Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54673
Automatic Translation
*1, *2, *1, 1
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital
* These authors contributed equally

Abstract

שעוני יממה הם פונקציונליים בכל היצורים רגישים לאור, המאפשרים עיבוד לעולם החיצוני על ידי צופה שינויים סביבתיים יומיים. התקדמות ניכרה בהבנת הקשר ההדוק בין השעון הביולוגי ואת רוב ההיבטים של פיזיולוגיה נעשתה בתחום בעשור האחרון. עם זאת, לחשיפת הבסיס המולקולרי העומד בבסיס הפונקציה של מתנד היממה בבני אדם נשאר של האתגר הגבוה ביותר טכנית. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של גישה ניסויית לטווח ארוך (2-5 ימים) הקלטת פליטת אור ואיסוף בינוני יצוא ב תאים ראשוניים אדם מתורבתים. לשם כך, יש לנו transduced תאים ראשוניים עם כתב בלוציפראז lentiviral כי הוא תחת שליטה של ​​מקדם גן שעון ליבה, אשר מאפשר הערכה במקבילה של הפרשת הורמון פליטת אור יממה. יתר על כן, אנו מתארים את התנאים לשבש את השעון הביולוגי בתחום יחסי הציבורתאים אנושיים imary ידי transfecting CLOCK מיקוד siRNA. התוצאות שלנו על תקנת היממה של הפרשת אינסולין על ידי איי לבלב אנושיים, ואת הפרשת myokine ידי תאי שריר שלד אנושיים, מובאות כאן כדי להדגים את יישום מתודולוגיה זו. הגדרות אלה יכולים לשמש כדי לחקור את האיפור המולקולרי של שעונים היקפים אדם כדי לנתח את השפעת הפעילות שלהן על תאים ראשוניים בתנאים פיסיולוגיים או pathophysiological.

Introduction

מערכת תזמון היממה (מלטינית "Circa דיאם") התפתחה בכל היצורים הרגישים לאור, כמו מנגנון הסתגלות לכיוון הסיבוב העצמי של כדור הארץ. ביונקים, היא מאורגנת באופן היררכי, המקיפה את השעון המרכזי, אשר ממוקם בגרעין suprachiasmatic של ההיפותלמוס הגחון, ואת פריפריה (או עבדים) מתנדים כי הם פעילים באיברים שונים. יתר על כן, מתנדים העצמיים מתמשך אוטונומית תאים אלה הם פונקציונליים כמעט בכל תא בגוף 1. אותות photic לייצג אות סינכרון דומיננטי (צייטגבר) עבור נוירונים SCN, ואילו אותות עצביים הלחות הנפלט SCN לאפס את השעונים ההיקפיים. במקצבים שאר-פעילות בנוסף, שמניעים במחזורי האכלה-צום בתורם, הם synchronizers נוסף על שעונים היקפיים 2. לפי ההבנה הנוכחית שלנו, את האיפור המולקולרי של שעון הליבה מבוסס על תעתיק ו Translaלולאות משוב תזונתיות, אשר שמורות בין אורגניזמים. מהווה את activators תעתיק BMAL1 ושעון, אשר יחד להפעיל שעתוק של גני PER ולבכות שעון ליבה השליליים. רמות גבוהות של PER וחלבוני CRY תמנענה שעתוק שלהם באמצעות עיכוב של מתחם BMAL1 / שעון. בלופ עזר מורכב של קולטנים הגרעיניים REV-ERBs ו RORs, אשר גם לווסת את השעתוק של BMAL1 ושעון. יתר על כן, אירועי posttranslational כוללים זירחון, sumoylation, acetylation, O-GlcNAcylation, שפלה וכניסת גרעין של חלבוני שעון הליבה מייצגים שכבה רגולטוריות חשובה נוספת בביסוס מחזור התנודה 24 שעות 3.

ראיות מצטברות נובעות ממחקרים במודלים של מכרסמים ומדגישות את התפקיד הקריטי של מערכת היממה בתיאום פונקציות מטבוליות האנדוקרינית 4-5. מספר largדואר בקנה מידה ניתוח transcriptome עולה כי האכלה - צום מחזורים לשחק תפקיד מרכזי הסנכרון של מתנדים היקפי 6-8. בהסכם עם המחקרים הללו, metabolomic וניתוח lipidomic במכרסמים ובבני אדם חשפו כי מספר רב של מטבוליטים להתנדנד ברקמות, פלזמה, ורוק באופן היממה 9-11. חשוב לציין, רוב ההורמונים להפגין מקצבי היממה בדם 5,12-13. יתר על כן, שעוני יממה של ההורמון המקביל בייצור רקמות היקפיות עשויים לווסת הפרשת הורמון מקומי. תאים אוטונומיים מתנדים יממה תוארו מכרסם ותאי לבלב אנושיים 14-16. מתנדים אלה ממלאים תפקיד חיוני בוויסות transcriptome לבלב ולתפקד 15,17-18. יתר על כן, הפרשת myokine ידי myotubes השלד האנושי הודגמה לאחרונה להציג דפוס היממה, אשר מווסתת על ידי oscillato תאים אוטונומייםrs פעיל בתאים אלה 19.

