Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54673
Automatic Translation
*1, *2, *1, 1
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

الساعات الإيقاعية وظيفية في جميع الكائنات الحساسة للضوء، مما يسمح للتكيف مع العالم الخارجي عن طريق توقع التغيرات البيئية اليومية. وقد تم إحراز تقدم كبير في فهمنا للعلاقة الوثيقة بين الساعة الإيقاعية ومعظم جوانب علم وظائف الأعضاء في المجال على مدى العقد الماضي. ومع ذلك، كشف الأساس الجزيئي الذي يكمن وراء وظيفة مذبذب الساعة البيولوجية في الإنسان يبقى من أعلى تحديا تقنيا. هنا، ونحن نقدم وصفا مفصلا لنهج تجريبي لفترة طويلة الأجل (2-5 أيام) تسجيل تلألؤ بيولوجي وجمع تدفق المتوسطة في الخلايا الأولية البشرية المستزرعة. لهذا الغرض، قمنا transduced الخلايا الأولية مع مراسل وسيفيراز lentiviral التي هي تحت سيطرة أحد المروجين الجين الساعة الرئيسية، والذي يسمح لتقييم مواز من إفراز هرمون وتلألؤ بيولوجي الإيقاعية. وعلاوة على ذلك، نحن تصف الظروف لتعطيل الساعة اليومية في العلاقات العامةالخلايا البشرية imary التي transfecting سيرنا استهداف مدار الساعة. نتائجنا على تنظيم الساعة البيولوجية من إفراز الأنسولين من البنكرياس الجزر الإنسان، وإفراز myokine من قبل خلايا العضلات والهيكل العظمي الإنسان، وهي معروضة هنا لتوضيح تطبيق هذه المنهجية. ويمكن استخدام هذه الإعدادات لدراسة التركيب الجزيئي للساعات الطرفية البشرية وتحليل تأثيرها وظيفية في الخلايا الأولية في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية.

Introduction

برز نظام توقيت الساعة البيولوجية (من اللاتينية "حوالي عام اليومية") في جميع الكائنات الحساسة للضوء، وآلية التكيف مع دوران الأرض. في الثدييات، ويتم تنظيم ذلك بطريقة هرمية، ويشمل على مدار الساعة المركزية، والتي تقع في النواة التأقلم من منطقة ما تحت المهاد بطني، والطرفية (أو الرقيق) مؤشرات التذبذب التي هي عميلة في الأجهزة المختلفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الخلايا ذاتية الحكم مؤشرات التذبذب مكتفية ذاتيا وظيفية تقريبا في كل خلية من خلايا الجسم 1. تمثل إشارات ضوئي جديلة مزامنة المهيمنة (Zeitgeber) لالخلايا العصبية SCN، في حين أن الإشارات العصبية والخلطية المنبثقة عن اللجنة الدائمة للتغذية إعادة تعيين الساعات الطرفية. وبالإضافة إلى ذلك ايقاعات بقية النشاط، التي تدفع في دورات التغذية الصيام بدوره، هي المزيد من المزامنات لساعات الطرفية 2. وفقا لفهمنا الحالي، يستند ماكياج الجزيئي للساعة رئيسية على النسخي وtranslaالحلقات ردود الفعل tional، والتي يتم حفظها بين الكائنات الحية. هذا يضم منشطات النسخ BMAL1 وعلى مدار الساعة، التي تنشط معا النسخ للجينات الساعة الأساسية لكل وCRY السلبية. ومستويات عالية من PER والبروتينات CRY تمنع النسخ الخاصة بهم من خلال تثبيط مجمع / ساعة BMAL1. وتتكون حلقة المساعدة من المستقبلات النووية REV-ERBs وRORs، التي تنظم أيضا نسخ من BMAL1 وعلى مدار الساعة. وعلاوة على ذلك، والأحداث posttranslational بما في ذلك الفسفرة، sumoylation، أستلة، O-GlcNAcylation والتدهور والدخول النووي من البروتينات على مدار الساعة الأساسية تمثل طبقة تنظيمية هامة إضافية في إنشاء 24 ساعة التذبذب دورة 3.

ينبع الأدلة التراكمية من الدراسات التي أجريت في نماذج القوارض ويسلط الضوء على الدور الحاسم للنظام الساعة البيولوجية في تنسيق التمثيل الغذائي والغدد الصماء وظائف 4-5. وهناك عدد من تأالبريد نطاق التحليل Transcriptome على تشير إلى أن التغذية - الصيام دورات تلعب دورا مركزيا في تزامن مؤشرات التذبذب الطرفية 6-8. في اتفاق مع هذه الدراسات، وقد كشف تحليل metabolomic وlipidomic في القوارض والبشر أن عددا كبيرا من المركبات تتذبذب في الأنسجة، والبلازما، واللعاب بطريقة الإيقاعية 9-11. الأهم من ذلك، معظم الهرمونات يحمل إيقاعات الساعة البيولوجية في 5،12-13 الدم. وعلاوة على ذلك، والساعات الإيقاعية من هرمون المقابلة إنتاج الأنسجة الطرفية قد ينظم إفراز هرمون محليا. وقد وصفت مؤشرات التذبذب الإيقاعية خلايا مستقلة في القوارض والخلايا خلايا البنكرياس البنكرياس الإنسان 14-16. هذه المؤشرات تلعب دورا أساسيا في تنظيم Transcriptome على جزيرة البنكرياس وظيفة 15،17-18. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت myokine إفراز بواسطة myotubes الهيكل العظمي البشري مؤخرا لعرض نمط الإيقاع اليومي، الذي ينظمه oscillato خلايا مستقلةالتمرير المنطوق في هذه الخلايا 19.

