Abstract
Circadiane klokken zijn functioneel in alle lichtgevoelige organismen, waardoor een aanpassing aan de buitenwereld door te anticiperen op de dagelijkse veranderingen in het milieu. Aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de nauwe verbinding tussen de circadiane klok en de meeste aspecten van de fysiologie is geboekt op het gebied van de afgelopen tien jaar. Echter, het ontrafelen van de moleculaire basis dat de functie van de circadiane oscillator mens grondslag blijft de hoogste technische uitdaging. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van een experimentele benadering voor de lange termijn (2-5 dagen) bioluminescentie opname en uitstroom medium collectie in gekweekte menselijke primaire cellen. Hiervoor hebben we primaire cellen getransduceerd met een lentivirale luciferase reporter die onder besturing van een centrale klok genpromotor, waardoor de parallelle beoordeling hormoonsecretie en circadiane bioluminescentie. Verder beschrijven we de voorwaarden voor het verstoren van de circadiane klok in primary menselijke cellen door transfectie siRNA gericht KLOK. Onze resultaten op circadiane regulatie van de insuline secretie door menselijke pancreatische eilandjes en Myokine secretie door humane skeletspiercellen, worden hier gepresenteerd aan de toepassing van deze methode te illustreren. Deze instellingen kunnen worden gebruikt om de moleculaire samenstelling van menselijke perifere klokken bestuderen en de functionele gevolgen primaire cellen onder fysiologische of pathofysiologische condities analyseren.
Introduction
Het circadiane systeem (van het Latijnse "Circa diem") is ontstaan in alle lichtgevoelige organismen, als een adaptief mechanisme om de rotatie van de Aarde. Bij zoogdieren wordt georganiseerd in een hiërarchische wijze, omvat de centrale klok, meer bepaald in de suprachiasmatische nucleus van de ventrale hypothalamus en perifere (of slave) oscillatoren die werkzaam in verschillende organen. Bovendien zijn deze cellen autonome zichzelf onderhoudende oscillatoren zijn functioneel in vrijwel elke cel van het lichaam 1. Fotische signalen vormen een dominante synchronisatie cue (Zeitgeber) voor de SCN neuronen, terwijl neurale en humorale signalen afkomstig van de SCN reset de perifere klokken. Daarnaast slaap-waak ritme, dat rijdt op zijn beurt voeden-vasten cycli, zijn verdere synchronizers voor perifere klokken 2. Volgens onze huidige kennis, wordt de moleculaire samenstelling van de kern klok op basis van transcriptie en translanele feedback loops, die zijn geconserveerd tussen organismen. Dit bestaat uit de transcriptie activatoren BMAL1 en klok, die samen de transcriptie van de negatieve core clock PER en CRY genen te activeren. Hoge niveaus van PER en CRY eiwitten zullen hun eigen transcriptie remmen door remming van de BMAL1 / KLOK complex. Een extra lus bestaat uit de nucleaire receptoren REV-Erbs en Rors, die ook de transcriptie van BMAL1 en KLOK reguleren. Bovendien posttranslationele evenementen, waaronder fosforylering, sumoylation, acetylering, O-GlcNAcylation, afbraak- en nucleaire binnenkomst van de core clock eiwitten vertegenwoordigen een bijkomende belangrijke regulerende laag bij het vaststellen van de 24 uurs oscillatie cyclus 3.
Accumuleren bewijsmateriaal komt voort uit studies in diermodellen en wijst op de cruciale rol van het circadiaan systeem in de coördinatie van de metabole en endocriene functies 4-5. Een aantal van de large-schaal transcriptoom analyse blijkt dat het voeden - vasten cycli een centrale rol in de synchronisatie van perifere oscillatoren 6-8 te spelen. In een overeenkomst met deze studies, metaboloom en lipidomic analyse bij knaagdieren en mensen hebben aangetoond dat een groot aantal metabolieten oscilleren in het weefsel, plasma en speeksel in een circadiane manier 9-11. Belangrijk is dat de meeste hormonen vertonen circadiane ritmes in het bloed 5,12-13. Bovendien zou circadiane klok van de overeenkomstige hormoon producerende perifere weefsels hormoon lokaal te regelen. Cel-autonome circadiane oscillatoren zijn beschreven in knaagdieren en menselijke pancreatische eilandcellen: 14-16. Deze oscillatoren spelen een essentiële rol in het reguleren van de eilandjes van Langerhans transcriptoom en functie 15,17-18. Bovendien Myokine secretie door menselijke skelet myotubes is onlangs aangetoond dat een circadiaan patroon, dat wordt gereguleerd door de cel-autonome oscillato vertonenrs werkzaam in 19 deze cellen.
