTA: Se as células B são usados como APCs, seguir o protocolo para o isolamento de células T, com as seguintes exceções:- Use baços de ratinhos transgénicos, cujas células B são específicas do antigénio (por exemplo, ratinhos, IgH MOG (Th), cujas células B reconhecem especificamente MOG 35-55).
- Utilização de células T específicas do antigénio (por exemplo, a partir de TCR MOG (2D2) ratinhos). Adicionar 20 l de rato CD19 microesferas magnéticas em vez de microesferas de CD4.
- Adicionar o antigénio de escolha para o cel BLS (por exemplo, MOG 35-55 em 20 ug / ml), misturar bem e semente de 5 x 10 4 células em 100 ul de meio de cultura de células B por 96 de fundo redondo de poços.
- Adicionar 1 x 10 5 células T em 100 ul de meio de cultura de células T por 96 de fundo redondo de poços, como descrito no protocolo para o isolamento de células T.
- A estimulação das células T CD4 + policlonal
4. Configuração e Execução de Medição TEER
- Colocar o módulo de 24 poços do instrumento TEER sob a câmara de fluxo laminar. Retire as tampas e inserções lugar com MBMECs no instrumento usando uma pinça.
- Pipetar 810 l de meio fresco para o compartimento inferior das cavidades do módulo: adicioná-lo cuidadosamente entre a pastilha e a parede do módulo bem.
- Fechar as tampas e coloque o instrumento na incubadora. Conecte o instrumento ao seu computador; ligar o controlador de instrumento e abrir o software.
- Selecione "nova medição" na janela pop-up. Check 'show TEER "e caixas de' show Ccl '; em seguida, pressione 'start'. Depois de completar a primeira medição, selecione 'check todos os poços' no separador 'Resultados' para ver todos os valores TEER e Ccl.
- Salve o arquivo: Arquivo> Salvar como> 'o nome do seu arquivo'.
NOTA: Como TEER e Ccl são continuamente medido de forma automatizada, monitorar seus valores durante um período de três a cinco dias. Mudando a forma não é necessário, a menos que a viabilidade celular é sub-óptima, como visualizado por uma ausência de aumento na TEER. - Escolha o ponto de tempo para co-cultura MBMECs com células T quando Ccl é estável e inferior a 1 uF / cm 2 e TEER atingiu o seu nível máximo.
- inspecione cuidadosamente valores absolutos TEER e Ccl e excluir os poços nos quais MBMECs não desenvolveram monocamadas confluentes suficientes desmarcando tais poços.
- Grupo do resto dos poços: clique com o botão direito sobre um bem e selecionar "adicionar bem ao novo poço média". Namenviar um e-lo na janela pop-up; fazer o mesmo para todos os poços individuais a serem agrupados.
- Verificar todos os poços médios para confirmar que todos eles têm as mesmas condições iniciais antes da co-cultura. Se alguns têm significativamente diferentes valores absolutos TEER ou TEER encostas, ou os erros padrão são muito grandes, refazer o agrupamento.
NOTA: O agrupamento ideal de poços fornece uma variação mínima em valores TEER, dentro e entre os grupos experimentais. - Na aba "experimento", pressione "pausa", desligue o instrumento e levá-la para fora da incubadora. Retirar as tampas sob a câmara de fluxo laminar.
- Prepare pré-ativado e / ou células T naive, com ou sem citocinas específicas, anticorpos ou outras substâncias, como desejado: Por exemplo: Mistura purificado rato NA / LE anticorpo anti-rato IFN-γ (XGM1.2 clone) com T preparado as células, a 20 ug / ml por poço do instrumento TEER.
NOTA: Se as substâncias, tais como inibidor de granzima B são usados, eles são umdded à cultura de células T no início da estimulação das células T: por exemplo, granzima B Inhibitor II (Calbiochem) é misturado com as células T isoladas a uma concentração final de 10 uM em DMSO. Ver Materiais e Equipamentos para mais detalhes. - Remover parte do meio da inserção (o compartimento bem superior): por exemplo, cuidadosamente pipeta 150 uL (removendo toda a forma deve ser evitado, uma vez que poderiam perturbar a monocamada MBMEC).
- Adicionar células T para MBMECs pipetando cuidadosamente 150 ul de meio contendo 2 x 10 5 células / inserção.
NOTA: Quando a colheita de células T pré-ativado, contar apenas explodir, células Trypan Blue-livres. - Fechar as tampas e coloque o instrumento de volta para a incubadora. Volte a ligar o instrumento e pressione 'medição currículo'. Depois de 24 horas, pressione 'stop' no separador 'experimento' e salve o arquivo (Arquivo> Salvar).
5. Data Export e Análise Estatística
- Exportar os resultados escolhendo Arquivo> Exportar.
- Na guia "Configurações" da janela pop-up, selecione ".dot" na opção "separador decimal" e "tabulator" na opção "delimitador de campo".
- Na aba "resultados de exportação", o nome do arquivo, verifique todos os poços a serem exportados, e marque a opção "TEER" e caixas "Ccl" na "escolha de dados" opção.
- Pressione "exportar dados," abrir o arquivo exportado, e copiar os dados para uma planilha.
- Normalizar os dados exportados (classificado por cada repetição, com valores TEER e Ccl dadas para cada execução (medição)): valores Set TEER e Ccl do último ponto de tempo antes que a co-cultura para 100% e mudar de acordo com os valores para todos os outros runs, em relação ao run '100%'.
- Copiar os dados normalizados para um software de escolha para gerar um gráfico, usando poços individuais e exibindo o erro padrão da média para cada grupo de tratamento.
- Perform dois sentidos teste estatístico ANOVA com correção de Bonferroni para comparações múltiplas, utilizando o software estatístico de escolha.
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Representative Results
A Figura 1 fornece uma visão geral do modelo de certificação in vitro utilizado para estudar a interação entre células T e células endoteliais. O experimento consiste em três etapas principais. O primeiro passo é o isolamento de MBMECs primárias a partir de córtices cerebrais, e a sua cultura durante cinco dias. Quando atingem confluência na placa de cultura celular, MBMECs são tripsinizadas e re-semeadas em inserções permeáveis, os quais são, então, colocados no instrumento TEER. O TEER e Ccl de MBMECs são continuamente medidos e monitorados durante um período de três a cinco dias. No entanto, as células T são isoladas, estimuladas (passo 2), e cultivadas durante dois a cinco dias, tipo e força do estímulo. No passo 3, as células T são adicionados e co-cultivadas com MBMECs Ccl quando está a um nível baixo e estável a TEER está no seu nível máximo. A escolha deste ponto de tempo para a co-cultura, quando o TEER ainda está no seu patamar é crucial para o sucessode toda a medição. Assim, é extremamente importante que o ponto de tempo para o isolamento de células T e estimulação é cuidadosamente escolhido, de modo que as células T atingir o nível desejado de activação pelo momento da sua adição ao CEs. Após a adição de células T, a medição é retomado por mais um dia e os resultados são analisados.
Após a cultura inicial de cinco dias, MBMECs mostram prontamente morfologia característica em forma de fuso (Figura 2A, painel da esquerda) e expressar marcadores específicos para células endoteliais, tais como (painéis da direita Figura 2A, e meio) PECAM-1 e Claudina-5. No entanto, isso por si só não fornece provas suficientes da sua confluência completa e integridade da barreira adequada. Espectroscopia de impedância, por outro lado, proporciona uma boa estimativa da integridade monocamada e serve como um controlo de qualidade de cada poço antes da realização de um ensaio funcional. Na Figura 2B, a maior parte dopoços continha MBMECs cujos valores IAC foram estável e de baixo, e seus valores TEER atingido um patamar. Estes poços foram utilizados para experiências de co-cultura subsequente. Eles foram agrupados de tal forma que a variação dentro e entre os grupos foi mínima antes da adição de células T (Figura 2C). Os poços cujos valores TEER diferiu significativamente do resto (por exemplo, a curva azul indicado na Figura 2B) não foram usados, uma vez que iria conduzir a resultados ambíguos ou má interpretação dos dados.