وقد استخدمت عدة طرق لدراسة ايقاعات كل يوم في البشر في الجسم الحي على نطاق واسع. على سبيل المثال، تم دراستها الميلاتونين البلازما أو مستويات الكورتيزول وكذلك الصدرية درجة حرارة سطح الجلد (إعادة النظر في المراجع 3،20) لتقييم الساعات الساعة البيولوجية الداخلية. على الرغم من أن هذه الأساليب تسمح دراسة التذبذبات الإيقاعية النظامية في الجسم الحي، فهي بعيدة كل البعد عن توفير تقييم دقيق لإيقاعات الساعة البيولوجية مستقلة خالية من يعمل في الأجهزة والأنسجة المختلفة. ومع ذلك، فإن مثل هذا التشريح من التنظيم المنهجي أن يكون أداة لا غنى عنها لفهم تأثير معين من الساعات الجزيئية الخلايا على وظيفة هذه الخلايا. ولذلك، فقد بذلت جهدا كبيرا لوضع نهج يمكن الاعتماد عليها لدراسة الساعات الإنسان في الخلايا المستزرعة مخلد أو الأولية متزامنة في المختبر. الأهم من ذلك، وقد ثبت أنخصائص ساعة قياس في الخلايا الأولية الليفية الجلد مثقف تعكس بشكل وثيق خصائص مدار الساعة الفردية الكائن الحي كله 21. تطوير صحفيين الساعة البيولوجية الفلورسنت وإضاءة الحيوية التي تقدمت كثيرا هذا النهج 22-27. وعلاوة على ذلك، ودراسة الساعات الخلية الأولية التي هي مستمدة من الأجهزة الطرفية المختلفة تتيح للتحقيق في الخصائص الجزيئية من الساعات الأنسجة محددة الإنسان 3،5،16،19-20،28. وهكذا، وتقييم الساعات الساعة البيولوجية في المختبر في إإكسبلنتس أو الخلايا الأولية متزامنة، وذلك باستخدام صحفيين إضاءة الحيوية، يمثل طريقة مفيدة للغاية لدراسة التركيب الجزيئي للساعات الطرفية البشرية وتأثيرها على وظيفة الجهاز.

في هذه المقالة، وسوف نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتقييم التعبير الجيني الساعة البيولوجية في جزيرة الابتدائية والعضلات والهيكل العظمي خلايا الإنسان متزامنة في المختبر، وكذلك تأثير على مدار الساعة الخلوية مستقلةاضطراب في وظيفة إفرازية من هذه الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على التلاعب الواردة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة جنيف والتي الأخلاقي جنة SUD EST الرابع (اتفاق 12/111) 19. تم عزل الجزر الإنسان من البنكرياس من الجهات المانحة الأعضاء المتعددة بالسكتة الدماغية في مركز جزيرة زرع في مستشفى جامعة جنيف (سويسرا) كما وصفها لنا في المراجع 16،18، أو تم الحصول عليها من مصدر تجاري.

1. إعداد الثقافة الخلية الأولية

  1. الإنسان البنكرياس جزيرة العزلة، التفكك والثقافة
    ملاحظة: معطف كل أنبوب، غيض من البلاستيك أو ماصة مع كونوت الطبية مختبرات (CMRL) المتوسطة من أجل منع الجزر أو الخلايا خلايا البنكرياس من الالتصاق على سطح البلاستيك، والتي يمكن أن تؤدي إلى خسارة كبيرة من مادة الخلية.
    1. قبل يوم واحد إلى جزيرة تفكك خلية إضافة 1 مل من المصفوفة خارج الخلية laminin-5-الغني (المستمدة من 804G الخلايا كما descriالسرير في اشارة 29) في 3.5 سم الطبق. قبل خلايا الطلاء، ونضح المصفوفة وغسل الطبق 3 مرات مع الماء المعقم ثنائية المقطرة. السماح للطبق لتجف تحت مجلس الوزراء تدفق الصفحي لمدة 5 دقائق.
    2. داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي، توزيع الجزر التي تم الحصول عليها مع CMRL المتوسطة إلى 15 مل أنبوب (ق). أجهزة الطرد المركزي في 272 x ج لمدة 5 دقائق.
    3. نضح طاف، ثم resuspend الكرية في 1 مل من المياه المالحة الفوسفات العقيمة Dulbecco و(DPBS) قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية دون الكالسيوم والمغنيسيوم. أجهزة الطرد المركزي في 272 x ج لمدة 5 دقائق.
    4. نضح طاف و resuspend بيليه خلية في 1 مل من DPBS.
    5. لحساب عدد من الجزر الصغيرة، الماصة 10 ميكرولتر من تعليق جزيرة 1 مل في طبق جديد 3.5 سم. حساب عدد من الجزر في انخفاض بنسبة 10 ميكرولتر تحت المجهر وهذا من حساب عدد من الجزر في تعليق الجزيرة 1 مل. إضافة 14 مل من DPBS وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية واحدة أكثرمرة في 272 x ج لمدة 5 دقائق.
    6. لجزيرة تفارق الخلية، ونضح طاف وإضافة 1 مل من محلول خلية مفرزة لمدة أقصاها 1000 في حكمه خلايا البنكرياس (IEQ). وضع أنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية وتخلط بلطف الجزر من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات كل دقيقة، خلال 6-10 دقيقة.
      ملاحظة: للتحقق من جودة عملية الهضم، الماصة بانخفاض بنسبة 2 ميكرولتر من تعليق على شريحة زجاجية والاختيار تحت المجهر أن جميع الخلايا يتم فصل جيدا، وأنه لا الحلل أو كتل الخلايا بقيت.
    7. وقف رد الفعل من خلال إضافة 14 مل من CMRL البرد مع المكملات الغذائية (10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ من L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ البنسلين ستربتومايسين (P / S)، 1٪ الجنتاميسين، 1 ٪ البيروفات الصوديوم). أجهزة الطرد المركزي في 425 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف وإضافة 15 مل من CMRL المتوسط ​​وبيليه الخلية.
    8. resuspend الكرية في حجم صغير من CMRL مع المكملات الغذائية. حساب عدد الخلايا تحت المجهر باستخدام hemocytoمتر، وضبط حجم CMRL من أجل الحصول على تركيز خلية من ~ 650، 000 خلية / مل.
    9. الماصة 3 فصل قطرات من 100 ميكرولتر من كل من تعليق خلية موزعة حصلت عليه في الخطوة 1.1.8 في صحن 3.5 سم قبل المغلفة مع laminin.
      ملاحظة: خلايا نعلق على طبق في حوالي 24 ساعة.
    10. احتضان الخلايا (الشكل 1A) في نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. تغيير المتوسطة من الخلية يسقط كل 2-3 أيام من قبل الشفط 100 ميكرولتر من كل قطرة واستبدالها مع نفس الحجم من متوسطة جديدة.
  2. بالخلايا العضلية الجذعية الثقافة الابتدائية الإنسان والتمايز في Myotubes
    1. خزعة الأنسجة، والعزلة خلية الفضائية والثقافة بالخلايا العضلية الجذعية
      ملاحظة: تم الحصول على خزعات العضلات من مجموعة اتيان Lefai (INSERM، ليون، فرنسا) 19.
      1. تنقية myoblasts الهيكل العظمي الأولية وفقا للإجراءات المنصوص عليها في السابق 30.
    2. التفريق صmyoblasts الإنسان rimary إلى myotubes
      1. خذ قارورة واحدة (1 × 10 6 خلايا) من myoblasts الإنسان تخزينها في النيتروجين السائل وذوبان الجليد الخلايا بسرعة عن طريق وضع القارورة لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع الإثارة.
      2. الخلايا الماصة (1 مل) في 24 مل من متوسط ​​النمو يتكون من لحم الخنزير F-10 تستكمل مع FBS 20٪، 1٪ P / S، و 0.5٪ الجنتاميسين و 0.2٪ أمفوتيريسين B.
      3. الطرد المركزي 5 دقائق في 150 × ز.
      4. إزالة الخلايا طاف و resuspend مع 15 مل من متوسط النمو العذبة في 2.5 × 10 5 خلايا.
      5. لوحة ما لا يقل عن 2.5 × 10 5 خلايا لكل F75 قارورة ملتصقة. الحفاظ على myoblasts في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
      6. مرة واحدة الخلايا تصل إلى 60-80٪ confluency، فصل الخلايا مع التربسين-EDTA 0.05٪ لمدة 1-2 دقيقة ولوحة منها في 2 مل من متوسط ​​النمو على 3.5 أطباق ملتصقة سم بتري.
      7. بعد الوصول إلى نقطة التقاء، وإزالة المتوسطة النمو.
      8. بدء بروتو التمايزعمود من myoblasts الإنسان في myotubes بواسطة زرع لهم في 2 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تحتوي على 1 غرام / لتر من الجلوكوز، 2٪ FBS، 1٪ P / S، و 0.5٪ الجنتاميسين و 0.2٪ أمفوتيريسين ب (التمايز المتوسطة) في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
        عادة ما تتشكل Myotubes في غضون 7-10 أيام: ملاحظة.
      9. تحقق العضلات تمايز الخلايا تحت المجهر (الشكل 2A) من خلال مراقبة انصهار myoblasts إلى myotubes متعدد النوى 19.

2. صغيرة بالتدخل RNA (سيرنا) ترنسفكأيشن

  1. سيرنا ترنسفكأيشن من خلايا جزيرة الإنسان
    ملاحظة: يتم تنفيذ بروتوكول ترنسفكأيشن في قطرات من 100 ميكرولتر في اليوم التالي بعد تفكك خلية (الخطوات 1.1.1-1.1.10).
    1. نضح 100 ميكرولتر من المتوسطة CMRL من كل قطرة واستبدالها مع نفس الحجم من المصل خالية الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) 2 ساعةقبل ترنسفكأيشن من قبل pipetting.
    2. إعداد مزيج القائم على MEM من كاشف ترنسفكأيشن و 50 نانومتر الهدف سيرنا (siClock) أو 50 نانومتر من غير تستهدف siControl وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      1. للطبق واحد مع 3 قطرات إعداد اثنين من 1.5 مل الأنابيب مع 200 ميكرولتر من MEM لكل منهما.
      2. إضافة إلى واحدة من هذه الأنابيب 4 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن.
      3. إضافة إلى ثاني أنبوب 1 ميكرولتر من محلول الأسهم سيرنا المناسب (20 ميكرومتر).
      4. تستنهض الهمم هذه الأنابيب اثنين ببطء على شاكر المداري لمدة 5 دقائق ثم خلط محتويات الأنابيب معا وتستنهض الهمم لمدة 20 دقيقة أكثر.
    3. نضح 100 ميكرولتر من MEM من كل قطرة واستبدالها مع نفس الحجم من مزيج ترنسفكأيشن التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة قبل pipetting.
    4. استبدال الحل ترنسفكأيشن مع CMRL المتوسطة بعد 4 ساعات من الحضانة عند 37 درجة مئوية. كرر الخطوات 2.1.1-2.1.3 في اليوم التالي لخلية إعادة ترنسفكأيشن.
  2. سيرنا ترنسفكأيشن من Myotubes الإنسان
    1. قبل ترنسفكأيشن، استبدال المتوسطة (راجع الخطوة 1.2.2.8) مع 2 مل من المتوسط ​​التمايز جديدة في 3.5 سم طبق بتري.
    2. في أنبوب 1.5 مل العقيمة، وإعداد خليط من 20 نانومتر سيرنا (siControl أو siClock)، وهو ما يعادل 2.4 ميكرولتر من حل 20 ميكرومتر سيرنا، و 12 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مخففة في 100 ميكرولتر من متوسطة التمايز. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف.
    3. خلايا Transfect مع 114.4 ميكرولتر من مزيج سيرنا في 3.5 سم طبق بتري ومكان الخلايا في نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.

3. على المدى الطويل المستمر الساعة البيولوجية تلألؤ بيولوجي تسجيل يقوم بالتوازي مع تقييم إفراز هرمون في الخلايا الحية الابتدائية الإنسان

  1. إدخال مراسلون ضوء بارد الساعة البيولوجية في خلايا الإنسان الأساسية التيLentiviral تنبيغ
    ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات مع الجسيمات lentiviral في مجال السلامة الأحيائية منشأة مستوى 2 إلى اتخاذ احتياطات إضافية للعمل مع العوامل التي تشكل خطرا محتملا المعتدل للعاملين والبيئة.
    1. تحضير جسيمات مراسل lentiviral التي شاركت في transfecting متجه pLenti6.4 الفائدة / R4R2 / V5-DEST / Bmal1 لوك أو البلازميد 31 مع ناقلات lentiviral pMD2G pLV156-Per2-dLuc (وتسمى Bmal1 لوك وPer2 لوك، على التوالي،) وpsPAX إلى خلايا 293T باستخدام طريقة polyethylenimine (لإجراءات تفصيلية أنظر المرجع 16).
    2. عاير الجسيمات lentiviral التي تم الحصول عليها (يمكن الحصول على تفاصيل عن المعايرة في http://lentilab.unige.ch/). لمزيد من التجارب، استخدم lentiviruses مع التتر تتراوح 10 أبريل - 10 مايو حدات transducing [TU / ميكرولتر].
    3. أطباق مكان مع الخلايا جزيرة الإنسان أو myoblasts الإنسان (في 30-50٪ confluency) داخل المقصورة تدفق الصفحيوآخرون واستبدال المتوسطة مع 2 مل من المتوسط ​​CMRL تستكمل جديدة (راجع الخطوة 1.1.7) أو متوسطة النمو (راجع الخطوة 1.2.2.2)، على التوالي.
    4. حساب وافر من العدوى (وزارة الداخلية) (أي الجسيمات المعدية (وحدات transducing) / عدد الخلايا).
    5. تنبيغ ثقافة الخلية الأولية من قبل pipetting حل الفيروسة البطيئة على طبق من أجل الحصول على وزارة الداخلية = 3 (على سبيل المثال، ل65،000 خلايا تعلق إضافة 3 ميكرولتر من الحل فيروس مع عيار 6.5 × 10 4-100 انخفاض متوسط ميكرولتر).
    6. احتضان بين عشية وضحاها في نسيج الثقافة الحاضنة. تغيير المتوسطة في اليوم التالي.
      ملاحظة: تنبيغ الخلايا جزيرة الإنسان قبل 4 أيام على الأقل لتسجيل تلألؤ بيولوجي من أجل تحقيق يكفي للتعبير عن التركيبة المراسل. وtransduced Myoblasts خلال مرحلة التوسع، ثم نمت لالتقاء، والتفريق في وقت لاحق إلى myotubes.
  2. في المختبر التزامن الخلايا الأولية البشرية
      <لى> إضافة 10 ميكرومتر من أدينيليل محلقة المنشط في 2 مل من المتوسط ​​في 3.5 سم طبق بتري تحتوي على الخلايا الأولية transduced سابقا في الخطوة 3.1.5.
    1. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
    2. تغيير المتوسط ​​تحتوي على أدينيليل محلقة المنشط مع 2.5 مل من تسجيل المتوسط ​​تحتوي على 100 ميكرومتر وسيفيرين.
      ملاحظة: للحصول على استخدام الخلايا جزيرة الإنسان CMRL تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ P / S، 1٪ الجنتاميسين. لmyotubes البشري استخدام الفينول الأحمر - DMEM الحرة مع 1 جم / لتر الجلوكوز تستكمل مع 2٪ FBS، 2٪ L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ P / S، و 0.5٪ الجنتاميسين و 0.2٪ أمفوتيريسين B.

4. تقييم بالتوازي مع الساعة البيولوجية تلألؤ بيولوجي تسجيل وهرمون إفراز شخصيات في خلايا المتزامنة الإنسان إفرازية الابتدائية

  1. إعداد طويل الأجل Perifusion المستمر وضوء بارد تسجيل لخلايا الإنسان الأساسية.
    ملاحظة: عموميات عند العملبيئة تطوير متكاملة مجلس الوزراء تدفق الصفحي، نظيفة كل الأسطح الملامسة والحد من التعرض للثقافات أو متوسطة في الهواء لتجنب التلوث.
    1. لإعداد المتوسطة perifusion، إضافة 100 ميكرومتر من وسيفيرين إلى المتوسط.
      ملاحظة: للحصول على استخدام الخلايا جزيرة الإنسان CMRL تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ P / S، 1٪ الجنتاميسين. لmyotubes البشري استخدام الفينول الأحمر - DMEM الحرة مع 1 جم / لتر الجلوكوز تستكمل مع 2٪ FBS، 2٪ L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ P / S، و 0.5٪ الجنتاميسين و 0.2٪ أمفوتيريسين B.
    2. داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي، افتح 3.5 سم الأطباق التي تحتوي على transduced، transfected ومتزامنة الثقافات الخلية الأولية (خلايا خلايا البنكرياس أو myotubes) كما هو موضح أعلاه. إدراج قبعات معدنية معقمة (وضعت في المنزل) (الشكل 1B2) في سم أطباق 3.5 والتي تكون مجهزة مع سيليكون تدفق / هروب رأس المال الذي يربط أنابيب (الشكل 1B1 / B5).
    3. وضع الأطباق على منصة القياس في 37 درجة مئوية لآيت محكم الحاضنة. إصلاح الأطباق إلى منصة باستخدام محول screwable (الشكل 1B3). إدراج أنابيب تدفق / هروب رأس المال من نظام perifusion في أنابيب السيليكون المناسبة من الغطاء (الشكل 1B1 / B5) وضبط سرعة المضخة بمعدل تدفق ~ 0.5 مل من المتوسط في 1 ساعة.
    4. فتح البرنامج بالتنقيط biolumicorder في المنزل المتقدمة التي تسجل الإشارات من (PMT) كاشف أنبوب مضخم. اختار الدليل حيث سيتم تخزين البيانات والبدء تلألؤ بيولوجي المستمر تسجيل من كل طبق عن طريق النقر على أيقونة "البدء".
      ملاحظة: بدلا من ذلك إلى البرنامج بالتنقيط biolumicorder، برامج أخرى (على سبيل المثال LumiCycle)، ويمكن استخدامها لتسجيل إشارات من PMT كاشف.
    5. وضع معقمة لوحات زراعة الأنسجة 6-جيدا في خانة جمع على الجليد.
    6. فتح برنامج حاسوبي لمراقبة يتحكم في توقيت التبديل الآلي بين آبار الجمع. إعداد الوقت ثindow من جمع المتوسط ​​(ثانية). بدء تحصيل المتوسطة تدفق كل 4 ساعات (14،400 ثانية؛ ~ 2 مل لكل الوقت نقطة) من خلال النقر على "تشغيل" رمز.
    7. نقل وقياس متوسط ​​تدفق من كل مجموعة جيدة في العقيمة 2 مل أنابيب من قبل pipetting. إبقاء الأنابيب في الثلاجة -20 درجة مئوية قبل البدء في الخطوة التالية. كرر الخطوات 4.1.5-4.1.6 كل 24 ساعة.
    8. وقف تسجيل تلألؤ بيولوجي والتدفق المتوسط ​​عن طريق النقر على أيقونة "وقف" على البرنامج المقابلة. تنزع الأغطية المعدنية ونضح المتوسطة المتبقية من الأطباق.
    9. من أجل تطبيع قيم البروتين يفرز التي تم الحصول عليها في تجارب مختلفة، إما استخراج الحمض النووي (التطبيع التي كتبها محتوى الحمض النووي الجيني لmyotubes 19)، أو إضافة 1 مل من العازلة تحلل حمض الإيثانول (التطبيع التي كتبها المحتوى الكلي للهرمون لخلايا جزيرة 18) ل أطباق.

5. قياس مستويات هرمون جزيرة وMyokine في التدفقحصل المتوسطة التي كتبها Perifusion المستمر للخلايا الغدد الصماء الابتدائية الإنسان

  1. الأنسولين
    1. تحديد مستويات الانسولين القاعدية في المتوسط ​​تدفق من الوقت نقاط جمعها باستخدام الأنسولين المناعي فحص (ELISA) مجموعة انزيم مرتبط الإنسان باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    2. تطبيع البيانات إلى الحجم المطلق للالمتوسطة التي تم جمعها في كل بئر والمحتوى الكلي للأنسولين، المستخرجة من الخلايا المعالجة حمض الإيثانول في نهاية التجربة (الخطوة 4.1.9) 18.
  2. انترلوكين 6 (IL-6)
    1. تحديد القاعدية IL-6 مستويات في المتوسط ​​تدفق من الوقت نقاط جمعها باستخدام IL-6 ELISA عدة الإنسان باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    2. تطبيع البيانات إلى الحجم المطلق للالمتوسطة التي تم جمعها في كل بئر ومحتوى الحمض النووي الجيني في نهاية التجربة (الخطوة 4.1.9).

6. تحليلات الإدراجات الساعة البيولوجية للBioluminescence وهرمون إفراز الملامح

  1. تحليل تلألؤ بيولوجي
    1. تحليل الشخصية تلألؤ بيولوجي باستخدام البرامج المقدمة (19).
  2. تحليل JTK دورة
    1. تحليل هرمون الشخصية إفراز وتسجيل نتائج تلألؤ بيولوجي باستخدام خوارزمية JTK_CYCLE 32.
    2. تعيين عرض فترة الإيقاعية في 20-24 ساعة.
      ملاحظة: في حالة تم تسجيلها الظروف التجريبية في موازاة ذلك، تحليل إحصائي تقرن يمكن إجراء مقارنة التجارب.
  3. تحليل CosinorJ
    1. بدلا من ذلك، تحليل إفراز هرمون وملامح تلألؤ بيولوجي الساعة البيولوجية باستخدام برنامج CosinorJ 28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم جزيرة هرمون إفراز بالتوازي مع الساعة البيولوجية تلألؤ بيولوجي تسجيل من خلايا Perifused جزيرة الإنسان

بعد تقديم التوصيف الجزيئي الأول من الساعة اليومية، ناشط في الخلايا جزيرة الإنسان 16، ونحن نهدف إلى دراسة تأثير انقطاع على مدار الساعة على وظيفة جزيرة والنسخ 18. أنشأنا بروتوكول كفاءة siClock ترنسفكأيشن في الخلايا جزيرة الإنسان المتفرقة (انظر بروتوكول لمزيد من التفاصيل)، مما أسفر عن أكثر من 80٪ من ضربة قاضية CLOCK مرنا، وكفاءة الاجتثاث على مدار الساعة مقاسا التنميط تلألؤ بيولوجي الإيقاعية 18. يسببها إفراز الأنسولين (هيئة التأمين) تحليل الجلوكوز كشفت انخفاض كبير القاعدية وحفز إفراز الأنسولين على مدار الساعة مثل هذا التعطيل (لا يظهر). لتقييم إفراز هرمون بواسطة الخلايا جزيرة الإنسان في جميع أنحاء على مدار الساعة، وcontin كان على علاقة النظام perifusion uous إلى luminometer (مبين في الشكل 1B). تم transduced الخلايا خلايا البنكرياس الإنسان، واضعة وظيفي (siControl) أو اختلال وظيفي (siClock) مذبذب مع جزيئات lentiviral Bmal1 لوك. وقد تزامن الخلايا في وقت لاحق مع نبض المنشط أدينيليل محلقة تليها تحليل الموازي للتلألؤ بيولوجي الساعة البيولوجية وإفراز الأنسولين في المتوسط تدفق خلال 48 ساعة (الشكل 1C، D 18). وتشير هذه التجارب أنه في ظل ثابتا التركيز الفسيولوجي الجلوكوز (5.6 ملي الجلوكوز)، إفراز الأنسولين من قبل خلايا في المختبر جزيرة الإنسان متزامنة يعرض لمحة الساعة البيولوجية، التي تعطلت في siClock عينات تحمل (1D الشكل).

دراسة Myokine إفراز من الهيكل العظمي الإنسان Myotubes المتزامنة في المختبر في وجود أو عدم وجود ساعة الوظيفية

الصورة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> وبالنظر إلى الدور المحتمل للساعة الهيكل العظمي والعضلات في تنظيم استقلاب الجلوكوز في القوارض 33، ونحن نهدف إلى تحديد خصائص إيقاعات الساعة البيولوجية في الانتخابات التمهيدية الهيكل العظمي البشري myotubes وفي التحقيق دورها في وظيفة myotube مركزيا 19. تحقيقا لهذه الغاية، وقد تحقق اختلال الساعة اليومية في myotubes الهيكل العظمي من قبل transfecting سيرنا استهداف مدار الساعة. كشفت الساعة البيولوجية المقايسات مراسل تلألؤ بيولوجي مع Bmal1 لوك وصحفيين Per2 لوك أن myotubes الهيكل العظمي البشري، متزامنة في المختبر، تظهر إيقاع الساعة البيولوجية مكتفية ذاتيا، وهو ما أكده أبعد الذاتية التعبير الأساسية على مدار الساعة نسخة (الشكل 2B، 19). تعطلت هذه الساعة المحلية بكفاءة في وجود سيرنا استهداف CLOCK (الشكل 2B). وعلاوة على ذلك، فإن إفراز القاعدية من IL-6 (الشكل 2C)، انترلوكين 8 (IL-8)والوحيدات الكيميائي البروتين 1 (MCP-1) (لا يظهر) من خلال myotubes الهيكل العظمي متزامنة، المقررة من قبل نظام perifusion هنا وصف (الشكل 1B)، وتحليل تعدد الإرسال اللاحقة myokine على نطاق واسع (لا يظهر)، يسلك لمحة الساعة البيولوجية، وهو dysregulated بقوة على انقطاع على مدار الساعة (الشكل 2C 19).

شكل 1
الشكل 1: تقييم هرمون إفراز بالتوازي مع الساعة البيولوجية تلألؤ بيولوجي تسجيل من خلايا Perifused جزيرة الإنسان (A) الصورة التمثيلية للخلايا جزيرة الإنسان تعلق بعد يوم واحد من التفكك جزيرة. (ب) عرض تخطيطي للنظام perifusion الصنع التي تضم زجاجة مع المتوسط perifusion، مضخة، منصة قياس مجهزة أنبوب مضخم (PMT) ضمن حاضنة للضوء ضيق، جهاز luminometer، التي تسيطر عليها برنامج تسجيل، وعينة جامع شبه. إدراج: (B1) تدفق ربط أنبوب. (B2) الغطاء المعدني للطبق بيتري 3.5 سم؛ (B3) محول screwable التي يعلقها سقف لمنصة القياس (B4)؛ أنبوب (B5) هروب رأس المال الذي يربط. (B6) تلقائيا تسيطر الموزع المتوسط. و transfected (C) الخلايا جزيرة الإنسان مع سيرنا إما سارعت (siControl) أو سيرنا استهداف CLOCK (siClock) وtransduced مع مراسل Bmal1 لوك. تم perifused خلايا باستمرار مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 5.6 ملي الجلوكوز. تم تسجيل تلألؤ بيولوجي الساعة البيولوجية بعد المزامنة المنشط نبض أدينيليل محلقة. تم تقييم (D) مستويات الأنسولين بواسطة ELISA في العينات التي تم جمعها تدفق كل 4 ساعات خلال 48 ساعة. تطبيق JTK_CYCLE خوارزمية 32 أكد أنه في صوكانت resence من ساعة وظيفية (siControl)، متوسط الشخصي الأنسولين المفرز الساعة البيولوجية خلال 48 ساعة، مع طول فترة 24.19 ± 0.89 ساعة (** ع = 0.009، ن = 7 المانحين). فقد هذا الملف الإيقاعية على انقطاع على مدار الساعة (siClock). وتعرض البيانات كنسبة مئوية من هرمون يفرز من المحتوى الكلي للهرمون (يعني ± SEM) ل n = 7 المانحين (مكررة واحدة لكل المانحة) تم تعديل .هذا الرقم من إشارة 18. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: بصل IL-6 إفراز بواسطة Myotubes الهيكل العظمي الإنسان مقيدا بشدة في عدم وجود الساعة اليومية وظيفية تم transduced Myoblasts مع جزيئات lentiviralتحتوي على التحوير Bmal1 لوك، متباينة في myotubes، وtransfected مع أي siControl أو siClock سيرنا. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ومزامنة myotubes مع المنشط نبض أدينيليل محلقة وتعرض لperifusion مستمر مع تسجيل تلألؤ بيولوجي الموازي. أخذت (A) صور تمثيلية في اليوم 0 (D0) وD7 بعد التبديل من 20٪ إلى 2٪ FBS تحتوي على المتوسط للحث على myotubes التمايز. وخلال عملية التمايز، وتوجيه myoblasts الإنسان، تصبح ممدود وتلتحم مع بعضها لتشكيل مخلى plurinuclated. (ب) لمحات من تلألؤ بيولوجي Bmal1 لوك من siControl -transfected myotubes (خط أسود) وsiClock -transfected myotubes (خط رمادي)، كما لم تسجل ملامح التذبذب Bmal1 لوك في ثلاث تجارب مستقلة (مانح واحد في التجربة). (C) القاعدية الممثل IL-6 إفرازلمحة في وجود أو عدم وجود ساعة وظيفية. جمعت المتوسطة perifusion تدفق في 4 فترات ساعة خلال 48 ساعة (0-4 يتوافق مع تراكم IL-6 بين 0 ساعة و 4 ساعة). وجرى تقييم IL-6 مستويات في المتوسط ​​عن طريق ELISA في نسختين التقنية من ثلاث تجارب مستقلة. وتمثل النتائج القاعدية IL-6 مستويات طبيعية لمجموع محتوى الحمض النووي. تم تخفيض IL-6 إفراز في المتوسط ​​من 69.30 ± 10.61٪ عند انقطاع على مدار الساعة الساعة البيولوجية (يعني ± SEM، ن = 3؛ * ف <0.05، وإرفاقها ر اختبار). تم تعديل هذا الرقم من إشارة 19. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتتكون الإعدادات التجريبية الموصوفة هنا التسليم lentiviral من الصحفيين تلألؤ بيولوجي الساعة البيولوجية في الخلايا الأولية البشرية المستزرعة، تليها مزامنة لاحقة في المختبر والتسجيل المتواصل من تلألؤ بيولوجي لعدة أيام، وتحليل مواز من إفراز هرمون من قبل نفس الخلايا. أنها تمثل نهج فعال لاستكشاف الآليات الجزيئية والجوانب الفنية من الساعات الساعة البيولوجية في خلايا الإنسان الأساسية.

نوعية المواد المانحين هي قضية هامة لإعداد مزارع الأنسجة الابتدائية قابلة للحياة. نوعية الجزر الإنسان يجب أن يتم تقييم كل مرة قبل بدء التجربة. لا ينصح الجزر مع نقاء المقدرة أو / وقدرتها على البقاء أدنى من 70٪ لهذه التجارب. الخلايا جزيرة تميل إلى إعادة تأسيس الاتصالات في الثقافات فصلها، والتي تلعب دورا هاما في بقائها وظيفة. منذ الخلايا جزيرة لا تتكاثر في مكعبlture، فإنها يجب أن تكون مطلية في مناطق ذات كثافة عالية، والذي يسمح الخلايا لإقامة اتصالات مع الخلايا المجاورة. ويتحقق ذلك عن طريق طلاء الخلايا في قطرات من حجم صغير. والأهم من ذلك موت الخلايا أعلى في منخفض الكثافة الثقافات خلايا الجزيرة. لاحظ أن استبدال المتوسط ​​يجب أن يتم تنفيذ فورا من أجل تجنب جفاف الخلايا.

وينبغي passaged Myoblasts يفضل 60٪ التقاء، لأن كثافة أعلى قد يحرض التمايز بالخلايا العضلية الجذعية. بعد trypsinization، ينبغي myoblasts معلق بعناية وفرقت لتجنب مجموعات الخلايا.

وينبغي استبعاد التلوث الجرثومي أو الفطري من الخلايا الأولية المجهر قبل البدء في فحص perifusion. يمكن أن تستكمل الثقافة المتوسطة مع المواد المضادة للفطريات. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تشطف أنابيب perifusion عن الكحول اليود التطهير / الماء المعقم وأغطية معدنية يجب تعقيم بواسطة التعقيم. وأوصت هذه الخطوات بين كل هxperiment.

للتسجيل تلألؤ بيولوجي فعال، يجب تحديد نوعية إعداد الفيروسة البطيئة مراسل من شدة إشارة للإضاءة الحيوية. تفاصيل إنتاج الفيروسة البطيئة بما في ذلك استكشاف الأخطاء وإصلاحها يمكن العثور عليها في http://lentilab.unige.ch/. قبل البلازميد ترنسفكأيشن لإنتاج الفيروسة البطيئة، ينبغي مطلي الخلايا 293T على 30-50٪ التقاء. يوصى بدرجة كبيرة لإجراء مراقبة كفاءة ترنسفكأيشن في صحن مواز، على سبيل المثال باستخدام CMV-GFP أو lentivector الفلورسنت بديل. لكل إعداد فيروس ينبغي إنشاء عيار الفيروس.

كما وصف التجارب عادة (48 ساعة أو أكثر) لفترة طويلة الأمد، من الأهمية بمكان أن يكون إسكات مستقرة خلال هذه الفترة الزمنية. يجب أن يكون الأمثل للتركيز سيرنا فضلا عن confluency خلية وفقا لبروتوكول سيرنا كاشف. يجب أن يتم اختبار كفاءة إسكات الجينات في نهاية experimeالإقليم الشمالي بواسطة RT-QPCR أو قبل الغرب النشاف.

خلال perifusion، يحدد معدل تدفق الوقت اللازم لتبادل تماما المتوسطة في الطبق ولكن لديها أيضا تأثير ميكانيكي على ثقافة الخلية الأولية. في الواقع، وإقامة تدفق بمعدل، وهي نسبة منخفضة جدا، وسوف لن تسمح لتبادل كاملة من المتوسط ​​في الطبق، وسيقلل من حساسية هذه الطريقة. على العكس من ذلك، وهو معدل تدفق عالية السرعة قد يؤدي إلى تلف الخلايا. في أيدينا، وسرعة المثلى لكل أنواع الخلايا لم تسمح لجمع 0.5 مل من المتوسط ​​تدفق في 1 ساعة.

الأهم من ذلك، للحصول على تركيز قياس المواد في المتوسطة تدفق، وينبغي أن يكون عدد كاف من خلايا إفراز موجودة في طبق perifused. وينبغي أن تكون متابعة طريقة للكشف عن مادة يفرزها (ELISA أو غيرها) حساسة بما فيه الكفاية، وخاصة بالنسبة للمواد يفرزها في تركيزات منخفضة جدا. قد يكون الموصى بها أعلى كثافة الخلايا للتغلب علىهذه المشكلة عندما يكون ذلك ممكنا. بدلا من ذلك، على المديين المتوسط تدفق يمكن أن تتركز بواسطة الغسيل الكلوي أو مع مرشحات الطرد المركزي، كما وصفها لنا في التفاصيل، في اشارة 19.

معا تجاربنا في الخلايا خلايا البنكرياس البنكرياس الإنسان وفي myotubes الأساسي توفير أول مرة أدلة دامغة على أن هذه الخلايا البشرية تمتلك الساعات الإيقاعية عالية السعة خلية مستقلة 18-19. استخدام نظام perifusion هنا صفها جنبا إلى جنب مع جهاز luminometer (الشكل 1B) لقد أثبتنا أن هذه الساعات تلعب دورا هاما في تنظيم الساعة البيولوجية من إفراز الأنسولين القاعدي الخلايا خلايا البنكرياس البنكرياس (1D الشكل)، وإفراز IL6 القاعدية التي كتبها myotubes الهيكل العظمي (الشكل 2C). وعلاوة على ذلك، من خلال هدم على مدار الساعة على مدار الساعة الجينات الأساسية في كل من النظم التجريبية، وتبين لنا أن هناك حاجة إلى مذبذب الساعة البيولوجية وظيفية للأنسولين الايقاعي السليم وIL-6 إفرازمن جزيرة الإنسان وخلايا العضلات والهيكل العظمي، على التوالي (أرقام 1C، D و 2B، C). وتشير النتائج التي توصلنا دورا حاسما على مدار الساعة جزيرة الإنسان لإفراز الأنسولين الصحيح، وهي في اتفاق جيد مع الأعمال المنجزة في النماذج الوراثية القوارض 15،17. ونظرا للدور الرئيسي للالساعة اليومية في السماح الكائنات الحية على استباق التغيرات البيئية اليومية بدلا من الاستجابة لها، وتنظيم الساعة البيولوجية من الأنسولين القاعدي وإفراز myokine قد تمثل مثل هذه الآلية الاستباقية التي تنسق جزيرة البنكرياس والعضلات والهيكل العظمي الأنشطة الإفرازية للrest- دورة نشاط الجسم كله.

المنهجية المقترحة هنا يمكن تعديلها بسهولة لدراسة إفراز هرمون إضافي من نفس الأنسجة. قمنا بتحليل بالفعل لوحة كبيرة إضافية من myokines يفرز من قبل خلايا العضلات والهيكل العظمي، وذلك باستخدام متعددة صفائف myokine الإنسان 19، ونحن في عملية تقييمجي إفراز الجلوكاجون من خلايا جزيرة الإنسان استخدام عدة الجلوكاجون ELISA (لا تظهر البيانات). وعلاوة على ذلك، فإن هذه الظروف التجريبية يمكن أن يكون الأمثل لأنواع أخرى من الخلايا، لالخلايا الشحمية المثال الابتدائي، لدراسة إفراز adipokine، thyrocytes الأساسي لدراسة إفراز هرمون الغدة الدرقية، المعوية الأولية لدراسة إفراز incretins، الخ تطبيق إضافيا هاما من هذا النظام يمكن أن يكون ل استكشاف تأثير المركبات الفسيولوجية و / أو الدوائية على الخلوية ظيفة على مدار الساعة الساعة البيولوجية وإفراز. مجمع الفائدة يمكن أن تطبق بشكل مستمر طوال التجربة بأكملها (على سبيل المثال دراسة إفراز الأنسولين من قبل خلايا خلايا البنكرياس الإنسان في وجود ارتفاع نسبة الجلوكوز أو مستويات مختلفة من الأحماض الدهنية الحرة)، أو قد تضاف المجمع في مرحلة اختيار من الإيقاعية دورة.

هذا الأسلوب له حدود دراسة في المختبر ولا تمثل تعقيد regu إيقاع الساعة البيولوجيةlation على مستوى الجسم كله. وفي الوقت نفسه، فإنه يساعد على التمييز بين دور ساعة مستقلة على الأيض الخلوي تحت ظروف خاضعة للرقابة. حاليا تستند الأساليب المتاحة على قياسات لقطة من النشاط إفراز في الخلايا أو إإكسبلنتس التالية في المختبر التزامن 17. بروتوكول صفها هنا يمثل طريقة فريدة من نوعها تسمح للتحليل متناسق ومتواصل من إيقاع الساعة البيولوجية والنشاط الإفرازي ضمن ثقافة الخلية نفسها. بدلا من ذلك، يمكن تطبيق هذه المنهجية لدراسة حركية للصحفيين إضاءة الحيوية غير الإيقاعية، بالتزامن مع إفراز الخلايا، وكذلك للكشف عن آثار مواد مختلفة تضاف إلى متوسطة perifusion على وظيفة الخلية. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي: 1) إعداد الفيروسة البطيئة كفاءة، 2) ترنسفكأيشن الخلية فعالة مع سيرنا ومراسل ناقلات التنبيغ. 3) جمع ثابت المتوسطة تدفق و4) التأكد من وجود عدد كاف من مLLS يستخدم من أجل الحصول على مستويات قابلة للقياس الهرمونات أو السيتوكينات في المتوسط ​​تدفق جمعها (انظر استكشاف الأخطاء وإصلاحها أعلاه).

في ضوء الأدلة الأخيرة على صلة بين اضطرابات الساعة اليومية وأمراض التمثيل الغذائي والسرطان في البشر 3-4،28،34-35، ودراسة خصائص مدار الساعة الطرفية البشرية في الثقافات الأولية قد تمثل مدخلا مهما وفريدة من نوعها لفهم اتصال على مدار الساعة محتمل لهذه الأمراض. وهكذا، واكتشاف لدينا من وجود صلات بين الوظيفية جزيرة البنكرياس الإنسان وعلى مدار الساعة الهيكل العظمي والعضلات وإفراز القاعدية من الأنسولين وmyokines، قد تتحمل العواقب المحتملة لفهم تطور الأمراض المزمنة، مثل السكري والسمنة ونوع 18-19 فبراير وسوف تجلب آفاقا جديدة في علاج هذه الأمراض. الأهم من ذلك، نظرا للارتباط القائم بين في المختبر الخصائص مذبذب المقدرة وفي الجسم الحي 36، الآثار المترتبة على خصائص الساعة اليومية الإنسان باعتبارها السمة المميزة للأمراض، هو من أعلى وأهميتها السريرية المباشرة 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لزملائنا من جامعة جنيف: جاك فيليب لتعليقات بناءة على هذا العمل، Ueli Schibler للمساعدة لا تقدر بثمن مع تطوير نظام perifusion وللإلهام العلمي، أندريه Liani لديها تصور التصميم والتصنيع والتكليف نظام الارواء، لسة-التكنولوجيا المحدودة شركة للمساعدة في نظام perifusion وتطوير البرمجيات بالتنقيط biolumicorder، جورج Severi للحصول على المساعدة مع التجارب perifusion، أورسولا Loizides-مانغولد لقراءة نقدية للمخطوطة، وآن ماري مخلوف للتحضير الفيروسة البطيئة . لاتيان Lefai، ستيفاني Chanon وهوبير فيدال (INSERM، ليون) لإعداد myoblasts الأولية الإنسان؛ ودومينيكو بوسكو والفرنسي تييري Berney (مركز زرع جزيرة الإنسان، مستشفى جامعة جنيف) لتوفير الجزر الإنسان. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل رقم الوطني السويسري منحة مؤسسة العلوم 31003A_146475 / 1، وسيnergia العلوم الوطنية السويسرية مؤسسة منحة رقم CRSII3-154405، مؤسسة الروماندية صب لا بحوث سور Diabète، مؤسسة بو Hjelt، مؤسسة إرنست وآخرون لوسي شميدهيني، وسوسيتيه Académique دو جنيف (CD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300-054 For muscle biopsy digestion
DPBS no calcium no magnesium Invitrogen 14190-094
HAM F-10 Invitrogen 41550-021 For myoblasts culture
FBS Invitrogen 10270 Supplement to culture medium
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781-100 Supplement to culture medium
Gentamycin Axon  A1492.0001 Supplement to culture medium
Fungizone Invitrogen 15290-026 Amphotericin B, supplement to culture medium
DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax  Invitrogen 21885-025 For myotubes culture
DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax Invitrogen 11880-028 Recording medium for LumiCycle
Glutamax Invitrogen 35050-028 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104 Cell detachment solution, for islet cell dissociation
CMRL Gibco 21530-027 Culture medium for islet cells
Sodium Pyruvate Gibco 11360-039 Supplement to culture medium
15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube Falcon 352096
F75 flask BD Falcon 353136
3.5 cm Petri dish  BD Falcon 353001
Foskolin Sigma F6886 Adenylyl cyclase activator, used for synchronization
Luciferin Prolume LTD 260150 Supplement to recording medium
OptiMEM  Invitrogen 51985-026 Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection
Lipofectamine RNAiMAX reagent Invitrogen 13778-150 Transfection reagent
HiPerFect reagent Qiagen 301705 Transfection reagent
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool  Dharmacon L-008212-00
ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) Dharmacon D-001810-01
DNeasy Blood & Tissue Kit  Qiagen 69504 For myotubes DNA extraction
RNeasy Plus Mini kit  Qiagen 74104 For myotubes RNA extraction
QIAshredder  Qiagen 79654 For myotubes RNA extraction
2 ml collecting tubes Axygen 311-10-051 To collect the medium with the perifusion
Tissue culture Plate, 6 Well BD Falcon  353046 To collect the medium with the perifusion
RNeasy Plus Micro kit  Qiagen 74034 For islet RNA extraction
Human IL-6 Instant ELISA kit  eBioscience 88-7066-22
Human Insulin Kit Mercodia Mercodia 10-1113-01
Hydrochloric acid, min,37%,p.a. Acros organics 124630010 Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Ethanol (>99.8%) Fluka Analytical 02860-1L Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Human Islets for Research Prodo Laboratories
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R
Water bath VWR 1112A  at 37 °C
Tissu culture hood Faster  SafeFastElite
Tissu culture incubator Heraeus HeraCell 150 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator Heraeus HeraCell 150 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i 5% CO2 at 37 °C
Shaker Heidolph Instruments Unimax 1010 For agitation of the siRNA mix
LumiCycle Actimetrics
LumiCycle software Actimetrics
CosinorJ software EPFL Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX  ERC GmbH Control software that controls the timing of the automated switch

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).

Tags

علم الوراثة، العدد 117، الخلايا جزيرة البنكرياس الإنسان، myotubes الهيكل العظمي الأولي البشري، تلألؤ بيولوجي الإيقاعية، تنبيغ lentiviral،
قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., … More

Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (117), e54673, doi:10.3791/54673 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter