Abstract
Biologiske klokka er funksjonelle i alle lys-sensitive organismer, noe som åpner for en tilpasning til den ytre verden ved å forutse daglige miljøendringer. Betydelig fremgang i vår forståelse av den tette forbindelsen mellom biologiske klokke og de fleste aspekter av fysiologi har blitt gjort på feltet det siste tiåret. Men rakne det molekylære grunnlaget som ligger til grunn funksjon av circadian oscillator hos mennesker forblir av høyeste teknisk utfordring. Her gir vi en detaljert beskrivelse av en eksperimentell tilnærming for langsiktig (2-5 dager) bioluminescence opptak og utstrømming medium samling i dyrkede humane primære celler. For dette formål har vi transdusert primære celler med en lentiviral luciferase reporter som er under styring av en klokke kjerne-gen-promoteren, som tillater den parallelle vurderingen av hormon og circadian bioluminescens. Videre beskriver vi betingelsene for å forstyrre biologiske klokke i primary humane celler ved transfeksjon siRNA rettet mot klokken. Våre resultater på circadian regulering av insulinsekresjon av humane pankreatiske øyer, og myokine sekresjon av human skjelettmuskelceller, er presentert her for å illustrere anvendelsen av denne metodikken. Disse innstillingene kan brukes til å studere den molekylære sammensetningen av humane perifere klokker og å analysere deres funksjonelle innvirkning på primærceller under fysiologiske eller patofysiologiske forhold.
Introduction
Circadian timing system (fra latin "Circa diem") har dukket opp i alle lys-sensitive organismer, som en adaptiv mekanisme for å rotasjonen av jorden. Hos pattedyr er det organisert i en hierarkisk måte, som omfatter den sentrale klokke, som ligger i suprachiasmatic kjernen av ventral hypothalamus, og perifer (eller slave) oscillatorer som er operative i ulike organer. Dessuten, disse cellestyrte selvbærende oscillatorer er funksjonelle i nesten hver eneste celle i kroppen en. Photic signaler representerer en dominerende synkroniserings cue (zeitgeber) for SCN neuroner, mens nevrale og humoral signaler som kommer fra SCN nullstille perifere klokker. I tillegg hvile-aktivitet rytmer, som driver i sin tur fôring-faste sykluser, er ytterligere synchronizers for perifere klokker 2. Ifølge vår nåværende forståelse, er den molekylære sammensetningen av kjernen klokke basert på transkripsjonen og omregningelle tilbakemeldinger looper, som er konservert mellom organismer. Dette omfatter transkripsjonsaktivatorer BMAL1 og klokke, som sammen aktiverer transkripsjon av de negative kjerneklokke PER og gråte gener. Høye nivåer av PER og CRY proteiner vil hemme sin egen transkripsjon gjennom hemming av BMAL1 / CLOCK kompleks. En hjelpe sløyfe består av nukleære reseptorer REV-ERBs og på speil, som også regulerer transkripsjon av BMAL1 og KLOKKE. Videre posttranslational arrangementer, inkludert fosforylering, sumoylation, acetylering, O-GlcNAcylation, degradering og kjernekraft oppføring av kjerneklokke proteiner representerer et ekstra viktig regulerende lag i å etablere 24-timers pendling syklus 3.
Samle bevis stammer fra studier i gnagermodeller og fremhever den viktige rollen circadian system i koordineringen av metabolske og endokrine funksjoner 4-5. En rekke large-skala transkriptomet analyse tyder på at fôring - faste sykluser spille en sentral rolle i synkroniseringen av perifere oscillatorer 6-8. I en avtale med disse undersøkelser har metabolomic og lipidomiske analyse i gnagere og mennesker viser at et stort antall av metabolitter oscillerer i vev, plasma, spytt og i en cirkadisk måte 9-11. Viktigere, de fleste hormoner vise døgnrytme i blodet 5,12-13. Videre kan biologiske klokka av den tilsvarende hormonproduserende perifert vev regulere hormon lokalt. Cell-autonome circadian oscillatorer har blitt beskrevet i gnager og menneskelige bukspyttkjertel øyceller 14-16. Disse oscillatorer spiller en viktig rolle i reguleringen av bukspyttkjertelen holmen transkriptom og fungere 15,17-18. Videre har myokine sekresjon av menneskelige skjelett myotubes nylig blitt vist å utvise en circadian mønster, som reguleres av celle-autonome oscillatorenrs operative i disse cellene 19.
Flere metoder for å studere cirkadianske rytmer hos mennesker in vivo har vært mye brukt. For eksempel har plasma melatonin eller kortisolnivåer samt thorax hud overflatetemperatur (anmeldt i referanser 3,20) er undersøkt for å vurdere endogene biologiske klokka. Selv om disse metodene kan studere systemiske circadian svingninger i vivo, de er langt fra å gi en pålitelig vurdering av fritt kjører autonome døgnrytme i ulike organer og vev. Ikke desto mindre vil en slik disseksjon fra den systemiske reguleringen være et uunnværlig verktøy for å forstå den spesifikke virkning av intracellulære molekylære klokker på funksjonen av disse cellene. Derfor har en betydelig innsats blitt gjennomført for å utvikle pålitelige metoder for å studere menneskelige klokker i immortaliserte eller primære dyrkede celler synkroniserte in vitro. Viktigere er det blitt demonstrert atklokke egenskaper målt i dyrkede primære hud fibroblast celler tett gjenspeile de enkelte klokke egenskapene til hele organismen 21. Utviklingen av fluorescerende og selvlysende circadian journalister har mye avansert denne tilnærmingen 22-27. Videre studerer primære celle klokker som er avledet fra forskjellige perifere organer gir mulighet for etterforskningen av de molekylære egenskaper av menneskelig vev-spesifikk klokker 3,5,16,19-20,28. Dermed vurdering av biologiske klokka i in vitro synkroniserte primære explants eller celler, ved hjelp av bioluminescent reportere, representerer en svært nyttig metode for å studere den molekylære sammensetningen av humane perifere klokker og deres innvirkning på organfunksjon.
I denne artikkelen vil vi presentere detaljerte protokoller for vurdering av circadian genuttrykk i menneskelige primær holmen og skjelettmuskelceller synkroniserte in vitro, samt effekten av autonome mobilklokkeavbrudd på den sekretoriske funksjon av disse cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Manipulering inkludert i denne protokollen ble godkjent av etikkomiteen i Genève universitetssykehus og av Etisk Komité SUD EST IV (Avtale 12/111) 19. Menneskelige øyer ble isolert fra pancreases av hjernedøde flerorgandonorer i Islet Transplantasjon Centre ved University Hospital i Geneve (Sveits) som beskrevet av oss i referanser 16,18, eller hentes fra en kommersiell kilde.
1. Utarbeidelse av primær Cell Culture
- Menneskelig bukspyttkjertelen Islet Isolasjon, Dissosiasjon og kultur
MERK: Coat hvert rør, plastspiss eller pipette med Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) medium for å hindre holmer eller øyceller fester seg til plastoverflaten, noe som kan føre til et betydelig tap av cellemateriale.- En dag før holme celle dissosiasjon tilsett 1 ml laminin-5-rik ekstracellulære matrise (avledet fra 804G celler som detaljert beskrevetseng i referanse 29) per 3,5 cm parabolen. Før plating celler, Aspirer matrisen og vask fatet 3 ganger med sterilt bi-destillert vann. La retten til å tørke under laminær skap for 5 min.
- Inne i laminær strømning kabinettet, fordele de oppnådde holmer med CMRL medium inn i 15 ml rør (e). Sentrifuger ved 272 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten, og deretter resuspender pelleten i 1 ml sterilt Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) forvarmet til 37 ° C uten kalsium og magnesium. Sentrifuger ved 272 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 1 ml DPBS.
- For å telle det totale antall holmer, pipette 10 mL fra 1 ml holmen suspensjon i en ny 3,5 cm parabolen. Tell antall øyer i 10 pl dråpe under mikroskopet, og fra dette beregne det totale antall øyer i 1 ml holmen suspensjon. Legg 14 ml DPBS og sentrifuger cellesuspensjonen en mertid ved 272 xg i 5 minutter.
- For holmen celle dissosiasjon, aspirer supernatanten og tilsett 1 ml celle løsrivelse løsning for maksimalt 1000 holmen ekvivalenter (IEQ). Plasser røret på et vannbad ved 37 ° C og forsiktig blandes bitene ved å pipettere opp og ned flere ganger hvert minutt, i løpet av 6-10 min.
MERK: Hvis du vil kontrollere fordøyelsen kvalitet, pipettér en 2 ul dråpe suspensjon på et objektglass og sjekk under mikroskop at alle cellene er godt atskilt, og at ingen dubletter eller celleklumper har vært. - Stopp reaksjonen ved tilsetning av 14 ml kald CMRL med tilskudd (10% føtalt bovint serum (FBS), 1% av L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% penicillin-streptomycin (P / S), 1% gentamycin, 1 % natriumpyruviat). Sentrifuger ved 425 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og tilsett 15 ml CMRL medium til cellepelleten.
- Resuspender pelleten i et lite volum av CMRL med kosttilskudd. Tell antall celler i mikroskop ved anvendelse av en hemocytometer, juster CMRL volum for å oppnå en cellekonsentrasjon på 650 ~ 000 celler / ml.
- Pipette tre separert dråper av 100 pl hver fra den dispergerte cellesuspensjonen oppnådd i trinn 1.1.8 i en 3,5 cm plate forhåndsbelagt med laminin.
MERK: Celler feste til parabolen i ca 24 timer. - Inkuber cellene (figur 1A) i en vevskulturinkubator ved 37 ° C i et fuktig kammer. Skift medium av cellen synker etter 2-3 dager ved å aspirere 100 pl fra hver dråpe og erstatte det med det samme volum av friskt medium.
- Menneskelig Primær Myoblast Kultur og differensiering i Myotubes
- Tissue biopsi, satellitt celle isolasjon og myoblast kultur
Merk: Muscle biopsier ble oppnådd fra gruppen av Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Frankrike) 19.- Rens primære skjelett myoblaster i henhold til den tidligere beskrevne fremgangsmåten 30.
- Skille primary menneskelige myoblasts inn myotubes
- Ta en ampulle (1 x 10 6 celler) av humane myoblaster som er lagret i flytende nitrogen, og tining cellene raskt ved å sette flasken i 30 sekunder til ett minutt i et vannbad ved 37 ° C under omrøring.
- Pipettér celler (1 ml) i 24 ml vekstmedium bestående av HAM F-10 supplert med 20% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycin og 0,2% amfotericin B.
- Sentrifuge 5 min ved 150 x g.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene med 15 ml friskt vekstmedium per 2,5 x 10 5 celler.
- Plate minst 2,5 x 10 5 celler pr F75 adherent kolbe. Hold myoblaster i en celleinkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Når cellene når 60-80% konfluens, dissosiere cellene med trypsin-EDTA 0,05% i 1-2 min og plate dem i 2 ml vekstmedium for adherente 3,5 cm petriskåler.
- Etter å ha nådd samløpet, fjerner vekstmediet.
- Start differensiering protocol av humane myoblaster til myotubes ved å dyrke dem i 2 ml av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) inneholdende 1 g / l glukose, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycin og 0,2% amfotericin B (differensiering medium) i en celleinkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Endre medium hver 2 til 3 dager.
MERK: Myotubes er vanligvis dannet i løpet av 7-10 dager. - Sjekk muskelcelledifferensiering under mikroskop (figur 2A) ved å observere fusjon av myoblasts inn polynucleated myotubes 19.
- Tissue biopsi, satellitt celle isolasjon og myoblast kultur
2. Liten interfering RNA (siRNA) Transfeksjon
- siRNA Transfeksjon av menneskelige øyceller
MERK: transfeksjon protokollen er utført i dråper 100 pl på neste dag etter celle dissosiasjon (trinn 1.1.1-1.1.10).- Sug 100 ul av CMRL medium fra hver dråpe og erstatte den med det samme volumet av serumfritt Minimal Essential Medium (MEM) 2 timerfør transfeksjon ved pipettering.
- Forbered en MEM basert blanding av transfeksjon reagens og 50 nM av target siRNA (siClock) eller 50 nM av ikke-måls siControl i henhold til produsentens instruksjoner.
- For en tallerken med 3 dråper forberede to 1,5 ml rør med 200 ul MEM hver.
- Legg til en av disse rørene 4 ul av transfeksjon reagens.
- Legg til det andre røret 1 pl av den hensiktsmessige av siRNA stamoppløsning (20 pM).
- Agitere disse to rør sakte på orbital-rystemaskin i 5 minutter og deretter blande innholdet i rørene sammen og agitere for 20 flere min.
- Sug 100 ul MEM fra hver dråpe og erstatte den med det samme volumet av transfeksjon mix innhentet i forrige trinn ved pipettering.
- Erstatte den transfeksjon løsning med CMRL mediet etter 4 timers inkubering ved 37 ° C. Gjenta trinn 2.1.1-2.1.3 neste dag for celle re-transfeksjon.
- siRNA Transfeksjon av menneske Myotubes
- Før transfeksjon, erstatte mediet (se trinn 1.2.2.8) med 2 ml fersk differensiering medium per 3,5 cm petriskål.
- I et sterilt 1,5 ml rør, fremstille en blanding av 20 nM siRNA (siControl eller siClock), noe som tilsvarer 2,4 ul av en 20 mM siRNA-løsning, og 12 pl av transfeksjon reagens fortynnet i 100 ul medium differensiering. Inkuber av oppløsningen ved værelsestemperatur i 15 min med forsiktig omrøring.
- Transfektere celler med 114,4 mL av siRNA mix per 3,5 cm petriskål og sted celler i en vevsdyrkningsinkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 i 24 timer.
3. Kontinuerlig Langsiktig Circadian Bioluminesens Opptak utføres parallelt med vurderingen av hormon i levende menneske primære celler
- Vi presenterer i døgn Bioluminesens Reportere i humane primære celler vedlentiviral Transduksjon
MERK: Alle prosedyrer med lentiviral partikler må utføres i et biosikkerhetsnivå 2 anlegg for å ta ekstra forholdsregler for arbeid med stoffer som utgjør en moderat potensiell fare for personell og miljø.- Forbered reporter lentiviral partikler ved co-transfeksjon vektoren av interesse pLenti6.4 / R4R2 / V5-MÅL / Bmal1-luc eller pLV156-Per2-dLuc (kalt henholdsvis Bmal1-luc og Per2-Luc,,) plasmid 31 med lentiviral vektorer pMD2G og psPAX inn 293T celler ved hjelp av polyetylenimin metode (for detaljert prosedyre se referanse 16).
- Titrere de oppnådde lentiviral partikler (detaljer om titrering kan fås http://lentilab.unige.ch/). For ytterligere eksperimenter, bruker lentiviruses med titer alt 10 4 10 5 førende enheter [TU / ul].
- Plasser retter med humane øyceller eller menneskelige myoblasts (ved 30-50% konfluens) inne laminær hyttaet og erstatte mediet med 2 ml friskt medium supplert CMRL (se trinn 1.1.7) eller dyrkningsmedium (se trinn 1.2.2.2), respektivt.
- Beregn multiplisitet av infeksjon (MOI) (dvs. infeksiøse partikler (transduse enheter) / antall celler).
- Transduce den primære cellekultur ved å pipettere lentivirus løsning til skålen for å oppnå en MOI = 3 (for eksempel for 65 000 festede celler tilsett 3 mL av viruset oppløsning med titer på 6,5 x til 10 4 til 100 ul medium dråpe).
- Inkuber over natten i en vevskulturinkubator. Endre medium neste dag.
MERK: transduce humane øyceller i minst 4 dager før opptak bioluminescens for å oppnå tilstrekkelig ekspresjon av reporterkonstruksjon. Myoblasts blir omformet i ekspansjonsfasen, deretter vokst til samløpet, og senere differensiert i myotubes.
- In Vitro Synkronisering av humane primære celler
- <li> Tilsett 10 uM av adenylylcyklase aktivator i 2 ml medium pr 3,5 cm petriskål inneholdende de primære celler transdusert tidligere i trinn 3.1.5.
- Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C i en cellekulturinkubator.
- Skift medium inneholdende den adenylylcyklase aktivatoren med 2,5 ml av registreringsmediet inneholdende 100 mM luciferin.
MERK: For humane øyceller bruke CMRL supplert med 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 1% gentamycin; for human myotubes bruk fenolrødt - fritt DMEM med 1 g / l glukose supplert med 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 0,5% gentamycin og 0,2% amfotericin B.
4. Parallell Vurdering av Circadian Bioluminesens Opptak og hormon profiler i Synkronisert Menneskelig Sekretorisk primære celler
- Sette opp Langsiktig Constant Perifusion og Bioluminesens Recording for menneske primære celler.
MERK: Når du arbeider outsIde laminær kabinett, rene alle kontaktflater og begrense eksponering av kulturer eller medium til luft for å unngå forurensning.- For å forberede perifusion medium, tilsett 100 mikrometer av luciferin til mediet.
MERK: For humane øyceller bruke CMRL supplert med 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 1% gentamycin; for human myotubes bruk fenolrødt - fritt DMEM med 1 g / l glukose supplert med 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 0,5% gentamycin og 0,2% amfotericin B. - Inne i laminær strømning kabinettet, åpner 3,5 cm retter som inneholder de transduserte, transfekterte og synkroniserte primære cellekulturer (øyceller eller myotubes) som beskrevet ovenfor. Sett sterile metalliske caps (utviklet i huset) (figur 1B2) inn de 3,5 cm retter som er utstyrt med silikon tilstrømningen / efflux kobler rør (figur 1B1 / B5).
- Plasser rettene på målingen plattformen i 37 ° C light tett kuvøse. Fest retter til plattformen ved hjelp av en skrue adapter (figur 1B3). Sett inn tilstrømning / efflux rørene i perifusion system i de riktige silikon rør av hetten (fig 1B1 / B5) og angi hastigheten på pumpen ved en strømningshastighet på ~ 0,5 ml medium pr 1 time.
- Åpne egenutviklet Drip-biolumicorder programvare som registrerer signalene fra fotomultiplikatorrøret (PMT) detektor. Velg katalogen der dataene blir lagret og starte kontinuerlig bioluminescence opptak fra hver tallerken ved å klikke på "Start" -ikonet.
MERK: Alternativt til Drip-biolumicorder programvare, andre programmer (f.eks LumiCycle), kan brukes til å ta opp signaler fra PMT detektor. - Plasser sterile seks-brønns vevskulturplater i oppsamlingsbeholderen på is.
- Åpne kontroll programvare som styrer tidspunktet for automatbryteren blant oppsamlingsbrønner. Sett opp tid wvindumellom samling (sek). Begynn samling av utstrømningen medium hver 4 timer (14 400 sekunder; ~ 2 ml per gang-punkt) ved å klikke på "run" ikonet.
- Overfør og måle strøm medium fra hver samling godt i sterile 2 ml rør ved pipettering. Hold rør i en -20 ° C fryser før du starter neste trinn. Gjenta trinn 4.1.5-4.1.6 hver 24 time.
- Stopp bioluminescence innspillingen og mediestrømmen ved å klikke på "stopp" -ikonet på tilsvarende programvare. Fjern hettene metalliske og aspirer rest medium fra retter.
- For å normalisere utskilt protein verdiene oppnådd i forskjellige eksperimenter, enten ekstrahere DNA (normalisering av genomisk DNA-innhold for myotubes 19) eller tilsett 1 ml lyserings syre-etanol buffer (normalisering av total hormoninnhold for øyceller 18) til den retter.
- For å forberede perifusion medium, tilsett 100 mikrometer av luciferin til mediet.
5. Måling Islet Hormon og Myokine nivåer i utløpetMedium på kontinuerlig Perifusion of Human Primary endokrine celler
- Insulin
- Kvantifisere basale insulinnivået i utstrømningen medium fra innsamlede tidspunkter ved hjelp av en human insulin enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) sensoren ved å følge produsentens instruksjoner.
- Normaliser data til det absolutte volum av oppsamlet medium i hver brønn, og til den totale insulininnholdet, ekstrahert fra syre-etanol behandlede celler ved slutten av eksperimentet (trinn 4.1.9) 18.
- Interleukin-6 (IL-6)
- kvantifisere basal IL-6 nivåer i utstrømningen medium fra innsamlede tidspunkter ved hjelp av en human IL-6 ELISA kit følge produsentens instruksjoner.
- Normaliser data til det absolutte volum av oppsamlet medium i hver brønn og til genomisk DNA-innhold ved slutten av eksperimentet (trinn 4.1.9).
6. i døgn Datasett Analyser for Bioluminescence og hormon profiler
- bioluminesens Analysis
- Analyser bioluminesens profil ved hjelp av den medfølgende programvaren 19.
- JTK-syklus analyse
- Analyser hormon profiler og bioluminescence opptaksresultat ved hjelp av JTK_CYCLE algoritmen 32.
- Sett circadian periode bredde på 20-24 timer.
MERK: Ved forsøksbetingelsene ble registrert i parallell, kan en paret statistisk analyse utføres for å sammenligne forsøkene.
- CosinorJ Analysis
- Alternativt analysere hormon og biologiske Bioluminescens profiler ved hjelp av CosinorJ programvare 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering av Islet hormon med parallell Circadian Bioluminesens Opptak fra Perifused Menneskelig øyceller
Etter å gi en første molekylær karakterisering av biologiske klokke, operativ i humane øyceller 16, vi tar sikte på å studere virkningen av klokke avbrudd på holmen funksjon og transkripsjon 18. Vi setter opp en effektiv siClock transfeksjon protokollen i spredte menneske øyceller (se protokoll for detaljer), noe som resulterte i mer enn 80% knockdown av KLOKKE mRNA, og i effektiv klokke ablasjon målt ved døgn bioluminesens profilering 18. Glukose-indusert insulin sekresjon (GSIS) analyse avslørte betydelig redusert basale og stimulerte insulinsekresjon ved en slik klokke avbrudd (ikke vist). For å vurdere hormon av menneskelige øyceller rundt-the-clock, en Contintinuerlig perifusion Systemet ble forbundet med et luminometer (vist i figur 1 B). Menneske øyceller, som bærer en funksjonell (siControl) eller dysfunksjonell (siClock) oscillator ble omformet med Bmal1-Luc lentiviral partikler. Celler ble deretter synkronisert med en puls av adenylylcyklase aktivator fulgt av parallell analyse av circadian biolumine og insulin sekresjon inn i utstrømningen medium i løpet av 48 timer (figur 1C, D 18). Disse eksperimentene tyder på at under konstant glukosekonsentrasjon (5,6 mM glukose), insulinsekresjon ved in vitro-synkroniserte humane øyceller viser en circadian profil, som blir forstyrret i siClock peiling prøver (figur 1D).
Studerer Myokine Utskillelse av Human Skeletal Myotubes Synkronisert in vitro i nærvær eller fravær av funksjonell klokke
33, vi tar sikte på å karakterisere døgnrytme i primære humane skjelett myotubes og ved å undersøke deres rolle i myotube funksjon 19. For dette formål ble forstyrrelse av den biologiske klokken i skjelett myotubes oppnås ved å transfektere siRNA målretting KLOKKE. Circadian bioluminesens reporter analyser med Bmal1-luc og Per2-Luc reportere avslørte at menneskelige skjelett myotubes, synkroniserte in vitro, viser en selvoppholdende døgnrytme, som ble ytterligere bekreftet av endogen kjerne klokke transkripsjon uttrykk (figur 2B; 19). Dette endogene klokken ble effektivt forstyrret i nærvær av siRNA rettet mot KLOKKE (figur 2B). Dessuten, den basale sekresjon av IL-6 (figur 2C), interleukin-8 (IL-8)og Monocyte kjemotaktisk protein 1 (MCP-1) (ikke vist) av synkroniserte skjelett myotubes, vurdert ved den her beskrevne perifusion system (figur 1 B) og etterfølgende storskala myokine multipleks-analyse (ikke vist), oppviser en cirkadisk profil, som er sterkt dysregulerte ved klokkeavbrudd (figur 2C 19).
Figur 1: Vurdering av hormon med parallell Circadian Bioluminesens Opptak fra Perifused Menneskelig øyceller (A) representativt bilde av vedlagte humane øyceller en dag etter holme dissosiasjon.. (B) Skjematisk fremstilling av hjemmelaget perifusion system som inkluderer en flaske med perifusion medium, en pumpe, en måleplattform utstyrt med et fotomultiplikatorrør (PMT) i lystett kuvøseEn luminometer enhet, kontrollert av innspillingen programvare, og en halvautomatisk prøve samler. Sett inn: (B1) Tilstrømningen kobler rør; (B2) metallisk cap for 3,5 cm petriskål; (B3) til skrue adapter som festes lokket til måleplattform (B4); (B5) utstrømming kobler rør; (B6) automatisk styrt medium distributør. (C) Menneske øyceller ble transfektert med enten egge siRNA (siControl) eller siRNA rettet mot KLOKKE (siClock) og omformet med Bmal1-Luc reporter. Celler ble stadig perifused med kulturmedium inneholdende 5,6 mM glukose. Circadian bioluminesens ble registrert etter synkronisering av en adenylylcyklase aktivator puls. (D) Insulin nivåer ble vurdert ved hjelp av ELISA i utløpet prøver samlet hver 4 time i løpet av 48 timer. Anvendelse av JTK_CYCLE algoritme 32 bekreftet at i presence av en funksjonell klokke (siControl), den gjennomsnittlige profilen av utskilt insulin var cirkadisk innenfor 48 timer, med en periodelengde på 24,19 ± 0,89 t (** p = 0,009, n = 7 donorer). Dette circadian profilen ble tapt på klokke avbrudd (siClock). Data er presentert som% av utskilt hormon fra total hormoninnhold (gjennomsnitt ± SEM) for n = 7 givere (en replikere for hver donor) .Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 18. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 2:. Basal IL-6 Utskillelse av Human Skjelett Myotubes er sterkt hemmet i fravær av en funksjonell biologiske klokke myoblasts ble transduced med lentiviral partiklerinneholder Bmal1-Luc transgen, differensiert i myotubes, og transfektert med enten siControl eller siClock siRNA. 24 timer etter transfeksjon, ble myotubes synkronisert med en adenylylcyklase aktivator puls og utsatt for kontinuerlig perifusion med parallell bioluminescens opptak. (A) Representative bilder ble tatt på dag 0 (D0) og D7 etter konverteringen fra 20% til 2% FBS inneholdende medium for å indusere differensiering myotubes. Under denne differensieringsprosessen, humane myoblaster blir reorientert, blir langstrakte og smelter sammen for å danne en plurinuclated syncytium. (B) Bmal1-Luc Bioluminescens profiler av siControl -transfected myotubes (svart linje) og siClock -transfected myotubes (grå linje). Bmal1-Luc vibrasjons- profiler ble registrert i tre uavhengige forsøk (en donor per eksperiment). (C) Representant basal IL-6-sekresjonprofil i nærvær eller fravær av en funksjonell klokke. Den perifusion utstrømningen medium ble samlet opp i 4 timers intervaller i løpet av 48 timer (0-4 svarer til akkumulering av IL-6 mellom 0 timer og 4 timer). IL-6 nivåer i mediet, ble undersøkt ved hjelp av ELISA i to tekniske duplikater fra tre uavhengige eksperimenter. Resultatene representerer basal IL-6 nivåer normalisert til det totale DNA-innhold. IL-6 sekresjon ble redusert i gjennomsnitt på 69,30 ± 10,61% ved biologiske klokke avbrudd (gjennomsnitt ± SEM, n = 3; * P <0,05, paret t-test). Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eksperimentelle innstillingene som er beskrevet her er sammensatt av lentiviral levering av circadian Bioluminescens reportere i dyrkede humane primære celler, etterfulgt av påfølgende in vitro synkronisering og kontinuerlig opptak på bioluminesens i flere dager, og parallell analyse av hormonutskillelse av de samme cellene. De representerer en effektiv metode for å utforske molekylære mekanismer og funksjonelle aspekter av biologiske klokka i humane primære celler.
Kvaliteten på det avgivende materiale er en viktig sak for fremstilling av levedyktige primære vevskulturer. Kvaliteten av humane øyer bør evalueres hver gang før start av eksperimentet. Holmer med anslått renhet og / eller levedyktighet dårligere enn 70% er ikke anbefalt for disse eksperimentene. Øyceller har en tendens til å re-etablere kontakter i dissosierte kulturer, som spiller en viktig rolle i deres overlevelse og funksjon. Siden øyceller ikke sprer i cuLTURE, må de være belagt med en høy tetthet, noe som gjør det mulig for cellene å etablere kontakt med naboceller. Dette blir oppnådd ved utsåing av cellene i små dråper av et lite volum. Viktigere er celledød høyere i lav tetthet islet cellekulturer. Legg merke til at mediet erstattet bør utføres så raskt som mulig for å unngå celle tørking.
Myoblaster skal passeres fortrinnsvis ved 60% konfluens, fordi en høyere tetthet kan indusere myoblast differensiering. Etter trypsinering, bør myoblasts nøye resuspendert og spredt for å unngå cellegrupper.
Bakteriell eller soppsporer av primære celler bør utelukkes mikroskopisk før du starter perifusion analysen. Kulturmediet kan være supplert med soppdrepende stoffer. I tillegg bør det perifusion røret skylles med alkohol jod desinfeksjon / sterilt vann og hettene metalliske bør steriliseres ved autoklavering. Disse trinnene er anbefalt mellom hver eXperiment.
For effektiv Bioluminescens opptak, må kvaliteten av reporter lentivirus fremstillingen bli bestemt av intensiteten av bioluminescent signal. Detaljene i lentivirus produksjon inkludert feilsøking kan bli funnet på http://lentilab.unige.ch/. Før plasmid transfeksjon for lentivirus produksjon, bør 293T celler bli belagt på 30-50% samløpet. Det er sterkt anbefalt å utføre en kontroll av transfeksjonseffektiviteten i en parallell fatet, for eksempel ved hjelp av CMV-GFP eller en alternativ fluorescerende lentivector. For hvert virus preparat bør etableres virustiter.
Ettersom de beskrevne eksperimentene er vanligvis langvarig (48 timer eller mer), er det avgjørende å ha stabile stanse i løpet av denne tidsperiode. Konsentrasjonen av siRNA bør optimaliseres, så vel som den cellen konfluens i henhold til den siRNA reagens protokollen. Effektiviteten av genet Slå må testes ved slutten av experiment ved RT-qPCR eller ved Western blotting.
Under perifusion, bestemmer strømningshastigheten den tid som er nødvendig for fullstendig å skifte ut medium i fatet, men har også en mekanisk innvirkning på den primære cellekultur. Faktisk, sette opp strømnings med en hastighet, som er for lav, vil ikke tillate en fullstendig utbytting av medium i fatet, og vil redusere følsomheten av fremgangsmåten. Tvert imot kan en med høy hastighet strømningshastighet skade cellene. I våre hender, har den optimale hastigheten for begge celletyper tillater å samle inn 0,5 ml av utstrømningen medium per 1 time.
Viktigere, for å oppnå en målbar konsentrasjon av stoffer i utstrømningen medium, bør et tilstrekkelig antall celler som utskiller være til stede i den perifused fatet. Oppfølgings metode for påvisning av det utskilte stoff (ELISA eller andre) skal være følsom nok, spesielt for stoffer som utskilles i meget lave konsentrasjoner. Høyere celletetthet kan bli anbefalt å overvinnedette problemet når det er mulig. Alternativt kan utløpet mediet konsentreres ved dialyse eller med sentrifugal-filtere, som beskrevet av oss i detaljer i referanse 19.
Til sammen våre eksperimenter i menneskelige bukspyttkjertel øyceller og i primær myotubes gir for første gang overbevisende bevis for at disse menneskeceller har høy amplitude cellestyrte biologiske klokka 18-19. Anvendelse av den her beskrevne perifusion system kombinert med et luminometer anordning (figur 1B) har vi vist at disse klokker spille en viktig rolle i den biologiske reguleringen av basal insulinsekresjon av pankreas øyceller (fig 1 D), og av basal IL6 sekresjon av skjelett myotubes (Figur 2C). Videre, ved å slå ned i kjernen klokke-genet KLOKKE i begge eksperimentelle systemer, viser vi at en funksjonell circadian oscillator er nødvendig for riktig rytmisk insulin og IL-6-sekresjonav menneskelig holmen og skjelettmuskelceller, henholdsvis (Tall 1C, D og 2B, C). Våre resultater tyder på en kritisk rolle i den menneskelige holmen klokke for riktig insulin sekresjon, og er i god overensstemmelse med arbeider utført i gnagermodeller genetiske 15,17. Gitt den store rollen som den biologiske klokke i slik at organismer å forutse daglige miljøendringer i stedet for å reagere på dem, kan circadian regulering av basal insulin og myokine sekresjon representere en slik forutse mekanisme som koordinerer bukspyttkjertelen holmen og skjelettmuskel sekretoriske aktiviteter til resten- aktivitet syklus av hele kroppen.
Den her foreslått metodikk kan enkelt endres for å studere ekstra hormon fra samme vev. Vi har allerede analysert et ekstra stort panel av myokines utskilt av skjelettmuskelceller, ved hjelp av multipleks humane myokine matriser 19, og vi er i ferd med å vurdereing glukagon sekresjon av humane øyceller ved hjelp av Glucagon ELISA-sett (data ikke vist). Videre kan disse forsøksbetingelsene være optimalisert for andre celletyper, for eksempel primære adipocytter, for å studere adipokin sekresjon, primære thyrocytes for å studere thyroid hormon sekresjon, primære enterocytter for å studere inkretinene sekresjon, etc. En annen viktig anvendelse av dette system kan være å utforske virkningen av fysiologiske og / eller farmakologiske forbindelser på cellulær biologiske klokke funksjon og sekresjon. Forbindelsen av interesse kan påføres kontinuerlig gjennom hele forsøket (for eksempel studerer insulinsekresjon av humane øyceller i nærvær av høye glukose eller forskjellige nivåer av frie fettsyrer), eller forbindelsen kan tilsettes i en valgt fase av circadian syklus.
Denne teknikken har begrensningene i en in vitro-studie og representerer ikke kompleksiteten av døgnrytmen forskriftenningen på en hel kropp nivå. På samme tid, hjelper det til å skille rollen som en autonom klokke på cellulær metabolisme under kontrollerte forhold. For tiden tilgjengelige metoder er basert på øyeblikksmålinger av sekresjon aktivitet i cellene eller explants følgende in vitro synkronisering 17. Protokollen er beskrevet her, representerer en unik fremgangsmåte som tillater en overensstemmende og kontinuerlig analyse av døgnrytmen og sekretorisk aktivitet i den samme cellekulturen. Alternativt kan denne metoden anvendes til å studere kinetikken av ikke-cirkadianske bioluminescerende reportere, i forbindelse med celle sekresjon, så vel som for å detektere virkninger av forskjellige stoffer tilsatt til perifusion medium på cellefunksjonen. De kritiske trinnene i protokollen er: 1) effektiv lentivirus fremstillingen, 2) effektiv celle transfeksjon med siRNA og reporter vektorer transduksjon; 3) konstant medium utstrømming innsamling og 4) å sørge for at et tilstrekkelig antall cells blir brukt for å oppnå målbare nivåer av hormoner eller cytokiner i det oppsamlede utstrømningen medium (se den feilsøking ovenfor).
I lys av nylige bevis på sammenhengen mellom biologiske klokke forstyrrelser og metabolske sykdommer og kreft hos mennesker 3-4,28,34-35, studerer humane perifere klokke eiendommer i primærkulturer kan representere en viktig og unik tilnærming for å forstå potensialet klokken tilkobling til disse sykdommene. Dermed vår oppdagelse av at det foreligger forbindelser mellom funksjonell menneskelig bukspyttkjertelen holmen og skjelettmuskel klokke og basal sekresjon av insulin og myokines, kan bære potensielle konsekvenser for forståelsen av utviklingen av kroniske sykdommer, for eksempel overvekt og type 2-diabetes 18-19 og vil bringe nye veier ved behandling av disse sykdommene. Viktigere, på grunn av den etablerte korrelasjon mellom in vitro anslåtte oscillator egenskaper og in vivo- 36, implikasjon av menneskelige biologiske klokke egenskaper som et kjennetegn på sykdommer, er av høyeste og umiddelbar klinisk relevans 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for at våre kolleger fra Universitetet i Genève: Jacques Philippe for konstruktive kommentarer til dette arbeidet, Ueli Schibler for uvurderlig hjelp med utviklingen av perifusion system og for vitenskapelig inspirasjon, André Liani for å ha unnfanget design, produksjon og ferdigstilling av perfusjon system, Lesa-Technology LTD selskap for bistand i perifusion system og Drip-biolumicorder programvareutvikling, George Severi for å få hjelp med perifusion eksperimenter, Ursula Loizides-Mangold for kritisk lesing av manuskriptet, og Anne-Marie Makhlouf for lentivirus forberedelser ; til Etienne Lefai, Stéphanie Chanon og Hubert Vidal (INSERM, Lyon) for å forberede menneske primære myoblasts; og til Domenico Bosco og Thierry Berney (menneskelig Islet Transplantasjon Center, Genève universitetssykehus) for å gi menneskelige holmer. Dette arbeidet ble finansiert av den sveitsiske National Science Foundation Grant No. 31003A_146475 / 1, Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur diabète, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny og Société académique de Genève (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al.
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H.
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A.
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E.
- Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