Verschillende benaderingen voor het bestuderen van circadiane ritmes bij mensen in vivo zijn op grote schaal gebruikt. Zo hebben plasma melatonine of cortisol en thoracale huid oppervlaktetemperatuur (besproken in referenties 3,20) onderzocht endogene circadiane klok beoordelen. Hoewel deze methoden is het mogelijk het bestuderen systemische circadiane oscillaties in vivo, zijn ze verre van een betrouwbare beoordeling van de free-running autonome circadiane ritmes in verschillende organen en weefsels. Niettemin zouden dergelijke dissectie van de systemische regeling een onmisbaar hulpmiddel om het specifieke effect van intracellulaire moleculaire klok op de functie van deze cellen. Daarom heeft aanzienlijke inspanningen ondernomen om betrouwbare methoden voor het bestuderen van humane klokken in geïmmortaliseerde primaire of gekweekte cellen gesynchroniseerd in vitro te ontwikkelen. Belangrijker is aangetoond datklok kenmerken gemeten in gekweekte primaire huid fibroblast cellen sluiten nauw aan bij de individuele klok eigenschappen van het hele organisme 21. De ontwikkeling van fluorescente en bioluminescente circadiane verslaggevers is sterk gevorderd deze benadering 22-27. Verder bestuderen primaire cel klokken die zijn afgeleid van andere perifere organen maakt het onderzoek naar de moleculaire eigenschappen van menselijk weefsel-specifieke klokken 3,5,16,19-20,28. Zo, de beoordeling van de circadiane klok in in vitro gesynchroniseerd primaire explantaten of cellen, met behulp van bioluminescente verslaggevers, vertegenwoordigt een zeer bruikbare methode om de moleculaire samenstelling van humane perifere klokken en hun impact op orgaanfunctie te bestuderen.
In dit artikel zullen we gedetailleerde protocollen te presenteren voor de beoordeling van circadiane genexpressie in humane primaire eilandje en skeletspier cellen gesynchroniseerd in vitro, evenals de impact van de autonome cellulaire klokverstoring van de secretoire functie van deze cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: manipulaties opgenomen in dit protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Geneva University Hospital en door de Ethische Commissie SUD EST IV (Overeenkomst 12/111) 19. Human eilandjes werden geïsoleerd uit pancreas van hersendode multi-orgaandonoren in de Islet Transplantation Centrum in het Universitair Ziekenhuis van Genève (Zwitserland), zoals beschreven door ons in referenties 16,18, of verkregen van een commerciële bron.
1. Voorbereiding van de primaire cel Cultuur
- Human eilandjes van Langerhans Isolatie, dissociatie en Cultuur
OPMERKING: Coat elke buis, plastic tip of pipet met Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) medium om eilandjes of eilandcellen te plakken aan het kunststof oppervlak, wat kan leiden tot een aanzienlijk verlies van celmateriaal.- Eén dag voor eilandje celdissociatie voeg 1 ml van laminine-5-rijke extracellulaire matrix (afgeleid van 804G cellen described in verwijzing 29) per 3,5 cm schotel. Voordat plating cellen, zuigen de matrix en was de schotel 3 keer met steriele bi-gedestilleerd water. Laat de schaal drogen onder de laminaire stroming kast voor 5 min.
- In de laminaire stroming kast, distribueren verkregen eilandjes met CMRL medium in 15 ml buisje (s). Centrifugeer bij 272 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml van steriele Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) voorverwarmd tot 37 ° C zonder calcium en magnesium. Centrifugeer bij 272 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml van DPBS.
- Het totale aantal eilandjes Pipetteer 10 ul van de 1 ml suspensie eilandje is gecombineerd met een nieuwe 3,5 cm schaaltje. Tel het aantal eilandjes in de 10 ul druppel onder de microscoop en naar het bereken het totale aantal eilandjes in de 1 ml suspensie eilandje. Voeg 14 ml DPBS en centrifugeer de celsuspensie ééntijd bij 272 xg gedurende 5 minuten.
- Voor eilandje cel dissociatie, zuig het supernatant en voeg 1 ml van de mobiele onthechting oplossing voor een maximum van 1.000 eilandjes equivalenten (IEQ). Plaats de buis in een waterbad bij 37 ° C en voorzichtig de eilandjes meng door en neer te pipetteren meerdere keren per minuut, gedurende 6-10 min.
OPMERKING: Om de spijsvertering kwaliteit te controleren, pipet een 2 pl druppel schorsing op een glasplaatje en controleren onder de microscoop dat alle cellen goed gescheiden zijn, en dat er geen doubletten of cel klonten zijn gebleven. - Stop de reactie door toevoeging van 14 ml koud CMRL met supplementen (10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% penicilline-streptomycine (P / S), 1% gentamycine, 1 % natriumpyruvaat). Centrifugeer bij 425 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant en voeg 15 ml CMRL medium aan de cel pellet.
- Resuspendeer de pellet in een klein volume CMRL met supplementen. Tel het aantal cellen onder de microscoop met een hemocytometer, pas het volume CMRL teneinde een celconcentratie van ~ 650, 000 cellen / ml te verkrijgen.
- Pipet 3 gescheiden druppels 100 pl elk van de gedispergeerde celsuspensie verkregen in stap 1.1.8 in een 3,5 cm schaaltje vooraf gecoat met laminine.
OPMERKING: Cellen hechten aan de schotel in ongeveer 24 uur. - Incubeer cellen (Figuur 1A) in een weefselkweek incubator bij 37 ° C in een vochtige kamer. Verander het medium van de cellen daalt om de 2-3 dagen door opzuigen 100 gl uit elke druppel en vervangen door hetzelfde volume vers medium.
- Humane primaire myoblasten Cultuur en differentiatie in myotubes
- Weefsel biopsie, satelliet cel isolatie en myoblast cultuur
Opmerking: Muscle biopten werden verkregen uit de groep van Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Frankrijk) 19.- Zuiver primaire skeletmyoblasten volgens de eerder beschreven procedure 30.
- Differentiatie primary menselijke myoblasten in myotubes
- Neem een flacon (1 x 10 6 cellen) van menselijke myoblasten opgeslagen in vloeibare stikstof en ontdooien snel cellen door de invoering van de flacon 30 sec tot 1 min in een waterbad bij 37 ° C onder roeren.
- Pipet cellen (1 ml) in 24 ml groeimedium samengesteld HAM F-10 gesupplementeerd met 20% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycine en 0,2% amfotericine B.
- Centrifugeer 5 minuten bij 150 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen met 15 ml vers groeimedium per 2,5 x 10 5 cellen.
- Plate ten minste 2,5 x 10 5 cellen per F75 hechtende kolf. Houd de myoblasten in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Zodra cellen 60-80% confluentie bereikt, dissociëren cellen met trypsine-EDTA 0,05% gedurende 1-2 min en plaat ze in 2 ml groeimedium op adherent 3,5 cm petrischalen.
- Na het bereiken van samenvloeiing, verwijder het groeimedium.
- Start de differentiatie protocol menselijke myoblasten in myotubes door ze te kweken in 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 1 g / l glucose, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycine en 0,2% amfotericine B (differentiatiemedium) in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Verander het medium elke 2 tot 3 dagen.
OPMERKING: myotubes worden gewoonlijk gevormd binnen 7-10 dagen. - Raadpleeg spiercel differentiatie onder de microscoop (Figuur 2A) en houdt de fusie van myoblasten in polynucleated myotubes 19.
- Weefsel biopsie, satelliet cel isolatie en myoblast cultuur
2. kleine interfererende RNA (siRNA) Transfectie
- siRNA Transfectie van Human Islet Cells
LET OP: De transfectie-protocol wordt uitgevoerd in dalingen van 100 ui op de volgende dag na cel dissociatie (stappen 1.1.1-1.1.10).- Aspireren 100 ul CMRL medium uit elke druppel en te vervangen door hetzelfde volume van serumvrij Minimal Essential Medium (MEM) 2 uurvoor transfectie door pipetteren.
- Bereid een MEM-gebaseerde mix van transfectiereagens en 50 nM van doel siRNA (siClock) of 50 nM niet-targeting siControl volgens de instructies van de fabrikant.
- Voor een schaal met 3 druppels bereiden twee 1,5 ml buizen met 200 ui MEM elk.
- Naar een van deze buizen 4 pl transfectiereagens.
- Voeg toe aan de tweede buis 1 pl van de passende siRNA voorraad-oplossing (20 pm).
- Schud beide buizen langzaam de orbitale schudder gedurende 5 min en vervolgens de inhoud van de buizen mengen en roeren gedurende nog 20 min.
- Verzamelbak 100 pl MEM van elke druppel en vervangen door hetzelfde volume van transfectie mengsel verkregen in de voorgaande stap door pipetteren.
- Vervang de transfectie oplossing CMRL medium na 4 uur incubatie bij 37 ° C. Herhaal stappen 2.1.1-2.1.3 de volgende dag celherkiezing transfectie.
- siRNA Transfectie van Human myotubes
- Voordat transfectie, vervang het medium (zie stap 1.2.2.8) met 2 ml vers medium differentiatie per 3,5 cm petrischaal.
- In steriele 1,5 ml buis, stelt een combinatie van 20 nM siRNA (siControl of siClock), hetgeen overeenkomt met 2,4 pi van een 20 pM oplossing siRNA en 12 pl transfectiereagens verdund in 100 pl differentiatiemedium. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten onder zacht schudden.
- Transfecteren cellen met 114,4 pl van de siRNA mix per 3,5 cm petrischaaltje plaats cellen in een weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
3. Continue lange termijn Circadiane bioluminescentie opname parallel uitgevoerd met de beoordeling van hormoon in levende menselijke primaire cellen
- Introductie van Circadiane Bioluminescentie Reporters in menselijke primaire cellen doorlentivirale Transductie
LET OP: Alle procedures met lentivirale deeltjes moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2 mogelijkheid om extra voorzorgsmaatregelen voor het werk te nemen met middelen die een matig potentieel gevaar voor het personeel en het milieu.- Bereid reporter lentivirale deeltjes door co-transfecteren van de vector van belang pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc of pLV156-Per2-dLuc (genaamd Bmal1-luc en Per2-luc, respectievelijk) plasmide 31 met lentivirale vectoren pMD2G en psPAX in 293T-cellen met behulp van de polyethyleenimine methode (voor gedetailleerde procedure zie referentie 16).
- Titreer de verkregen lentivirale deeltjes (details over de titratie kan worden verkregen bij http://lentilab.unige.ch/). Voor verdere experimenten gebruikt lentivirussen met titers variërend 10 april - 10 mei transducerende eenheden [TU / ul].
- Plaats gerechten met menselijke eilandje cellen of menselijke myoblasten (bij 30-50% confluentie) in de laminaire stroming cabineet en vervang het medium met 2 ml vers aangevulde CMRL medium (zie stap 1.1.7) of groeimedium (zie stap 1.2.2.2), respectievelijk.
- Bereken de multipliciteit van infectie (MOI) (dwz infectieuze deeltjes (transducerende eenheden) / aantal cellen).
- Transduceren van de primaire celkweek pipetteren lentivirus oplossing van de schotel teneinde een MOI = 3 te verkrijgen (bijvoorbeeld voor 65.000 aangehechte cellen voeg 3 ul van de virusoplossing met de titer van 6,5 x 10 4-100 pl medium druppel).
- Incubeer overnacht in een weefselkweek incubator. Wijzig medium de volgende dag.
OPMERKING: transduceren humane eilandcellen ten minste 4 dagen voor bioluminescentie opname om voldoende expressie van het construct te bereiken. Myoblasten getransduceerd tijdens de expansiefase, vervolgens gekweekt tot confluentie en vervolgens in myotubes gedifferentieerd.
- In Vitro Synchronisatie van humane primaire cellen
- <li> 10 pM toevoegen van adenylyl cyclase activator in 2 ml medium per 3,5 cm petrischaal die de primaire cellen getransduceerd eerder in stap 3.1.5.
- Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C in een celkweek incubator.
- Verander het medium dat het adenylaatcyclase activator met 2,5 ml van het registratiemedium bevattende 100 pM luciferine.
Opmerking: Voor humane eilandcellen gebruiken CMRL aangevuld met 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 1% gentamycine; voor menselijk gebruik myotubes fenolrood - vrij DMEM met 1 g / l glucose aangevuld met 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 0,5% gentamycine en 0,2% amfotericine B.
4. Parallel Assessment van het circadiaans Bioluminescentie opnemen en hormoon Profiles in Synchronized Human Secretory primaire cellen
- Het opzetten van lange termijn Constant Perifusion en Bioluminescentie opnemen voor menselijke primaire cellen.
LET OP: Bij het werken outside de laminaire stroming kabinet, schoon alle contactoppervlakken en de blootstelling van culturen of medium te beperken tot de lucht om besmetting te voorkomen.- De perifusion medium te bereiden, voeg 100 uM luciferine aan het medium.
Opmerking: Voor humane eilandcellen gebruiken CMRL aangevuld met 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 1% gentamycine; voor menselijk gebruik myotubes fenolrood - vrij DMEM met 1 g / l glucose aangevuld met 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 0,5% gentamycine en 0,2% amfotericine B. - In de laminaire stroming kast openen 3,5 cm schalen met de getransduceerde getransfecteerde en gesynchroniseerde primaire celculturen (eilandjescellen of myotubili) zoals hierboven beschreven. Plaats steriele metalen doppen (ontwikkeld in eigen huis) (Figuur 1B2) in het cm gerechten 3.5 die zijn uitgerust met siliconen instroom / uitstroom verbindingsbuizen (Figuur 1B1 / B5).
- Leg de gerechten op de weegschaal in de 37 ° C lechts-tight incubator. Bevestig de gerechten tot het platform met behulp van een schroefbare adapter (Figuur 1B3). Plaats de instroom / uitstroom buisjes met perifusion systeem in de juiste silicone buizen van de kap (Figuur 1B1 / B5) en de snelheid van de pomp met een debiet van ~ 0,5 ml medium per 1 uur.
- Open het in-house ontwikkelde Drip-biolumicorder software die de signalen registreert van de fotomultiplicator buis (PMT) detector. Koos de directory waar de gegevens worden opgeslagen en start continu bioluminescentie opname van elk gerecht door te klikken op het pictogram "start".
Opmerking: Als alternatief voor de Druppel-biolumicorder software, andere programma's (bijv LumiCycle), kan worden gebruikt om signalen van PMT-detector opnemen. - Plaats steriele 6-well weefselkweek platen in de collectebus op het ijs.
- Open de besturingssoftware die de timing van de schakelautomaat onder opvangputten regelt. Stel de tijd window van middelgrote collectie (sec). Begin collectie van de uitstroom medium elke 4 uur (14.400 sec; ~ 2 ml per time-point) door te klikken op het pictogram "run".
- Transfer en meet de uitstroom medium van elke collectie goed in steriele 2 ml buizen door pipetteren. Houd buizen in een -20 ° C vriezer voordat u de volgende stap. Herhaal de stappen 4.1.5-4.1.6 elke 24 uur.
- Stop de bioluminescentie opname en het medium stroom door te klikken op het pictogram "stop" op de bijbehorende software. Verwijder de metalen doppen en zuig de resten van het medium van de gerechten.
- Om het uitgescheiden eiwit verkregen waarden in verschillende experimenten te normaliseren, hetzij extract DNA (normalisatie van genomisch DNA content myotubili 19) of voeg 1 ml lysis zuur-ethanol buffer (normalisatie van totale hormoon voor eilandcellen 18) aan de gerechten.
- De perifusion medium te bereiden, voeg 100 uM luciferine aan het medium.
5. Meten Islet Hormoon en Myokine Levels in de UitstroomMedium verkregen door continu Perifusion van Human Primary Endocriene Cellen
- Insuline
- Kwantificeren basale insuline niveaus in het effluent van medium verzameld tijdstippen door een humane insuline enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Normaliseren van gegevens naar de absolute hoeveelheid ingezamelde medium in elk putje en de totale insuline, geëxtraheerd uit zuur-ethanol behandelde cellen aan het eind van de proef (stap 4.1.9) 18.
- Interleukine-6 (IL-6)
- kwantificeren basale IL-6 niveau in de uitstroom van medium verzameld tijdstippen met een humaan IL-6 ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Normaliseren van gegevens naar de absolute hoeveelheid ingezamelde medium in elk putje en genomische DNA-gehalte aan het einde van de proef (stap 4.1.9).
6. Circadiane Dataset Analyses voor Bioluminescentie en hormoon Profielen
- bioluminescentie Analyse
- Analyseer bioluminescentie profiel met behulp van de meegeleverde software 19.
- JTK-cyclus Analyse
- Analyseer hormoon profielen en bioluminescentie opname resultaten met behulp van de JTK_CYCLE algoritme 32.
- Stel de circadiane periode breedte bij 20-24 uur.
LET OP: Voor het geval dat de experimentele condities die in parallel, kan een gepaarde statistische analyse worden uitgevoerd om de experimenten te vergelijken.
- CosinorJ Analyse
- Als alternatief, analyseren hormoon en circadiane bioluminescentie profielen met behulp van de software CosinorJ 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beoordeling van de Islet hormoon met Parallel Circadiane bioluminescentie Opnemen van Perifused Human Islet Cells
Na verschaffen van een eerste moleculaire karakterisatie van de circadiane klok, werkzaam in humane eilandcellen 16, we gericht op het bestuderen van het effect van de klok verstoring van eilandje functie en transcriptie 18. We zetten een efficiënte siClock transfectie protocol in verspreide menselijke eilandje cellen (zie Protocol voor details), wat resulteerde in meer dan 80% van de knock-down KLOK mRNA en efficiënte klok ablatie, zoals gemeten door circadiane bioluminescentie profilering 18. geïnduceerde insulinesecretie analyse glucose (GSIS) onthulde significant verlaagde basale en gestimuleerde insulinesecretie door deze klok onderbreking (niet getoond). Om hormoon beoordelen door menselijke eilandje cellen rond-de-klok, een continoverbodig perifusion systeem werd verbonden met een luminometer (afgebeeld in figuur 1B). Menselijke eilandje cellen, een functionele (siControl) of disfunctioneel (siClock) oscillator werden getransduceerd met Bmal1-luc lentivirale deeltjes. De cellen werden vervolgens gesynchroniseerd met een puls van adenylaat cyclase activator gevolgd door parallelle analyse van circadiane bioluminescentie en insuline secretie in het medium uitstroom gedurende 48 uur (Figuur 1C, D 18). Deze experimenten suggereren dat voortdurend fysiologische glucoseconcentratie (5,6 mM glucose), insulinesecretie door in vitro gesynchroniseerde humane eilandcellen vertoont circadiane profiel, die verstoord siClock lager monsters (figuur 1D).
Studeren Myokine Afscheiding door Human Skeletal myotubes Synchronized in vitro in de aanwezigheid of afwezigheid van functionele Clock
33, we gericht op het karakteriseren van circadiane ritmen bij primaire menselijke skelet myotubes en bij het onderzoek naar hun rol in myotube functie 19. Hiertoe verstoring van de circadiane klok skelet myotubes werd verkregen door transfectie van siRNA gericht CLOCK. Circadiane bioluminescentie reporter assays met Bmal1-luc en Per2-luc verslaggevers bleek dat menselijke skeletresten myotubes, gesynchroniseerd in vitro, vertonen een zelfdragende circadiaan ritme, die verder werd bevestigd door endogene core clock transcript expressie (Figuur 2B; 19). Deze endogene klok was efficiënt verstoord in aanwezigheid van siRNA gericht CLOCK (figuur 2B). Bovendien, de basale secretie van IL-6 (figuur 2C), interleukine-8 (IL-8)en Monocyt Chemotactisch Protein 1 (MCP-1) (niet getoond) van gesynchroniseerde skelet myotuben, bepaald door de hier beschreven perifusion systeem (Figuur 1B) en daaropvolgende grootschalige Myokine multiplex analyse (niet getoond), vertoont een circadiane profiel, wat sterk ontregeld na klok verstoring (figuur 2C 19).
Figuur 1: Beoordeling van hormoon met Parallel Circadiane bioluminescentie Opnemen van Perifused Human Islet cellen (A) representatief beeld van de bijgevoegde menselijke eilandje cellen één dag na eilandje dissociatie.. (B) Schematische weergave van de zelfgemaakte perifusion systeem dat een fles met de perifusion medium, een pomp, een meetplatform voorzien van een fotomultiplicator buis (PMT) binnen de lichtdichte incubator omvat, Een luminometer apparaat, bestuurd door de opname-software, en een semi-automatische monster verzamelaar. Plaats: (B1) Instroom verbindingsbuis; (B2) metallic cap voor de 3,5 cm petrischaal; (B3) schroefbare adapter die de dop op de weegschaal (B4) hecht; (B5) efflux verbindingsbuis; (B6) automatisch geregeld medium distributeur. (C) Menselijke eilandje cellen werden getransfecteerd met hetzij scrambled siRNA (siControl) of siRNA gericht CLOCK (siClock) en getransduceerd met de Bmal1-luc reporter. De cellen werden constant perifused met kweekmedium dat 5,6 mM glucose. Circadiane bioluminescentie werd opgenomen na de synchronisatie met een adenylylcyclase activator puls. (D) insuline niveaus werden bepaald met ELISA in de uitstroom monsters die elke 4 uur gedurende 48 uur. Toepassing van JTK_CYCLE algoritme 32 bevestigd dat in de presence van een functionele klok (siControl), het gemiddelde profiel van uitgescheiden insuline was circadiane binnen 48 uur, met een periodeduur van 24,19 ± 0,89 h (** p = 0,009; n = 7 donoren). Dit circadiane profiel werd verloren op de klok verstoring (siClock). De gegevens worden gepresenteerd als% van de uitgescheiden hormoon van de totale hoeveelheid hormoon (gemiddelde ± SEM) voor n = 7 donateurs (een herhaling voor elke donor) .Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie 18. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Figuur 2:. Basale IL-6 secretie door Human Skeletal myotubes wordt sterk geremd de afwezigheid van een functioneel circadiane klok myoblasten werden getransduceerd met lentivirale deeltjesmet de Bmal1-luc transgene, gedifferentieerd in myotubes en getransfecteerd met ofwel siControl of siClock siRNA. 24 uur na transfectie myotubes werden gesynchroniseerd met een adenylyl cyclase activator impuls en onderworpen aan continue perifusion met parallelle bioluminescentie opname. (A) Representatieve beelden werden genomen op dag 0 (D0) en D7 na de overgang van 20% tot 2% FBS bevattend medium op myotubes differentiatie induceren. Tijdens het differentiatieproces, menselijke myoblasten geheroriënteerd, worden verlengd en samensmelten tot een plurinuclated syncytium vormen. (B) Bmal1-luc bioluminescentie profielen van siControl getransfecteerde myotubes (zwarte lijn) en siClock getransfecteerde myotubes (grijze lijn). Bmal1-luc oscillatie profielen werden opgenomen in drie onafhankelijke experimenten (één donor per experiment). (C) Vertegenwoordiger basale IL-6 secretieprofiel in aanwezigheid of afwezigheid van een functionele klok. De uitstroom perifusion medium werd verzameld in 4 uur intervallen gedurende 48 uur (0-4 overeen met de accumulatie van IL-6 tussen 0 uur en 4 uur). IL-6 niveaus in het medium werden bepaald met ELISA in twee technische duplo van drie onafhankelijke experimenten. De resultaten vormen basale IL-6 niveaus genormaliseerd naar het totale DNA-gehalte. IL-6 secretie werd verlaagd van gemiddeld 69,30 ± 10,61% bij circadiane klok verstoring (gemiddelde ± SEM, n = 3; * P <0,05, gepaarde t-test). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven experimentele instellingen bestaan uit lentivirale levering van circadiane bioluminescentie reporters in gekweekte humane primaire cellen, gevolgd door achtereenvolgende in vitro synchronisatie en continue registratie van bioluminescentie enkele dagen en parallelle analyse van hormoon door dezelfde cellen. Zij vertegenwoordigen een efficiënte aanpak voor het verkennen van de moleculaire mechanismen en functionele aspecten van circadiane klokken in menselijke primaire cellen.
De kwaliteit van het donormateriaal is een belangrijke kwestie voor de bereiding van levensvatbare primaire weefselculturen. De kwaliteit van de menselijke eilandjes moet telkens worden geëvalueerd voordat het experiment. Eilandjes met een geschatte zuiverheid en / of levensvatbaarheid lager dan 70% worden niet aanbevolen voor deze experimenten. Eilandcellen meestal herstellen contacten gedissocieerde kweken, die een belangrijke rol voor de levensvatbaarheid en functie heeft. Sinds eilandje cellen niet vermenigvuldigen in culture, moeten worden uitgeplaat bij een hoge dichtheid, dat cellen toestaat om contacten met naburige cellen vastgesteld. Dit wordt bereikt door het uitplaten van cellen in druppeltjes een klein volume. Belangrijker celdood is hoger bij lage dichtheid eilandje celculturen. Merk op dat medium vervanging onmiddellijk moeten worden uitgevoerd om de cel voorkomen dat ze uitdrogen.
Myoblasten bij voorkeur gepasseerd bij 60% confluentie, omdat een hogere dichtheid myoblast differentiatie induceren. Na behandeling met trypsine, myoblasten moeten zorgvuldig opnieuw gesuspendeerd en gedispergeerd tot cel clusters voorkomen.
Bacteriële of fungale besmetting van elektrische elementen dienen microscopisch voordat het perifusion assay worden uitgesloten. Kweekmedium kan aangevuld worden met antischimmelmiddelen. Verder dient de perifusion buis gespoeld met alcohol jood desinfectie / steriel water en de metalen kappen worden gesteriliseerd door autoclaveren. Deze stappen worden aanbevolen tussen elke eXperiment.
Voor een efficiënte bioluminescentie opname, moet de kwaliteit van de reporter lentivirus preparaat worden bepaald door de intensiteit van de bioluminescente signaal. De details van lentivirus productie met inbegrip van het oplossen van problemen is te vinden op http://lentilab.unige.ch/. Voor transfectie van plasmide lentivirus productie moet 293T-cellen worden uitgeplaat bij 30-50% confluentie. Het wordt sterk aangeraden om een controle van de transfectie-efficiëntie uit te voeren in een parallel gerecht, bijvoorbeeld met behulp van CMV-GFP of een alternatief fluorescerende lentivector. Voor elk virus voorbereiding van het virus titer moeten worden vastgesteld.
Aangezien de beschreven experimenten worden typisch langdurige (48 uur of meer), is het cruciaal om stabiele silencing tijdens deze periode. De concentratie van siRNA moet ook worden geoptimaliseerd als de cel confluentie volgens de siRNA reagens protocol. Efficiëntie van gene silencing moeten worden getest op het einde van de experiment door RT-qPCR of door Western blotting.
Tijdens perifusion de stroomsnelheid bepaalt de tijd die nodig is om het medium volledig uit te wisselen in de schaal, maar ook een mechanische invloed op het primaire celkweek. Inderdaad, het instellen van de stroom met een snelheid, die te laag is, zal zorgen voor een volledige uitwisseling van medium in de schaal, en de gevoeligheid van de werkwijze verlagen. Integendeel kan een snelle stroomsnelheid de cellen beschadigen. In onze handen, de optimale snelheid voor beide celtypen toeliet om 0,5 ml van de uitstroom medium per 1 uur verzamelen.
Belangrijk, een meetbare concentratie van stoffen in het effluent medium te verkrijgen, moet een voldoende aantal uitscheidende cellen in de perifused schotel. Het volgen werkwijze voor het detecteren van de uitgescheiden stof (ELISA of andere) moeten voldoende gevoelig zijn, vooral voor stoffen afgescheiden in zeer lage concentraties. Hogere celdichtheid kunnen worden geadviseerd om te overwinnenDit probleem indien mogelijk. Als alternatief kan de uitstroom medium geconcentreerd door dialyse of centrifugale filters, zoals door ons beschreven in detail met verwijzing 19.
Samengenomen onze experimenten in humane pancreatische eilandjes cellen en primaire myotubes voor het eerst overtuigend bewijs dat deze menselijke cellen hebben hoge amplitude cel-autonome circadiane klok 18-19. Gebruikmakend van de hier beschreven perifusion systeem gecombineerd met een luminometer inrichting (Figuur 1B) hebben we aangetoond dat deze klokken een belangrijke rol in de circadiane regulatie van basale insuline door pancreatische eilandje cellen (figuur 1D) play en basale IL6 secretie met skelet myotubes (Figuur 2C). Bovendien, door het neerhalen van de core clock gen klok in zowel experimentele systemen, laten we zien dat een functionele circadiane oscillator is vereist voor de juiste ritmische insuline en IL-6 secretiedoor menselijke eilandjes en skeletspiercellen respectievelijk (figuren 1C, D en 2B, C). Onze resultaten wijzen op een belangrijke rol van de menselijke eilandje klok voor goede insulinesecretie en zijn in goede overeenstemming met werken uitgevoerd in knaagdier modellen genetische 15,17. Gezien de belangrijke rol van de circadiane klok in het toestaan van organismen op de dagelijkse veranderingen in het milieu te anticiperen in plaats van te reageren op hen zou circadiane regulatie van basale insuline en Myokine secretie dergelijke anticiperende mechanisme dat de eilandjes van Langerhans en skeletspier secretoire activiteiten coördineert de rust- vertegenwoordigen activiteitencyclus van het hele lichaam.
De hier voorgestelde methode kan eenvoudig worden aangepast teneinde extra hormoon bestuderen van dezelfde weefsels. Wij hebben reeds onderzocht extra groot panel van myokines uitgescheiden door skeletspiercellen, menselijke behulp multiplex Myokine arrays 19 en we zijn in het proces van beoordelening glucagon secretie door humane eilandcellen met de glucagon ELISA-kit (gegevens niet getoond). Bovendien kunnen deze experimentele omstandigheden worden geoptimaliseerd voor andere celtypen, bijvoorbeeld primaire adipocyten, voor het bestuderen adipokine secretie primaire thyrocytes voor het bestuderen schildklierhormoon secretie, primaire enterocyten voor het bestuderen incretines uitscheiding, etc. Een andere belangrijke toepassing van dit systeem zou zijn verken de impact van fysiologische en / of farmacologische stoffen op de cellulaire circadiane klok functie en de secretie. De verbinding van belang kan continu tijdens het gehele experiment toegepast (bijvoorbeeld bestuderen insulinesecretie door menselijke eilandje cellen in de aanwezigheid van hoge glucose of verschillende niveaus van vrije vetzuren), of de verbinding kan worden toegevoegd aan een gekozen fase van het circadiane fiets.
Deze techniek heeft de beperkingen van een in vitro onderzoek en niet de complexiteit van circadiane ritme regu vertegenwoordigenning op een hele lichaam niveau. Tegelijkertijd, het helpt om de rol van een autonome klok op celmetabolisme onderscheiden onder gecontroleerde omstandigheden. Momenteel beschikbare werkwijzen zijn gebaseerd op metingen van de momentopname secretie activiteit in de cellen of explantaten na in vitro synchronisatie 17. De hier beschreven protocol vormt een unieke methode waardoor een overeenstemmende en continue analyse van de circadiane ritme en secretoire activiteit in dezelfde celkweek. Als alternatief kan deze methode worden toegepast om de kinetiek van niet-circadiane bioluminescente reporters bestuderen, samen met celsecretie, alsmede voor het detecteren van de effecten van verschillende stoffen toegevoegd aan de perifusion medium voor celfunctie. De kritische stappen in het protocol zijn: 1) efficiënt lentivirus voorbereiding, 2) efficiënter cel transfectie met siRNA en reporter vectoren transductie; 3) constante medium uitstroom inzameling en 4) ervoor te zorgen dat een voldoende aantal cells wordt gebruikt om meetbare niveaus van hormonen of cytokines in de opgevangen uitstroom medium te verkrijgen (zie probleemoplossing hierboven).
In het licht van de recente bewijzen over het verband tussen circadiane klok verstoringen en metabolische ziekten en kanker bij de mens 3-4,28,34-35, studie van de menselijke perifere klok woningen in primaire kweken kan een belangrijke en unieke aanpak vormen voor het begrijpen van de mogelijke klok verbinding deze ziekten. Aldus onze ontdekking van het bestaan van banden tussen functionele humane pancreatische eilandjes en skeletspier klok en basale secretie van insuline en myokines zouden de eventuele gevolgen te dragen voor het begrijpen van de ontwikkeling van chronische ziekten zoals obesitas en type 2 diabetes 18-19 en zal nieuwe mogelijkheden brengen voor de behandeling van deze ziekten. Belangrijker gevolge van vaste correlatie tussen de in vitro geëvalueerd oscillator eigenschappen en in vivo 36, implicatie van menselijke circadiane klok eigenschappen als een kenmerk van ziekten, is de hoogste en directe klinische relevantie 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We zijn dankbaar dat onze collega's van de Universiteit van Genève: Jacques Philippe constructieve reacties op dit werk, Ueli Schibler voor onschatbare hulp bij de ontwikkeling van het perifusion systeem en voor de wetenschappelijke inspiratie, André Liani voor hebben bedacht ontwerp, de fabricage en inbedrijfstelling van de perfusie-systeem, Lesa-Technology LTD voor de hulp in de perifusion systeem en Drip-biolumicorder software development, George Severi voor hulp bij de perifusion experimenten, Ursula Loizides-Mangold voor het kritisch lezen van het manuscript, en Anne-Marie Makhlouf voor lentivirus bereidingen ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon en Hubert Vidal (INSERM, Lyon) voor het bereiden van humane primaire myoblasten; en Domenico Bosco en Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Genève Universitair Ziekenhuis) voor het leveren van menselijke eilandjes. Dit werk werd gefinancierd door de Swiss National Science Foundation Grant No. 31003A_146475 / 1, de Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur Diabète, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny en Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al.
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H.
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A.
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E.
- Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