Desde que foram cumpridos os requisitos iniciais para a cultura MBMEC e estimulação das células T, espectroscopia de impedância pode dar informações valiosas sobre a interação de células T-CE. TEER medição pode servir como a leitura primária para este tipo de interacção e uma medida da disfunção CE mediada por células T, tal como mostrado na Figura 3A e 3B. Neste caso, MBMECs são cultivadas em insertos de 0,4 com microporosum de diâmetro, que não permite que as células T a passar através da membrana de inserção. A Figura 3A mostra que apenas estimulada, mas não células T naive são capazes de induzir disfunção CE, tal como determinado por uma diminuição da TEER e aumento Ccl. células naive T pode, assim, servir como um controlo negativo, uma vez que TEER e Ccl durante a co-cultura com células T naive permanecer nos seus níveis iniciais. A excepção é o pico no início da co-cultura, causada pela manipulação do instrumento (levantando as tampas, a adição de meio novo com células que podem ter um pouco diferentes temperaturas e valores de pH, e fechar as tampas). Este artefato aparece com todos os tipos de medições TEER e é ignorado durante a análise. A adição de citoquinas pró-inflamatórias IFN-y e TNF-a (em 100-500 U / ml), que são conhecidos como sendo capazes de induzir a inflamação CE, pode ser usado como controlo positivo. Na Figura 3A, MOG 35-55 CD4 espec�ico
A fim de investigar os mecanismos da perturbação monocamada MBMEC descrito, pode ser utilizado várias abordagens. Os resultados na Figura 3C mostram que as células T estimuladas, mas não os seus sobrenadantes causou um dano substancial às MBMECs, indicando que o contato direto entre as células T e MBMECs é fundamental para a ruptura da barreira. Além disso, a adição de uma neutralização α-Ianticorpo FN-γ durante a medição TEER apenas ligeiramente melhoradas propriedades de barreira MBMEC, sugerindo que o IFN-γ pode não ser a causa primária desta perturbação. Por outro lado, a adição de granzima B Inhibitor II para cultura de células T (Figura 3D) restaurada a integridade MBMEC em maior medida, apontando para esta molécula citolítica como um jogador importante em causar danos MBMEC e subsequente diminuição TEER.
Para além da sua utilização como uma leitura para o efeito primário das células T sobre a integridade monocamada CE, TEER medição também pode ser utilizado como um controlo de integridade da barreira antes de outros ensaios, tais como o ensaio de transmigração de células T qualidade. Neste caso, são utilizadas pastilhas com microporos de 3 um de diâmetro. Na Figura 3E, a medição TEER foi realizada a fim de assegurar que a monocamada foi MBMEC do mesmo nível de integridade em todos os poços antes da adição de células T para a subsequente transmigratioEnsaio n. Isto foi seguido pela colheita das células T a partir do compartimento inferior das cavidades do instrumento, coloração de células T com anticorpo α-CD4 e análise citométrica de fluxo, utilizando esferas de contagem de células para determinar os números absolutos de células T transmigrou; mostrada na Figura 3E, meio e direita). Note-se que as células T estimuladas utilizados para transmigração não causou uma diminuição substancial na TEER, apesar de terem sido pré-activado tal como na Figura 3A. Isto pode reflectir a via transcelular células imunes pode usar durante a transmigração, como foi observado anteriormente 39. Na Figura 3F, metade dos poços com MBMECs estavam inflamados com IFN-γ e TNF-α (não inflamadas vs. Inflamada), e mais tarde, as células T naive foram adicionados para avaliação da actividade transmigratória. Neste caso, a medição TEER forneceu uma pista sobre o quão forte é a inflamação com citocinas foi e quando as células T deve ser adicionado para o transmigration.
A Figura 4 mostra algumas das situações mais comuns que podem levar a erros de interpretação dos resultados TEER. Na figura 4A, por exemplo, nem todos os MBMECs desenvolveu uma monocamada confluente totalmente ao mesmo tempo. Um dos grupos (das células T naive - excluídos ") continham MBMECs cujos complexos TJ foram amadurecendo a um ritmo diferente em comparação com os outros grupos pouco antes da adição de células T. Este grupo desenvolveu consequentemente valores TEER acima de 100% durante a experiência e foi excluído de análises posteriores. Assim, a inclinação da curva de TEER (taxa de maturação TJ) antes da experiência é tão importante como valores absolutos de TEER interpretação de dados adequada. A Figura 4B mostra que, a partir da co-cultura não só muito cedo, mas também demasiado tarde pode levar a resultados falsos. Aqui, tanto no grupo com as células T estimuladas e o grupo de controlo negativo (meio de Change), os valores de TEER já passaram seu planalto e começou a diminuir, independentemente, a partir da condição experimental, indicando, portanto, as condições de cultura sub-óptimas, antes e durante a experiência. Tais grupos não devem ser incluídos na análise. Finalmente, embora TEER e Ccl geralmente mudar os seus valores de tal modo que uma maior diminuição da TEER é acompanhada por um aumento maior na Ccl, isto pode não ser sempre o caso. Na Figura 4C, estimulou as células T B causou uma diminuição maior na TEER, mas um menor aumento Ccl do que as células T estimuladas um DID.
Figura 1: Visão geral da técnica. Após a cultura inicial, MBMECs são re-semeadas em inserções permeáveis e colocado no monitor de células automatizado; TEER e Ccl são medidos a cada hora por 4-5 dias. No entanto, as células T são activadas in vitro 40. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: MBMECs desenvolver uma monocamada confluente adequado para um modelo in vitro a certificação. (A) do eixo em forma de morfologia (à esquerda) e coloração de imunofluorescência de PECAM-1 (meio) e Claudina-5 (direita) cinco dias após o isolamento MBMEC. Depois (C) agrupamento de poços individuais (B e C) valores TEER e Ccl antes (B) e, antes tO adição de células T. A curva em azul (B) não é usado para a experiência, uma vez que neste MBMECs muito bem não ter desenvolvido TEER tão elevado como nos outros poços. Dados em (C) mostram significa ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os resultados representativos. (AD) Mudanças na TEER como uma medida primária de disfunção MBMEC na interação com as células T. Células T específicas de MOG (A) foram activados por células B específicas do MOG na presença de MOG 35-55 péptido durante cinco dias. células T naive e citoquinas pró-inflamatórias IFN-y e TNF-a (ambos a 100 U / ml) serviu como controlo negativo e positivo, respectivamente. (B) As células T foram estimuladas com anticorpos α-CD28 (1 ug / ml cada) durante dois ou três dias, como indicado α-CD3 e, antes de os adicionar ao MBMECs. Células (C) t (pré-activados como em (A)) ou os seus sobrenadantes, na presença de anticorpo α-IFN-γ ou o controlo de isotipo correspondente. Células (D) t (pré-activados tal como em (B)) durante dois dias, na presença do inibidor de granzima B II ou seu diluente DMSO. (E e F) TEER medição usado apenas como um controlo de qualidade para a integridade da barreira antes de transmigração de células-T. MBMECs foram cultivados em inserções com poros de 3 um de diâmetro. Células (E) de T, estimuladas como descrito em (A), foram deixados a transmigrar para 18 horas (à esquerda). Em seguida, eles foram colhidas, coradas para α-CD4 anticorpo (clone RM4-4) e analisadas por citometria de fluxo, utilizando esferas de contagem de células (meio e direita). (F)Monitorização da integridade da monocamada MBMEC após estimulação com IFN-γ e TNF-α, e escolhendo o ponto de tempo apropriado para a adição subsequente de células T para o ensaio de transmigração. (AF) Os resultados mostram técnicas triplicados e são representativos de três experiências independentes, cada. Os dados mostram significa ± SEM. (E, à direita) Unpaired, bicaudal teste t de Student. **, P <0,01. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: considerações práticas e interpretação dos dados. (A) MBMECs de um grupo experimental (curva a vermelho) foram excluídos da análise, uma vez que a velocidade de maturação dos seus complexos juncionais foi diferente em comparação com outro groups. (B) Um exemplo de adição de células T tarde demais, o que impediu uma avaliação correcta da disfunção MBMEC. (C) Após a interrupção por 'A' células T estimuladas (curva preto), valores de Ccl MBMECs mostrou um aumento mais dramático do que seria esperado a partir da diminuição concomitante na TEER causada pelas mesmas células T. Células (AC) T foram estimuladas com α-CD3 e anticorpos α-CD28 (1 ug / ml cada) durante dois dias. Os resultados mostram técnicas triplicados e são representativos de três experiências independentes, cada. Os dados mostram significa ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Vários passos do protocolo descrito são essenciais para uma experiência de sucesso. Durante o isolamento e cultura MBMEC inicial, é crucial que o trabalho é executado sob condições estéreis, tanto quanto possível, para evitar a contaminação da cultura de células com esporos de fungos ou bactérias. A fim de se obter uma cultura pura de células endoteliais, é recomendado o uso de um meio contendo puromicina para os três primeiros dias, o que permite que a sobrevivência das células endoteliais, mas não outros tipos de células (especialmente pericitos) 41,42. Outro passo importante que merece atenção especial é a identificação do ponto de tempo correto para a adição de células T pré-ativado. Durante as primeiras 48 horas de MBMECs medição TEER proliferam em inserções permeáveis e fechar as lacunas entre si. Assim, a CCL diminui até atingir um nível estável e de baixo (cerca de 0,6 uF / cm 2). Este é o primeiro sinal de uma monocamada confluente CE, mas ainda não é um sinal de uma barreira apertada. Só depoisCCL tenha atingido um nível estável faz a TEER começar a aumentar. Quando complexos TJ estão totalmente formados ea barreira CE é completamente vedada, TEER atinge o seu nível máximo. Este patamar é geralmente alcançado três a cinco dias após o reseeding CEs e é mantida por mais 24 a 36 h. O melhor ponto de tempo para a adição das células T está no início do planalto, o que garante que a ECs ainda são viáveis suficiente para ser co-cultivadas com as células T. À medida que a activação de células T tem de ser iniciada antes do ponto de tempo óptimo para a co-cultura pode ser prevista com segurança, que pode ser vantajoso para estimular a dois lotes de células T em dois dias diferentes, a fim de aumentar a flexibilidade deste tempo. Finalmente, o agrupamento dos poços replicados antes da adição de células T para as MBMECs precisa de ser feito de tal maneira que a variabilidade dentro e entre os grupos é mínima. Isto assegura que as condições iniciais são iguais em todos os grupos durante a co-cultura de células T e MBMECs. Nosso protocolo descreve medição TEER durante a co-cultura de cérebro de rato primária ECs com células T CD4 + pré-activado. A sua forma simples permite múltiplas modificações, de acordo com as necessidades científicas. Por exemplo, o tipo, intensidade e duração do estímulo pode ser variada. As células T CD4 + específicas para o antigénio pode ser activado pelo seu antigénio cognato, na presença de células apresentadoras de antigénio (APCs) apropriados; Alternativamente, as células T podem ser activadas por anticorpos policlonal α α-CD28-CD3 e. O estado de activação das células T pode ser modulada por diversas citoquinas, anticorpos bloqueadores, inibidores. Substituindo ECs cerebrais primários com linhas celulares endoteliais não é recomendado, no entanto, uma vez que é sabido que estes últimos apresentam menos restritivas complexos de TJ e maior permeabilidade em comparação com as células primárias 43. Além de medir TEER como leitura primária, este protocolo proporciona um bom controle da monolay CE qualidadeintegridade er antes do ensaio de transmigração de células T (Figura 3E, F). De nota, valores TEER pode não necessariamente diminuir durante a transmigração das células T através dos MBMECs (Figura 3E): isto pode reflectir a via transcelular células imunes pode usar durante a transmigração, como foi observado anteriormente 39,44.
Como células T activadas induzir disfunção CE durante a co-cultura, mostra TEER, uma redução previsível constante, entre experiências comparáveis com as mesmas condições. A maior diminuição da TEER é normalmente acompanhada por um maior aumento concomitante Ccl. Em raras ocasiões, no entanto, um aumento na Ccl pode ser mais pronunciada do que seria esperado a partir da diminuição correspondente na TEER (Figura 4C). Esta discrepância pode refletir diferentes aspectos da interrupção monocamada CE. Como ECs tentar fechar as lacunas formadas durante a ruptura da barreira, eles podem sofrer alterações dinâmicas emmorfologia e motilidade, tais como formação de saliências e aumentando a sua área de superfície total, todos os quais podem contribuir para um aumento dramático e rápido na Ccl. Isso faz com que mudanças na Ccl menos previsível, em relação a mudanças na TEER. Assim, o nível de diminuição da TEER continua a ser a medida mais fiável e representativo da integridade da barreira comprometida.
Este ensaio pode ser complementado por outras técnicas para investigar as propriedades de barreira endoteliais. Pode ser seguida por um ensaio de permeabilidade, que mede a quantidade de moléculas de tamanhos diferentes que se difundem através da monocamada CE 44 interrompido. Para este efeito, os conjugados de dextrano marcados com fluorescência, tais como fluoresceína e vermelho do Texas pode ser utilizado; Outros marcadores moleculares estão também disponíveis (por exemplo, sacarose, manitol, albumina, Azul de Evans e peroxidase de rábano) 26. Além disso, a microscopia de imunofluorescência pode ser utilizada para investigar as alterações na expressão de proteínase a localização celular de moléculas de adesão celular e TJ. Embora o modelo apresentado certificação é muito simples, os resultados obtidos com ele pode proporcionar orientação útil para a continuação ensaios sob condições mais fisiológicas. Tais ensaios incluem (mas não estão limitados a) ensaio de fluxo in vitro de cisalhamento para complementar TEER medição obtida em condições estáticas e em ensaio de permeabilidade in vivo com Evans Blue em ratinhos injecção vivo para ter em conta a complexidade da BHE.
Embora sensível e confiável, o método descrito aqui tem certas limitações que merecem atenção especial. Os valores máximos TEER medidos em nossa configuração experimental atinge valores de 35-40 Ωcm 2. Estes valores TEER são muito mais baixos do que in vivo, onde diferentes tipos de células e componentes acelulares contribuir para a integridade da BHE, mas também não são tão elevados como TEER Os valores obtidos em algum outro modelos in vitro da BBB <sup> 26,45,46. Isto pode ser melhorado através da adição de hidrocortisona ao meio de CE, que tem sido mostrado para melhorar significativamente as propriedades de barreira 27,47 - 49. No entanto, o uso de tais substâncias - conhecido por ter efeitos anti-inflamatórios e imunossupressores - não é adequado para todos os ensaios funcionais. Como o foco deste protocolo particular é sobre as consequências das interações celulares CE-T sobre a integridade da barreira, a interpretação seria prejudicado pela adição de hidrocortisona. Usando o protocolo aqui apresentado, assim, possibilita a avaliação do verdadeiro potencial inflamatório de células T estimuladas para causar disfunção da barreira CE. Também é importante notar que a comparação directa de diferentes valores TEER relatados na literatura devem ser feitas com cautela. Tais valores são altamente dependente da configuração experimental, são obtidos com diferentes tipos de células, semeando densidades celulares, meios, áreas de crescimento celular, e sistemas de medição TEER (por exemplo, </ Em>, o design e tamanho dos eletrodos).
A fim de simular a situação in vivo mais de perto, complexo em modelos de BBB in vitro têm sido estabelecido, onde ECS são co-cultivadas com pericitos no lado oposto da membrana de inserção, ou onde pericitos e astrócitos são cultivadas no fundo dos poços 12,25,50 - 52. Em tais sistemas de co-cultura, cross-talk entre os diferentes tipos de células permite mais forte aperto da barreira, com triplos co-culturas de ser o melhor em assemelha-se a situação in vivo e, portanto, fornecer os mais altos valores TEER. A complexidade destes sistemas, por outro lado, constitui uma limitação à sua utilização mais vasta como em modelos in vitro BBB.
Uma outra limitação deste modelo é a falta de tensão de cisalhamento, o que foi mostrado para melhorar a integridade da barreira 53,54. Para superar este problema, os novos modelos de BBB dinâmicas foram recentemente introduzido: ECs são cultivadas em fibras ocas e submetidos a condições de fluxo pulsátil, imitando mais de perto microcirculação in vivo 55,56.
Em resumo, este protocolo descreve um modelo in vitro da certificação baseado em espectroscopia de impedância. Concentrando-se na interacção de células endoteliais do cérebro de rato primária com células T activadas, o método permite estudar as propriedades de barreira durante esse contacto directo. Isto é de particular importância para a compreensão dos passos cruciais no desenvolvimento de doenças inflamatórias do SNC, tais como a esclerose múltipla e o seu modelo animal de EAE, em que a certificação é comprometida durante uma interacção das células endoteliais com células T encef alitogénicas. O ensaio descrito permite a investigação das consequências de uma modulação específica de uma tal interacção, utilizando uma ampla variedade de substâncias tais como anticorpos bloqueadores, inibidores de citoquinas e de activação das células T. O método é sensível, fiável e um não-invasivamedições nd de TEER e Ccl são realizadas de forma automatizada. Tudo isso faz com que seja uma ferramenta útil e versátil, que acrescenta uma nova camada para o corpo rico de modelos BBB. Pode especificamente expandir nosso conhecimento sobre as propriedades de BBB em condições fisiopatológicas observadas em doenças auto-imunes como a esclerose múltipla.
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Acknowledgments
Somos gratos a Annika Engbers e Frank Kurth pelo seu excelente apoio técnico e Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) para discussões úteis sobre medições TEER. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projeto A03 para HW e LK, CRC TR128, projeta A08; Z1 e B01 para LK e número de concessão HW, e do Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (Faculdade de Medicina de Münster) KL2 / 2015/14 para LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts - pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
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