מספר גישות ללימוד מקצבי יממה בבני האדם in vivo היו בשימוש נרחב. למשל, מלטונין פלזמה או רמות קורטיזול וכן טמפרטורת פני עור החזי (הנסקרת ב אזכור 3,20) נחקר להעריך שעוני יממה אנדוגני. למרות ששיטות אלו מאפשרות ללמוד תנודות יממה מערכתיות in vivo, הם רחוקים מלהיות מספקים הערכה אמינה של מקצבי יממה אוטונומיים חופשיים פועלים באיברים וברקמות שונים. אף על פי כן, דיסקציה כזה מן הרגולציה המערכתית תהיה כלי חיוני להבנת ההשפעה הספציפית של שעון מולקולרי תאי על תפקודם של תאים אלה. לכן, במאמץ ניכר, שבו בוצע עד לפתח גישות אמינות לחקר שעוני אדם תאים בתרבית הנציחו או עיקריים המסונכרנים במבחנה. חשוב לציין, זה הוכח כימאפייני שעון נמדדים תאי פיברובלסטים עור בתרבית ראשוניים מקרוב לשקף את מאפייני שעון הפרט של האורגניזם כולו 21. התפתחות כתבי יממת פלורסנט bioluminescent מאוד התקדמה גישה זו 22-27. יתר על כן, שעוני תא ראשוניים לומדים כי נגזרים איברים היקפיים שונים מאפשרים חקירת התכונות המולקולריות של שעוני רקמות ספציפיות אדם 3,5,16,19-20,28. לפיכך, הערכת שעוני יממת explants הראשוני במבחנה מסונכרנת או תאים, באמצעות כתבי bioluminescent, מייצג שיטה שימושית מאוד ללמוד את האיפור המולקולרי של שעונים היקפים אדם והשפיעו על תפקוד איברים.

במאמר זה, נציג פרוטוקולים מפורטים להערכת ביטוי גני יממה בתאי איון עיקרי אדם שריר השלד מסונכרן במבחנה, כמו גם את ההשפעה של שעון סלולארי אוטונומיהפרעה על תפקוד הפרשה של תאים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: מניפולציות הכלולים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי ז'נבה ועל ידי IV EST ועדת SUD האתי (סכם 12/111) 19. איי אדם בודדו לבלב התורמים מוות מוחי רב-איבר מרכז ההשתלות איילט בבית החולים האוניברסיטאי של ג'נבה (שווייץ) כפי שתואר על ידי אותנו אזכור 16,18, או להשיג ממקור מסחרי.

1. הכנת תרבית תאים ראשונית

  1. בידוד איילט הלבלב האנושי, דיסוציאציה והתרבות
    הערה: מעיל כל צינור, קצה פלסטיק או פיפטה עם קונוט רפואי מעבדות המחקר (CMRL) בינוני כדי למנוע איים או תאים איון יידבקו אל פני השטח פלסטיק, מה שעלול להוביל לאובדן משמעותי של חומר התא.
    1. יום אחד לפני איון תא דיסוציאציה להוסיף 1 מ"ל של תאי מטריקס laminin-5-עשיר (נגזר 804G תאים כמו descriמיטת התייחסות 29) לכל צלחת 3.5 סנטימטר. לפני ציפוי תאים, לשאוב את מטריקס ולשטוף המנה 3 פעמים עם מים דו-distillated סטרילי. אפשר צלחת לייבוש מתחת לארון זרימה למינרית במשך 5 דקות.
    2. בתוך בארון זרימה למינרית, להפיץ איים שהושג עם המדיום CMRL לתוך 15 מ"ל צינור (ים). צנטריפוגה ב 272 XG במשך 5 דקות.
    3. לשאוב supernatant, ולאחר מכן resuspend גלולה ב 1 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט של סטרילית Dulbecco (DPBS) מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס ללא סידן ומגנזיום. צנטריפוגה ב 272 XG במשך 5 דקות.
    4. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של DPBS.
    5. כדי לספור את המספר הכולל של איים, pipet 10 μl ההשעיה איון 1 מ"ל לתוך 3.5 ס"מ מנה חדשה. ספירת איים על ירידה של כ -10 μl מתחת למיקרוסקופ ומתוך זה לחשב את המספר הכולל של איים ההשעיה איון 1 מ"ל. להוסיף 14 מ"ל של DPBS ו צנטריפוגות ההשעיה תא אחד יותרזמן קצר 272 XG במשך 5 דקות.
    6. עבור תא דיסוציאציה איון, לשאוב supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק התא לתקופה מקסימלית של 1,000 ושווי איון (IEQ). מניחים את הצינור בתוך אמבט מים ב 37 ° C בעדינות מערבבים את איים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים בכל דקה, במהלך 6-10 דקות.
      הערה: כדי לבדוק את איכות העיכול, pipet ירידה של 2 μl של השעיה על זכוכית שקופית ולבדוק תחת מיקרוסקופ שכל התאים מופרדים היטב, וכי אין כפילויות או גוש תאים נותרו.
    7. עצור את התגובה על ידי הוספת 14 מ"ל של קר CMRL עם ספקים (10% בסרום שור העובר (FBS), 1% של dipeptide L-alanyl-L- גלוטמין, 1% פניצילין, סטרפטומיצין (P / S), 1% gentamycin, 1 פירובט נתרן%). צנטריפוגה ב 425 XG במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 15 מ"ל של מדיום CMRL אל התא גלולה.
    8. Resuspend גלולה בנפח קטן של CMRL עם ספקים. ספירת התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytoמטר, להתאים את עוצמת הקול CMRL כדי להשיג ריכוז התא של ~ 650, 000 תאים / מ"ל.
    9. Pipet 3 מופרדים טיפות של 100 μl כל מן ההשעיה תא התפזרו שהושגו בשלב 1.1.8 בצלחת 3.5 ס"מ מצופה מראש עם laminin.
      הערה: תאים לצרף צלחת ב כ -24 שעות.
    10. דגירת תאים (איור 1 א) בתוך חממה בתרבית רקמה על 37 מעלות צלזיוס בתא לח. שינוי המדיום של תא טיפות כל 2-3 ימים על ידי aspirating 100 μl מכל טיפה וטיפה והחלפתו הנפח הזהה של מדיום חדש.
  2. תרבות myoblast ראשונית אדם ומבחין לתוך myotubes
    1. דגימת רקמה, בידוד תא בלווין תרבות myoblast
      הערה: ביופסיות שריר התקבלו מהקבוצה של אטיין Lefai (INSERM, ליון, צרפת) 19.
      1. לטהר myoblasts השלד הראשוני בהתאם לנוהל שתואר לעיל 30.
    2. התמיינות pmyoblasts האדם rimary לתוך myotubes
      1. קח בקבוקון אחד (1 x 10 6 תאים) של myoblasts האנושי מאוחסן בחנקן נוזלי להפשיר תאים במהירות על ידי הצבת את הבקבוקון למשך 30 שניות עד 1 דקות באמבט מים ב 37 ° C עם תסיסה.
      2. Pipet התאים (1 מ"ל) לתוך 24 מ"ל של מדיום הגידול מורכב HAM F-10 השלימו עם 20% FBS, 1% P / S, 0.5% gentamycin ו- B. amphotericin 0.2%
      3. צנטריפוגה 5 דקות ב 150 x ז.
      4. הסרת תאים supernatant ו resuspend עם 15 מ"ל של מדיום הגידול טריים לכל 2.5 x 10 5 תאים.
      5. פלייט לפחות 2.5 x 10 5 תאים לכל בקבוק חסיד F75. שמור את myoblasts חממת תא ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
      6. לאחר התאים מגיעים 60-80% confluency, לנתק את התאים עם טריפסין-EDTA 0.05% למשך 1-2 דקות צלחת אותם ב 2 מ"ל של מדיום הגידול על מנות חסיד 3.5 ס"מ פטרי.
      7. לאחר שהגיע למפגש, הסר את מדיום הגידול.
      8. הפעל את פרוטו הבידולcol של myoblasts האדם לתוך myotubes ידי culturing אותם 2 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 1 גרם / ליטר של גלוקוז, 2% FBS, 1% P / S, 0.5% gentamycin ו -0.2% amphotericin B (בינוני בידול) חממת תא 37 ° C ו 5% CO 2. שנה את בינונית כל 2 עד 3 ימים.
        הערה: myotubes בדרך כלל נוצר תוך 7-10 ימים.
      9. בדוק התמיינות תאים שריר מתחת למיקרוסקופ (איור 2 א) על ידי התבוננות היתוך של myoblasts לתוך myotubes polynucleated 19.

2. RNA התערבות קטנה (siRNA) Transfection

  1. siRNA Transfection של תאי איילט אנוש
    הערה: פרוטוקול transfection מתבצע טיפות של 100 μl ביום הבא לאחר ניתוק התא (שלבים 1.1.1-1.1.10).
    1. לשאוב 100 μl של המדיום CMRL מכל טיפה וטיפה ולהחליפה נפח זהה של בינוני Essential מינימלי ללא בסרום (MEM) 2 hrלפני transfection ידי pipetting.
    2. להכין תערובת MEM המבוסס של מגיב transfection ו -50 ננומטר של היעד siRNA (siClock) או 50 ננומטר של ללא מיקוד siControl פי הוראות היצרן.
      1. לקבלת מנה אחת עם 3 טיפות להכין שני צינורות 1.5 מ"ל עם 200 μl של כל MEM.
      2. הוסף אחד של צינורות אלה 4 μl של מגיב transfection.
      3. הוסף את μl צינור 1 השני של של פתרון המניות siRNA המתאים (20 מיקרומטר).
      4. להתסיס שתי אלה צינורות לאט על שייקר מסלולית במשך 5 דקות ולאחר מכן מערבבים את התוכן של הצינורות יחד ו להתסיס במשך 20 דקות יותר.
    3. לשאוב 100 μl של ממ מכל טיפה וטיפה ולהחליפה באותו נפח של תערובת transfection שהושגו בשלב הקודם על ידי pipetting.
    4. החלף את פתרון transfection עם מדיום CMRL לאחר 4 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.3 למחרת מחדש transfection התא.
  2. siRNA Transfection של myotubes אנוש
    1. לפני transfection, להחליף את מדיום (ראה שלב 1.2.2.8) עם 2 מ"ל של מדיום בידול טריים לכל 3.5 ס"מ פטרי צלחת.
    2. בתוך צינור 1.5 מ"ל סטרילי, להכין תערובת של 20 ננומטר siRNA (siControl או siClock), אשר תואמת 2.4 μl של פתרון siRNA 20 מיקרומטר, ו -12 μl של מגיב transfection מדולל 100 μl של מדיום בידול. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עם תסיסה עדינה.
    3. תאים Transfect עם 114.4 μl של תמהיל siRNA לכל 3.5 ס"מ פטרי תאים בצלחת ומניחים בתוך אינקובטור בתרבית רקמה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות.

3. הקלטה פליטת אור היממה לטווח ארוך רציף הנערכת במקביל להערכת הפרשת הורמון בתאים ראשוניים אדם חי

  1. היכרות עם כתבי פליטת אור יממה לתוך תאים ראשוניים אדם על ידיתמרת lentiviral
    הערה: כל הנהלים עם חלקיקי lentiviral חייבים להתבצע במתקן ברמה 2 בטיחות ביולוגי לנקוט אמצעי זהירות נוספת לעבודה עם סוכנים המהווים סכנה פוטנציאלית מתונה לאנשים ואיכות הסביבה.
    1. הכן חלקיקים lentiviral הכתב על ידי שיתוף transfecting וקטור pLenti6.4 עניין / R4R2 / V5-DEST / Bmal1 לוק או pLV156-Per2-dLuc (המכונה Bmal1-לוק Per2-לוק, בהתאמה,) פלסמיד 31 עם וקטורים lentiviral pMD2G ו psPAX לתאים 293T בשיטת polyethylenimine (עבור נוהל מפורט ראה התייחסות 16).
    2. לכיל את חלקיקי lentiviral שהושגו (פרטים על טיטרציה ניתן לקבל http://lentilab.unige.ch/). עבור ניסויים נוספים, השתמש lentiviruses עם טיטר החל אפריל 10 - מאי 10 יחידות transducing [TU / μl].
    3. מאכל מקום עם תאי איון אדם או myoblasts האדם (ב 30-50% confluency) בתוך תא הזרימה למינריתet ולהחליף בינוני עם 2 מ"ל של מדיום חדש CMRL בתוספת (ראה שלב 1.1.7) או מדיום הגידול (ראה שלב 1.2.2.2), בהתאמה.
    4. חישוב ריבוי זיהום (משרד הפנים) (חלקיקים זיהומיות כלומר (transducing יחידות) / מספר התאים).
    5. Transduce תרבות התא הראשונית על ידי pipetting פתרון lentivirus כדי בצלחת כדי לקבל משרד פנים = 3 (למשל, עבור 65,000 תאים מצורפים להוסיף 3 μl של פתרון הווירוס עם כייל של 6.5 x 10 -4 עד 100 ירידה בינונית μl).
    6. דגירה לילה חממה בתרבית רקמה. שנה בינונית למחרת.
      הערה: transduce תאי איון אדם לפחות 4 ימים לפני הקלטת פליטת אור על מנת להשיג ביטוי מספיק של לבנות את הכתב. Myoblasts הם transduced בשלב ההתרחבות, אז גדל מפגש, ובהמשך מובחן לתוך myotubes.
  2. במבחנת הסנכרון של תאים ראשוניים אדם
      <li> להוסיף 10 מיקרומטר של מפעיל cyclase adenylyl ב 2 מ"ל של מדיום לכל 3.5 ס"מ פטרי צלחת המכילה תאים ראשוניים transduced בעבר בשלב 3.1.5.
    1. דגירה של 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים.
    2. שינוי המדיום המכיל את מפעיל cyclase adenylyl עם 2.5 מ"ל של המדיום הקלטה המכיל 100 מיקרומטר לוציפרין.
      הערה: עבור תאים איון אדם להשתמש CMRL בתוספת 10% FBS, 1% L-alanyl-L- גלוטמין dipeptide, 1% P / S, 1% gentamycin; עבור myotubes האדם להשתמש פנול אדום - DMEM חינם עם 1 גרם / גלוקוז L בתוספת 2% FBS, 2% L-alanyl-L- גלוטמין dipeptide, 1% P / S, 0.5% gentamycin ו- B. amphotericin 0.2%

4. הערכה מקבילה של הקלטת פליטת אור יממה ופרופילי הפרשת הורמון בתאים ראשוניים פרשת אדם המסונכרן

  1. הגדרה לטווח ארוך קונסטנט Perifusion הקלטת פליטת אור עבור תאים ראשוניים אדם.
    הערה: כאשר פסקים עובדיםIDE בארון זרימה למינרית, נקו את כל משטחי מגע ולהגביל חשיפה של תרבויות או בינוני עד באוויר כדי למנוע זיהום.
    1. כדי להכין את המדיום perifusion, להוסיף 100 מיקרומטר של luciferin למדיום.
      הערה: עבור תאים איון אדם להשתמש CMRL בתוספת 10% FBS, 1% L-alanyl-L- גלוטמין dipeptide, 1% P / S, 1% gentamycin; עבור myotubes האדם להשתמש פנול אדום - DMEM חינם עם 1 גרם / גלוקוז L בתוספת 2% FBS, 2% L-alanyl-L- גלוטמין dipeptide, 1% P / S, 0.5% gentamycin ו- B. amphotericin 0.2%
    2. בתוך בארון זרימה למינרית, לפתוח את 3.5 ס"מ מנות המכיל את בתרביות תאים ראשוניים transduced, טרנספקציה מסונכרן (תאים איון או myotubes) כפי שתואר לעיל. הכנס כמוסים מתכתי סטרילי (שפותח בבית) (איור 1B2) לתוך מנות 3.5 סנטימטרים המצוידות זרם סיליקון / צינורות חיבור בזרימה (איור 1B1 / B5).
    3. מניחים את הכלים על פלטפורמת והמדידה l 37 ° Cight חזק חממה. תקן את הכלים לפלטפורמה באמצעות מתאם screwable (איור 1B3). הכנס את צינורות זרם / בזרימה של מערכת perifusion לתוך צינורות סיליקון המתאימים של הכובע (איור 1B1 / B5) ולהגדיר את המהירות של המשאבה בקצב זרימה של ~ 0.5 מיליליטר של מדיום לכל 1 hr.
    4. פתח את שפותחו באופן עצמי התוכנה בטפטוף-biolumicorder שמתעדת את אותות מהצינור מכפיל (PMT) גלאי. בחר את הספרייה שבה הנתונים יאוחסנו ולהתחיל פליטת אור רציף הקלטת כל מנה על ידי לחיצה על הסמל "התחל".
      הערה: לחילופין לתוכנה בטפטוף-biolumicorder, תוכניות אחרות (למשל LumiCycle), שניתן להשתמש בהם כדי להקליט אותות גלאי PMT.
    5. מניחים צלחות תרבית הרקמה 6-גם סטרילי בתיבה אוסף על הקרח.
    6. פתח את תוכנת בקרת שולט העיתוי של הבורר האוטומטי בין הבארות האוספות. הגדרת זמן window של אוסף בינוני (sec). התחל אוסף של המדיום יצוא כל 4 שעות (14,400 שניות; ~ 2 מ"ל לכל נקודת זמן) על ידי לחיצה על סמל "לרוץ".
    7. העבר ולמדוד את מדיום יצוא מכל אוסף היטב לתוך 2 סטרילי מ"ל הצינורות על ידי pipetting. שמור צינורות במקפיא -20 מעלות צלזיוס לפני תחילת השלב הבא. חזור על שלבים 4.1.5-4.1.6 כל 24 שעות.
    8. עצור את הקלטת פליטת אור ואת הזרימה הבינונית על ידי לחיצה על הסמל "עצור" על התוכנה המתאימה. הסר את הפקקים המתכתיים לשאוב את המדיום שיורית מן הכלים.
    9. על מנת לנרמל את ערכי חלבון המופרש שהושגו בניסויים שונים, או לחלץ DNA (נורמליזציה לפי תוכן הדנ"א הגנומי myotubes 19), או להוסיף 1 מ"ל של חיץ חומצה אתנול תמוגה (נורמליזציה לפי תוכן הורמון הכולל תאים איון 18) אל כלי אוכל.

5. איילט הורמון ו Myokine מדידת רמות היצואבינוני מתקבל על ידי Perifusion בלתי פוסק של תאי האנדוקרינית ראשוני אדם

  1. אִינסוּלִין
    1. לכמת רמות אינסולין בזאלי במדיום היצוא מהעת-נקודות הנצברות באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked אינסולין אנושי ערכה (ELISA) בעקבות הוראות היצרן.
    2. לנרמל את נתוני הנפח המוחלט של מדיום שנאסף בכל טוב ואל תוכן האינסולין הכולל, מופק בתאים שטופלו בחומצה-אתנול בסוף הניסוי (שלב 4.1.9) 18.
  2. Interleukin-6 (IL-6)
    1. לכמת הבסיס IL-6 רמות בטווח הבינוני היצוא מהעת-נקודות הנצברות באמצעות ערכת ELISA אדם IL-6 בהתאם להוראות היצרן.
    2. לנרמל את נתוני הנפח המוחלט של מדיום שנאסף כל טוב לתוכן הדנ"א הגנומי בסוף הניסוי (שלב 4.1.9).

6. ניתוח בסיס נתוני יממה עבור Bioluminesדעך ופרופילי הפרשת הורמון

  1. ניתוח פליטת אור
    1. לנתח פרופיל פליטת אור באמצעות התוכנה המצורפת 19.
  2. ניתוח JTK מחזור
    1. לנתח פרופילי הפרשת הורמון ותוצאות הקלטת פליטת אור באמצעות אלגוריתם JTK_CYCLE 32.
    2. הגדר את רוחב תקופת היממה ב 20-24 שעות.
      הערה: במידה תנאי הניסוי נרשמו במקביל, ניתוח סטטיסטי לזווג ניתן לבצע כדי להשוות את הניסויים.
  3. ניתוח CosinorJ
    1. לחלופין, לנתח את הפרשת הורמון ופרופילי פליטת אור יממה באמצעות תוכנת CosinorJ 28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכת הפרשת הורמון איילט עם יממה במקביל הקלטת פליטת אור מן Perifused איילט אדם תאים

לאחר מתן אפיון מולקולרי ראשון של השעון הביולוגי, פעיל בתאי איון אדם 16, אנו שמטרתה הבוחן את השפעת שיבוש שעון על תפקוד איון שעתוק 18. הקמנו פרוטוקול transfection siClock יעיל בתאי איון אדם מפוזרים (ראה פרוטוקול לפרטים נוספים), אשר הביא יותר מ -80% מציאה של mRNA השעון, אבלציה שעון היעילה כפי שהיא נמדדת על ידי פרופיל פליטת אור יממת 18. גלוקוז מושרה הפרשת אינסולין (GSIS) הניתוח גילה ירידה משמעותית בסיס, הפרשת אינסולין על שיבוש שעון כאלה (לא מוצג). כדי להעריך הפרשת הורמון ידי תאי איון אדם מסביב שעון, Contin מערכת perifusion uous חובר luminometer (מתואר באיור 1B). תאים אנושיים איון, ועליו תפקודי (siControl) או לא מתפקד (siClock) מתנד היו transduced עם Bmal1 לוק חלקיקי lentiviral. תאים לאחר מכן סונכרנו עם דופק של מפעיל cyclase adenylyl ואחריו ניתוח מקביל של פליטת אור יממה ואת הפרשת אינסולין לתוך מדיום היצוא במהלך 48 שעות (איור 1 ג ', ד' 18). ניסויים אלה מראים כי תחת ריכוז סוכר הפיזיולוגי קבוע (גלוקוז 5.6 מ"מ), הפרשת אינסולין על ידי תאי איון אדם מסונכרנים במבחנה מפגינה פרופיל יממה, אשר מופר בדגימות נושאות siClock (1D איור).

לימוד הפרשת Myokine ידי אדם שלד myotubes המסונכרן במבחנה בנוכחות או בהעדר של שעון פונקציונלי

s = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> לאור התפקיד הפוטנציאלי של השעון שרירי השלד בוויסות חילוף החומרים של הגלוקוז במכרסמים 33, אנו שמטרתה המאפיינת מקצבי היממה ב השלד האנושי העיקרי myotubes ו על מנת לבדוק את תפקידם בתפקוד myotube 19. לשם כך, שיבוש השעון הביולוגי ב myotubes השלד הושג על ידי transfecting CLOCK מיקוד siRNA. מבחני כתב פליטת אור יממה עם Bmal1-לוק Per2 לוק כתבים גילו כי myotubes שלד האנושי, מסונכרן במבחנה, להפגין מקצב צירקדי עצמי מתמשכת, אשר אושר עוד יותר על ידי ביטוי תמליל שעון ליבת אנדוגני (איור 2B; 19). שעון אנדוגני זה שובש ביעילות בנוכחות CLOCK מיקוד siRNA (איור 2 ב). יתר על כן, הפרשת הבסיס של IL-6 (איור 2 ג), interleukin-8 (IL-8)ו מונוציטים Chemotactic 1 חלבון (MCP-1) (לא מוצג) על ידי myotubes השלד מסונכרן, מוערך על ידי מערכת perifusion המתואר כאן (איור 1B) וניתוח זמנית בקנה מידה גדול לאחר myokine (לא מוצג), מציגה פרופיל היממה, שהוא בתוקף dysregulated על שיבוש השעון (איור 2 ג 19).

איור 1
איור 1: הערכה של הפרשת הורמון עם מקבילי יממת פליטת אור הקלטה מתוך Perifused האדם איילט תאים (א) תמונת נציג של תאי איון אדם מצורפים יום אחד לאחר ניתוק איון.. (ב) סכמטי מצגת של מערכת perifusion תוצרת הבית הכוללת בקבוק עם מדיום perifusion, משאבה, פלטפורמת מדידה מצוידת צינור מכפיל (PMT) בתוך האינקובטור האור החזקהמכשיר, luminometer, שבשליטת תוכנת הצריבה, ואספן מדגם אוטומטי. הכנס: (B1) פליטת חיבור צינור; (B2) כובע מתכת צלחת 3.5 ס"מ פטרי; (B3) מתאם screwable שמתחבר את הכובע לפלטפורמת המדידה (B4); (B5) בזרימת חיבור צינור; (B6) אוטומטית מבוקרת מפיץ בינוני. (ג) תאי איון אדם היו transfected עם או מקושקש siRNA (siControl) או siRNA מיקוד CLOCK (siClock) ו transduced עם כתב Bmal1-לוק. תאים היו perifused כל זמן עם מדיום תרבות המכיל 5.6 גלוקוז מ"מ. פליטת אור יממה נרשמה בעקבות סנכרון ידי דופק מפעיל cyclase adenylyl. (ד) רמות אינסולין הוערכו על ידי ELISA בדגימות היצוא הנאספים מדי hr 4 במהלך 48 שעות. יישום של אלגוריתם JTK_CYCLE 32 אישר כי presence של שעון פונקציונלי (siControl), הפרופיל הממוצע של אינסולין המופרש היה יממה בתוך 48 שעות, עם אורך תקופת 24.19 ± 0.89 HR (** p = 0.009; n = 7 תורמים). פרופיל היממה זו נעלמה מעיניהם שיבוש השעון (siClock). נתונים מוצגים כפי% של הורמון מופרש מתוכן ההורמון הכולל (ממוצע ± SEM) עבור n = 7 תורמים (לשכפל אחד לכל תורם) דמות .זה יש הבדל בין התייחסות 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה דמות.

איור 2
איור 2:. Basal IL-6 הפרשה ידי אדם שלד myotubes מעוכב בתוקף בהעדר שעון יממה פונקציונלי myoblasts היו transduced עם חלקיקי lentiviralהמכיל את הגן Bmal1-לוק, מובחן לתוך myotubes, ו טרנספקציה עם או siControl או siClock siRNA. 24 שעות לאחר transfection, myotubes סונכרנו עם דופק מפעיל cyclase adenylyl נתון perifusion רציף עם הקלטה פליטת אור במקביל. (א) תמונות נציג נלקחו ביום 0 (D0) ו D7 בעקבות מתג מ -20% ל 2% FBS המכיל בינוני להשרות התמיינות myotubes. במהלך תהליך ההתמיינות, myoblasts האדם ההתמצאות, להיות מאורך הפתיל יחד כדי ליצור syncytium plurinuclated. (ב) Bmal1 לוק פרופילי פליטת אור של siControl -transfected myotubes (קו שחור) ו siClock -transfected myotubes (קו אפור). פרופילי תנודה-לוק Bmal1 נרשמו שלושה ניסויים בלתי תלויים (תורם אחד לכל ניסוי). (C) הבזליים נציג הפרשת IL-6פרופיל בנוכחות או בהיעדר שעון פונקציונלי. מדיום יצוא perifusion נאסף 4 במרווחי hr במהלך 48 שעות (0-4 תואמת את ההצטברות של IL-6 בין 0 שעה ו 4 שעות). רמות IL-6 במדיום הוערכו על ידי ELISA בשתי כפילויות טכניות משלושה ניסויים עצמאיים. התוצאות מייצגות רמות בסיס IL-6 מנורמל תוכן DNA הכולל. הפרשת IL-6 הופחת בממוצע של 69.30 ± 10.61% על שיבוש השעון הביולוגי (ממוצע ± SEM, n = 3; * P <0.05, זיווג מבחן t). נתון זה יש הבדל בין התייחסות 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההגדרות ניסיון המתואר כאן מורכבות משלוח lentiviral של כתבי פליטת אור יממה לתוך תאים ראשוניים אדם מתורבתים, ואחריו הסנכרון הבא במבחנת הקלטה רציפה של פליטת אור במשך כמה ימים, וניתוח מקביל של הפרשת הורמון ידי אותם תאים. הם מייצגים גישה יעילה עבור חקר מנגנונים מולקולריים והיבטים תפקודיים של שעוני יממת תאים ראשוניים אדם.

איכות החומר התורם היא נושא חשוב להכנת תרביות רקמה העיקרית קיימא. איכות איי אדם יש להעריך בכל פעם לפני תחילת הניסוי. איים עם טוהר מוערך או / ו כדאיות נחה 70% אינם מומלצים עבור ניסויים אלו. תאי איילט נוטים מחדש קשרים בתרבויות ניתקות, אשר ממלאת תפקיד חשוב בהישרדות ואת תפקידם. מאחר ותאי איון לא להתרבות מ"קlture, הם חייבים להיות מצופים בצפיפות גבוהה, אשר מאפשרת לתאים ליצור קשרים עם תאי שכנים. זו מושגת על ידי ציפוי תאי טיפות של נפח קטן. חשוב לציין, מוות של תאים גבוה בתרביות תאי איון בצפיפות נמוכה. שים לב החלפה בינונית צריכה להתבצע ללא דיחוי על מנת למנוע התייבשות תאים.

Myoblasts צריך להיות passaged רצוי ב 60% המפגש, מאז צפיפות גבוהה יותר עשויה להשרות התמיינות myoblast. לאחר trypsinization, myoblasts צריך להיות resuspended בזהירות והתפזרו להימנע צבירי תאים.

זיהום חיידקי או פטרייתי של תאים ראשוניים צריך להיות מחוץ מיקרוסקופית לפני תחילת assay perifusion. בינוני תרבות עשוי להיות בתוספת חומרים נגד פטריות. בנוסף, צינורות perifusion יש לשטוף באמצעות חומרי חיטוי יוד אלכוהול / מים סטריליים ואת מכסי מתכת צריך להיות מעוקר על ידי מעוקר. צעדים אלה מומלצים בין כל דוארxperiment.

להקלטת פליטת אור יעילה, איכות הכנת lentivirus הכתב צריך להיקבע על ידי עוצמת האות bioluminescent. הפרטים של ייצור lentivirus כולל פתרון בעיות ניתן למצוא בכתובת http://lentilab.unige.ch/. לפני פלסמיד transfection לייצור lentivirus, תאי 293T צריכים להיות מצופים בנקודת מפגש 30-50%. מומלץ מאוד לבצע שליטה על יעילות transfection בצלחת במקביל, למשל באמצעות CMV-GFP או lentivector ניאון חלופי. להכנת כל וירוס כייל הנגיף יש להקים.

כמו הניסויים המתוארים הם בדרך כלל לטווח ארוכים (48 שעות או יותר), זה חיוני שתהיה השתקה יציבה במהלך פרק זמן זה. ריכוז siRNA צריך להיות מותאם כמו גם confluency התא לפי הפרוטוקול מגיב siRNA. יעילות של להשתקת גנים חייבת להיבדק בסוף של experimeNT על ידי RT-qPCR או על ידי מערבי סופג.

במהלך perifusion, את קצב הזרימה קובע את הזמן הדרוש לחלוטין להחליף את המדיום בצלחת אבל יש גם השפעה מכנית על תרבית תאים ראשוניים. ואכן, הגדרת הזרימה בשיעור, שהוא נמוך מדי, לא יאפשר החלפה מושלמת של מדיום בצלחת, ו יקטין את הרגישות של השיטה. להיפך, בקצב זרימה במהירות גבוהה עלול לגרום נזק לתאים. בידיים שלנו, את המהירות האופטימלית סוגי תאים הן לא מאפשרים לאסוף 0.5 מ"ל של המדיום יצוא לכל 1 hr.

חשוב לציין, כדי להשיג ריכוז למדידה של חומרים במדיום היצוא, מספר מספיק של תאי מפרישים צריך להיות נוכח בצלחת perifused. שיטת המעקב לצורך זיהוי של החומר המופרש (ELISA או אחר) צריכה להיות רגישה מספיק, במיוחד עבור חומרים המופרשים בריכוזים נמוכים מאוד. צפיפות התאים גבוהה עלול להיות מומלץ להתגברזו בעיה כאשר הדבר אפשרי. לחלופין, מדיום היצוא יכול להיות מרוכז על ידי דיאליזה או עם מסנני צנטריפוגלי, כפי שתואר על ידי אותנו בפרטים ביחס 19.

יחדיו בניסויים שלנו בתאים אנושיים לבלב איון ב myotubes העיקרי לספק את הראיות משכנעות בפעם הראשונה כי בתאים האנושיים אלה להחזיק גבוהה משרעת שעוני יממה אוטונומי תא 18-19. העסקת מערכת perifusion המתואר כאן בשילוב עם מכשיר luminometer (איור 1B) שהראנו כי שעונים אלה ממלאים תפקיד חשוב בוויסות היממה של הפרשת אינסולין בזאלי ידי תאי לבלב (איור 1D), ושל הפרשת הבזליים IL6 ידי myotubes השלד (איור 2 ג). יתר על כן, על ידי דריסת שעון גן שעון הליבה בשתי מערכות ניסיוניות, אנו מראים כי מתנד יממה פונקציונלי נדרש אינסולין קצבי נכון הפרשת IL-6על ידי איון אדם ותא שריר שלד, בהתאמה (1C הדמוי, D ו- 2B, C). התוצאות שלנו מעידות על תפקיד קריטי של שעון איון האדם להפרשת אינסולין ראויה, הם בהסכם טוב עם עבודות שבוצעו במודלים גנטיים מכרסמים 15,17. בהתחשב התפקיד המרכזי של השעון הביולוגי המאפשר אורגניזמים לצפות שינויים סביבתיים יומיים ולא להגיב להם, תקנת יממה של אינסולין בזאלי והפרשת myokine עשויה לייצג מנגנון ציפייה כזו מרכזת לבלב ופעילויות הפרשה שרירי שלד אל rest- מחזור הפעילות של הגוף כולו.

המתודולוגיה המוצעת כאן ניתן לשנות בקלות על מנת ללמוד הפרשת הורמון נוספת מאותו הרקמות. אנחנו כבר נתחנו פנל גדול נוסף של myokines מופרש מתאי שריר שלד, תוך שימוש במערכי myokine אדם זמנית 19, ואנחנו נמצאים בתהליך של להעריךing הפרשת גלוקגון ידי תאים אנושיים איון באמצעות ערכת ELISA גלוקגון (מידע לא מוצג). יתר על כן, תנאי ניסוי אלה יכולים להיות מותאמים עבור סוגי תאים אחרים, עבור adipocytes העיקרי למשל, ללימוד הפרשת adipokine, thyrocytes העיקרי ללימוד הפרשת הורמון בלוטת תריס, enterocytes העיקרי להפרשת incretins לומד, וכו 'יישום חשוב נוסף של מערכת זו יכול להיות לחקור את ההשפעה של תרכובות פיסיולוגיות ו / או תרופתיות על תפקוד הפרשת שעון ביולוגי הסלולר. המתחם של עניין עשוי להיות מיושם באופן רציף לאורך כל הניסוי כולו (למשל לומדים הפרשת אינסולין על ידי תאי איון אדם בנוכחות גלוקוז גבוה או רמות שונות של חומצות שומן חופשיות), או התרכובת עשויה להתווסף בכל שלב נבחר של היממה מחזור.

טכניקה זו יש את המגבלות של מחקר במבחנה אינה מייצגת את המורכבות של regu מקצב צירקדיאוכלוסייה ברמה כל הגוף. במקביל, זה עוזר להבחין בין תפקידיו של שעון אוטונומי על חילוף חומרים תאיים בתנאים מבוקרים. נכון לעכשיו משיטות מבוססות על מדידות תמונת מצב של פעילות הפרשה בתאים או explants הבאות בסנכרון במבחנה 17. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה ייחודית המאפשרת ניתוח תואם ורציף של קצב יממה ופעילות הפרשה בתוך אותה תרבות התא. לחלופין, מתודולוגיה זו ניתן להחיל ללמוד קינטיקה של הכתבים bioluminescent הלא היממה, בשיתוף עם הפרשת התא, כמו גם לאיתור תופעות של חומרים שונים הוסיף למדיום perifusion על תפקוד התא. השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם: 1) הכנה lentivirus יעיל, 2) transfection תא יעיל עם siRNA וכתב וקטורי תמרה; 3) אוסף יצוא בינוני קבוע ו -4) ולוודא כי מספר מספיק של ceLLS משמש על מנת לקבל רמות מדידה של הורמונים או ציטוקינים במדיום יצוא אסף (ראה פתרון בעיות לעיל).

לאור העדויות האחרונות על הקשר בין פרעות שעון הביולוגיות ומחלות מטבוליות וסרטן בבני האדם 3-4,28,34-35, לומדות תכונות שעון היקפיות אדם בתרבויות עיקריות עשויים לייצג גישה חשובה וייחודית להבנת קשר השעון פוטנציאל מחלות אלו. לפיכך, גילוי שלנו על קיומו של קשר בין לבלב אנושי מתפקד השעון שרירי השלד ואת הפרשת הבסיס של אינסולין myokines, עלול לחוב ונודעת להם חשיבות להבנת התפתחות של מחלות כרוניות, כמו השמנה וסוכרת מסוג 2 18-19 ויביא אפיקים חדשים לטיפול במחלות אלה. חשוב לציין, עקב המתאם שנוצר בין המאפיינים מתנד במבחנה העריכו ואת in vivo 36, משמעות של נכסי שעון אנושיים יממה כמו סימן היכר של מחלות, היא של הגבוהה ביותר ו -20 הרלוונטיות קליניות מיידיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים עמיתינו מאוניברסיטת ז'נבה: ז'אק פיליפ עבור הערות בונות על עבודה זו, Ueli Schibler לעזרה יסולא בפז עם התפתחות מערכת perifusion ועבור השראה מדעית, אנדרה ליאני עבור לאחר יזום תכנון, ייצור וביצוע של מערכת זלוף, Lesa-טכנולוגיה בע"מ החברה על הסיוע במערכת perifusion לטפטף-biolumicorder פיתוח תוכנה, ג'ורג Severi לסיוע עם הניסויים perifusion, אורסולה Loizides-מנגולד לקריאת כתב היד באופן ביקורתי, ואן-מארי מכלוף להכנות lentivirus ; אטיין Lefai, סטפני Chanon ויוברט וידאל (INSERM, ליון) להכנת myoblasts העיקרי האדם; וכדי דומניקו בוסקו והתיירים Berney (מרכז השתלות איילט אדם, בית החולים האוניברסיטאי ז'נבה) למתן איי אדם. עבודה זו מומנה על ידי מס 'גרנט השוויצרי הקרן הלאומית למדע 31003A_146475 / 1, Sinergia השוויצרי הקרן הלאומית למדע מענק מס 'CRSII3-154405, romande Fondation לשפוך Diabete sur la משוכלל ונדיר, בו Hjelt קרן, et Fondation ארנסט לוסי Schmidheiny, וסוסייטה Académique דה ז'נב (CD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300-054 For muscle biopsy digestion
DPBS no calcium no magnesium Invitrogen 14190-094
HAM F-10 Invitrogen 41550-021 For myoblasts culture
FBS Invitrogen 10270 Supplement to culture medium
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781-100 Supplement to culture medium
Gentamycin Axon  A1492.0001 Supplement to culture medium
Fungizone Invitrogen 15290-026 Amphotericin B, supplement to culture medium
DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax  Invitrogen 21885-025 For myotubes culture
DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax Invitrogen 11880-028 Recording medium for LumiCycle
Glutamax Invitrogen 35050-028 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104 Cell detachment solution, for islet cell dissociation
CMRL Gibco 21530-027 Culture medium for islet cells
Sodium Pyruvate Gibco 11360-039 Supplement to culture medium
15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube Falcon 352096
F75 flask BD Falcon 353136
3.5 cm Petri dish  BD Falcon 353001
Foskolin Sigma F6886 Adenylyl cyclase activator, used for synchronization
Luciferin Prolume LTD 260150 Supplement to recording medium
OptiMEM  Invitrogen 51985-026 Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection
Lipofectamine RNAiMAX reagent Invitrogen 13778-150 Transfection reagent
HiPerFect reagent Qiagen 301705 Transfection reagent
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool  Dharmacon L-008212-00
ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) Dharmacon D-001810-01
DNeasy Blood & Tissue Kit  Qiagen 69504 For myotubes DNA extraction
RNeasy Plus Mini kit  Qiagen 74104 For myotubes RNA extraction
QIAshredder  Qiagen 79654 For myotubes RNA extraction
2 ml collecting tubes Axygen 311-10-051 To collect the medium with the perifusion
Tissue culture Plate, 6 Well BD Falcon  353046 To collect the medium with the perifusion
RNeasy Plus Micro kit  Qiagen 74034 For islet RNA extraction
Human IL-6 Instant ELISA kit  eBioscience 88-7066-22
Human Insulin Kit Mercodia Mercodia 10-1113-01
Hydrochloric acid, min,37%,p.a. Acros organics 124630010 Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Ethanol (>99.8%) Fluka Analytical 02860-1L Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Human Islets for Research Prodo Laboratories
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R
Water bath VWR 1112A  at 37 °C
Tissu culture hood Faster  SafeFastElite
Tissu culture incubator Heraeus HeraCell 150 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator Heraeus HeraCell 150 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i 5% CO2 at 37 °C
Shaker Heidolph Instruments Unimax 1010 For agitation of the siRNA mix
LumiCycle Actimetrics
LumiCycle software Actimetrics
CosinorJ software EPFL Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX  ERC GmbH Control software that controls the timing of the automated switch

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).

Tags

גנטיקה גיליון 117 תאי לבלב אדם myotubes השלד העיקרי האנושי פליטת אור יממה תמרת lentiviral, perifusion רציף
מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., … More

Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (117), e54673, doi:10.3791/54673 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter