Abstract
概日時計は、毎日の環境の変化を先取りすることにより、外部世界への適応を可能にする、すべての光に敏感な生物において機能的です。概日時計と生理学の多くの側面の間の緊密な接続の我々の理解にかなりの進歩は、過去10年間分野で行われています。しかし、ヒトにおける概日振動の機能の根底にある分子基盤を解明することは、最高の技術的な課題のままです。ここでは、培養ヒト初代細胞における長期（2-5日）生物発光記録及び流出媒体のコレクションのための実験的アプローチの詳細な説明を提供します。この目的のために、我々は、ホルモン分泌および概日生物発光の並列評価を可能にするコアクロック遺伝子プロモーターの制御下にあるレンチウイルスルシフェラーゼレポーターで初代細胞を形質導入しています。さらに、我々は広報で体内時計を破壊するための条件を記述するCLOCKを標的とする siRNAをトランスフェクトすることにより、imaryヒト細胞。ヒト骨格筋細胞によるヒト膵島によるインスリン分泌のサーカディアン規制、myokine分泌に対する我々の結果は、この方法論の適用を示すために、ここで提示されています。これらの設定は、ヒト末梢時計の分子構成を研究するために生理学的または病態生理学的条件下での初代細胞に対するそれらの機能的な影響を分析するために使用することができます。
Introduction
（ ラテン語「サーカ日当」から）概日タイミングシステムは、地球の回転に適応機構として、すべての光に敏感な生物で浮上しています。哺乳類では、腹側視床下部の視交叉上核に位置する中央クロックを、包含する、階層的に組織化され、周辺装置（またはスレーブ）異なる器官で動作する発振器。また、これらの細胞自律的な自己持続発振器は本体1のほぼすべての細胞において機能的です。 SCNから発せられる神経および体液性信号が末梢時計をリセットするのに対し、透光層の信号は、SCNニューロンのための支配的な同期キュー（Zeitgeber）を表します。ターン送り絶食サイクルで駆動するほかレスト-活性リズムでは、周辺クロック2のためにさらにシンクロナイザです。私たちの現在の理解によれば、コアクロックの分子メイクアップは、転写およびtranslaに基づいています生物間で保存されている的なフィードバックループ、。これは、一緒に負のコアクロックPERとCRY遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子BMAL1とCLOCKを備えます。 PERとCRYタンパク質の高レベルは、BMAL1 / CLOCK複合体の阻害を介して自分の転写を阻害します。補助ループはまた、BMAL1とCLOCKの転写を調節する核内受容体REV-ERBSとRORS、から構成されています。さらに、リン酸化、SUMO化、アセチル化などの翻訳後のイベントは、O-GlcNAc化、劣化及びコアクロックタンパク質の核エントリは、24時間の発振周期3を確立する上で追加の重要な調節層を表します。
蓄積証拠は齧歯類モデルにおける研究から茎および代謝および内分泌機能4-5の連携における概日システムの重要な役割を強調しています。ラーグの数電子スケールのトランスクリプトーム解析給餌することを示唆している-断食サイクルは、周辺の発振器6-8の同期で中心的な役割を果たしています。これらの研究と一致して、げっ歯類およびヒトにおけるメタボロームとlipidomic分析は、代謝物の多くは概日様式9-11に組織、血漿、唾液で発振することを明らかにしました。重要なことは、ほとんどのホルモンは血液5,12-13に概日リズムを示します。また、末梢組織の生産に対応するホルモンの概日時計は、局所的にホルモンの分泌を調節する可能性があります。細胞自律的概日発振器は、げっ歯類とヒトの膵島細胞14-16に記載されています。これらの発振器は、膵島トランスクリプトームと機能15,17-18の調節において重要な役割を果たしています。さらに、ヒト骨格筋管によってmyokine分泌は、最近、細胞自律oscillatoによって調節される概日パターンを示すことが実証されていますこれらの細胞19で動作するRS。
インビボでのヒトにおける概日リズムを研究するためのいくつかの手法が広く用いられています。例えば、プラズマメラトニンまたはコルチゾールレベルだけでなく、（参考文献3,20に見直さ）胸部皮膚表面温度は、内因性の概日時計を評価するために研究されてきました。これらの方法は、in vivoで全身概日振動を勉強できますが、彼らははるかに異なる器官および組織におけるフリーランニング自律概日リズムの信頼性の評価を提供するからです。それにもかかわらず、全身の規制から、このような解剖は、これらの細胞の機能に細胞内の分子時計の具体的な効果を理解するために不可欠なツールとなります。したがって、かなりの努力がin vitroで同期不死化または初代培養細胞でヒトクロックを研究するための信頼性のあるアプローチを開発するために行われています。重要なことはことが実証されています初代培養皮膚線維芽細胞で測定されたクロックの特性は密接に生物全体21の個々のクロック特性を反映しています。蛍光および生物発光概日レポーターの開発が大幅にこのアプローチ22-27を進んでいます。さらに、異なる末梢器官に由来している勉強の初代細胞クロックはヒト組織特異的なクロック3,5,16,19-20,28の分子特性の調査を可能にします。このように、in vitroでの同期の一次外植片または細胞内での概日時計の評価は、生物発光レポーターを使用することにより、分子ヒト末梢時計のメイクや臓器の機能に及ぼす影響を研究するための非常に有用な方法を表しています。
本稿では、自律的な細胞クロックの影響だけでなく、in vitroで同期ヒト初代膵島および骨格筋細胞内の概日遺伝子発現を評価するための詳細なプロトコルを紹介しますこれらの細胞の分泌機能に関する混乱。
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Protocol
倫理の声明：このプロトコルに含まれる操作は、ジュネーブ大学病院の倫理委員会および倫理委員会SUD EST IV（契約111分の12）19によって承認されました。参考文献16,18で私たちによって記述、または商業的供給源から得られるヒト膵島は、ジュネーブ（スイス）の大学病院での膵島移植センターで脳死多臓器ドナーの膵臓から単離しました。
初代培養細胞の作製
- ヒト膵島単離、解離と文化
注：電池材料の大幅な損失につながることができ、プラスチック表面に付着する膵島または膵島細胞を防止するために、コンノート医学研究所（CMRL）媒体とコートのすべてのチューブ、プラスチックチップまたはピペット。- ある日は、細胞解離膵島前にdescriとして804G細胞由来のラミニン5の豊富な細胞外マトリックス（の1ミリリットルを追加します3.5センチメートル皿当たり参照29）のベッド。細胞をプレーティングする前に、マトリックスを吸引し、滅菌二蒸留水で皿を3回洗浄します。皿を5分間クリーンベンチの下で乾燥することができます。
- クリーンベンチ内部には、15mlチューブ（複数可）にCMRL培地で得られた膵島を配布します。 5分間、272×gで遠心分離します。
- 吸引した上清、その後は、滅菌ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）カルシウムおよびマグネシウムを含まない37℃に予め温め1mlにペレットを再懸濁します。 5分間、272×gで遠心分離します。
- 上清を吸引し、DPBS 1mlに細胞ペレットを再懸濁します。
- 新しい3.5センチメートル皿に島の総数は、ピペット1ミリリットル膵島懸濁液から10μLをカウントします。顕微鏡下で10μlの降下の膵島の数をカウントし、このことから1ミリリットル膵島懸濁液中の小島の合計数を計算します。 DPBSの14ミリリットルを追加し、細胞懸濁液を遠心1以上5分間、272×gでの時間。
- 膵島細胞解離のために、上清を吸引し、千膵島当量（IEQ）の最大のための細胞剥離液の1ミリリットルを追加します。 37℃の水浴にチューブを置き、静かに6-10分の間、毎分ピペッティングすることにより、数回上下島を混ぜます。
注：スライドガラス上にサスペンションの2μlの低下をピペットし、すべての細胞が十分に分離され、顕微鏡下で確認し、消化の品質をチェックするために、そして何のダブレットまたは細胞塊が残っていないこと。 - サプリメントで冷CMRL 14mlのを添加することにより反応を停止させる（10％ウシ胎児血清（FBS）、L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）、1％ゲンタマイシン、1の1％ ％ピルビン酸ナトリウム）。 5分間、425×gで遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットにCMRL培地の15ミリリットルを追加します。
- サプリメントとCMRL少量のペレットを再懸濁。 hemocytoを用いて顕微鏡下で細胞数を数えメータは、〜650、000細胞/ mlの細胞濃度を得るためにCMRL音量を調整します。
- ピペット3は、ラミニンでプレコートディッシュ3.5センチメートルのステップ1.1.8で得られた分散細胞懸濁液から各100μlの滴を分離しました。
注：細胞は約24時間で皿に付着します。 - 湿潤チャンバーにおいて37℃で組織培養インキュベーター中で細胞（ 図1A）をインキュベートします。各ドロップから100μLを吸引し、新鮮な培地の同じボリュームに置き換えることによって、細胞の培地を2〜3日ごとに低下変更します。
- ヒト初代筋芽細胞培養および分化筋管へ
- 組織生検、衛星細胞の単離および筋芽細胞文化
注：筋生検は、エティエンヌLefai（INSERM、リヨン、フランス）19のグループから得ました。- 先に説明した手順30に従って、プライマリ骨格筋芽細胞を精製します。
- 差別のp筋管へのrimary人間の筋芽細胞
- 液体窒素中に保存したヒト筋芽細胞の1バイアル（1×10 6細胞）を取り、攪拌しながら37℃の水浴中で30秒〜1分のためにバイアルを置くことによって、迅速に細胞を解凍。
- ピペット細胞（1 ml）を、20％FBS、1％P / S、0.5％ゲンタマイシンおよび0.2％のアンホテリシンBを補充したHAM F-10からなる成長培地24mlのに
- 150×gで5分間遠心。
- 2.5×10 5個の細胞当たりの新鮮な増殖培地15mlで上清と再懸濁細胞を除去します。
- プレートF75付着フラスコあたり少なくとも2.5×10 5個の細胞。 CO 2を 37℃の細胞インキュベーターで筋芽細胞を維持し、5％。
- 細胞が60〜80％コンフルエントに達した後、1~2分間、トリプシン-EDTA 0.05％で細胞を解離および3.5 cmの接着ペトリ皿上の増殖培地2mlにそれらをプレート。
- コンフルエンスに達した後、増殖培地を除去します。
- 分化プロトを開始それらを培養することにより、筋管へのヒト筋芽細胞のCOL 2を1g / Lのグルコース、2％FBS、1％P / S、0.5％ゲンタマイシンおよび0.2％のアンホテリシンB（分化培地）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）のミリリットル37℃、5％CO 2での細胞培養器です。 2〜3日毎に培地を変更します。
注：筋管は通常7-10日以内に形成されています。 - 多核筋管19内に筋芽細胞の融合を観察することにより、顕微鏡（ 図2A）の下で筋細胞の分化を確認してください。
- 組織生検、衛星細胞の単離および筋芽細胞文化
2.低分子干渉RNA（siRNA）トランスフェクション
- ヒト膵島細胞のsiRNAのトランスフェクション
注：トランスフェクションプロトコルは細胞解離（ステップ1.1.1-1.1.10）後の翌日に100μlの滴で行われます。- 各ドロップからCMRL培地を吸引し、100μlの無血清最小必須培地（MEM）、2時間の同じボリュームに置き換えますピペッティングによるトランスフェクションの前に。
- トランスフェクション試薬とターゲットのsiRNA（SICLOCK）か、製造元の指示に従って、siControl非標的の50nmの50nmのMEMベースのミックスを調製します。
- 3滴と一皿のためにMEM200μlのそれぞれと2 1.5ミリリットルのチューブを準備します。
- トランスフェクション試薬のこれらのチューブに4μlの1に追加します。
- 適切なsiRNAのストック溶液（20μM）の第二のチューブ1μlに加えます。
- 5分間オービタルシェーカー上でゆっくりと、これら2つのチューブを攪拌した後、一緒にチューブの内容をミックスし、さらに20分間攪拌します。
- 各液滴からMEMの吸引し、100μlのピペッティングすることにより、前工程で得られたトランスフェクションミックスの同じボリュームに置き換えます。
- 37℃でのインキュベーションの4時間後CMRL培地でトランスフェクション溶液を交換してください。手順を繰り返し2.1.1-2.1.3セル再トランスフェクションのための次の日。
- ヒト筋管のsiRNAのトランスフェクション
- トランスフェクションの前に、3.5センチメートルあたりの新鮮な分化培地シャーレの2ミリリットルで（ステップ1.2.2.8を参照）培地を交換してください。
- 滅菌1.5ミリリットルチューブでは、20μMsiRNA溶液の2.4μL、および分化培地100μlに希釈したトランスフェクション試薬の12μlに相当する20 nMのsiRNAを（siControlまたはSICLOCK）、のミックスを準備します。穏やかに攪拌しながら15分間室温で溶液をインキュベートします。
- 37℃で組織培養インキュベーター中に五つ星中3.5 cmのペトリ皿と場所細胞あたりのsiRNAミックス114.4μlの5％24時間CO 2でトランスフェクト細胞。
3.連続長期サーカディアン生物発光の記録は、生きている人間初代細胞におけるホルモン分泌の評価と並行して行います
- によるヒト初代細胞にサーカディアン生物発光レポーターの紹介レンチウイルス形質導入
注：レンチウイルス粒子とのすべての手順は、人員や環境への適度な潜在的な危険をもたらす薬剤との仕事のために追加の予防策を取るためにバイオセーフティーレベル2施設で実施されなければなりません。- レンチウイルスベクターpMD2Gでプラスミド31（それぞれ、Bmal1の-LUCとPer2の-LUCと呼ぶ）金利pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1の-LUCまたはpLV156-Per2の-dLucの同時トランスフェクションベクターによるレポーターレンチウイルス粒子を準備しますおよびポリエチレンイミン法を用いて、293T細胞へのpsPAX（詳細な手順については、リファレンス16を参照してください）。
- 得られたレンチウイルス粒子（滴定についての詳細はhttp://lentilab.unige.ch/で得ることができる）を滴定します。さらなる実験のために、[TU /μlの] 10 4〜10 5形質導入単位の範囲力価を有するレンチウイルスを使用します。
- 層流室内の（30〜50％密集度で）は、ヒト膵島細胞またはヒト筋芽細胞で皿を置きますら、新鮮な補充CMRL培地2mlで培地を交換するには、それぞれ、または増殖培地（ステップ1.2.2.2を参照）（ステップ1.1.7を参照してください）。
- 感染多重度（MOI）（ すなわち、感染性粒子（単位を形質導入）/細胞の数）を計算します。
- MOI = 3を得るために皿にレンチウイルスソリューションをピペットで初代細胞培養を形質導入する（例えば、65,000のために付着した細胞は、6.5×10 4〜100μlの培地ドロップの力価ウイルス液の3μlを添加します）。
- 組織培養インキュベーター中で一晩インキュベートします。翌日培地に変更します。
注：レポーター構築物の十分な発現を達成するために、少なくとも4日前に生物発光の記録へのヒト膵島細胞を形質導入します。筋芽細胞は、コンフルエンスまで増殖させ、その後、膨張行程中に形質導入し、その後、筋管に分化されています。
- ヒト初代細胞のインビトロ同期して
- <LI>以前のステップ3.1.5で形質導入された初代細胞を含む培地3.5センチメートルあたりシャーレの2ミリリットルでアデニル酸シクラーゼ活性化剤の10μMを追加します。
- 細胞培養インキュベーター中、37℃で60分間インキュベートします。
- 100μMのルシフェリンを含む記録媒体の2.5ミリリットルでアデニル酸シクラーゼ活性化因子を含む培地を変更します。
注：ヒト膵島細胞についてCMRL、10％FBS、1％のL-アラニル-L-グルタミンジペプチド、1％P / S、1％ゲンタマイシンを補充した使用。 2％FBS、2％のL-アラニル-L-グルタミンジペプチド、1％P / S、0.5％ゲンタマイシンおよび0.2％のアンホテリシンBを補充は1g / Lのグルコースを含まないDMEM - ヒト筋管は、フェノールレッドを使用するため
シンクロナイズドヒト分泌初代細胞におけるサーカディアン生物発光の記録とホルモン分泌プロファイルの4パラレル評価
- ヒト初代細胞のための長期定数灌流および生物発光録画の設定。
注：作業アウトクリーンベンチ、クリーンなすべての接触面をIDEおよび汚染を避けるために、空気を培養物または培地の曝露を制限します。- 灌流媒体を製造するために、培地にルシフェリンの100μMを追加します。
注：ヒト膵島細胞についてCMRL、10％FBS、1％のL-アラニル-L-グルタミンジペプチド、1％P / S、1％ゲンタマイシンを補充した使用。 2％FBS、2％のL-アラニル-L-グルタミンジペプチド、1％P / S、0.5％ゲンタマイシンおよび0.2％のアンホテリシンBを補充は1g / Lのグルコースを含まないDMEM - ヒト筋管は、フェノールレッドを使用するため - 上記のようにクリーンベンチの内部では、形質導入、トランスフェクトし、同期された初代細胞培養物（膵島細胞または筋管）を含む3.5センチメートル料理を開きます。シリコーン流入/流出接続管（ 図1B1 / B5）が装備されているの3.5cm皿に（自社開発）無菌金属キャップ（ 図1B2）を挿入します。
- 37°CのLの測定プラットフォーム上で皿を置きますIGHTタイトインキュベーター。ねじ込みアダプタ（ 図1B3）を使用して、プラットフォームに料理を修正しました。キャップの適切なシリコーンチューブに灌流システムの流入/流出管を挿入します（ 図 1B1 / B5）、1時間あたりの媒体の〜0.5ミリリットルの流量でポンプの速度を設定します。
- 光電子増倍管（PMT）検出器からの信号を記録し、社内で開発されたドリップbiolumicorderソフトウェアを開きます。データが保存され、「開始」アイコンをクリックして、各皿から連続生物発光の記録を開始するディレクトリを選択しました。
注：またはドリップ・biolumicorderソフトウェアに、他のプログラム（ 例えば LumiCycle）、PMT検出器からの信号を記録するために使用することができます。 - 氷上の回収ボックスに滅菌6ウェル組織培養プレートを置きます。
- 収集ウェルの中で自動化されたスイッチのタイミングを制御する制御ソフトウェアを開きます。時間ワットを設定メディアコレクションのindow（秒）。 「実行」アイコンをクリックして、流出媒体のコレクションごとに4時間（タイムポイントあたり〜2ミリリットル14400秒）を起動します。
- ピペットで滅菌2ミリリットルチューブに各ウェルコレクションから流出媒体を移し、測定します。次のステップを開始する前に、-20℃の冷凍庫に管を保管してください。手順を繰り返し4.1.5-4.1.6 24時間毎に。
- 対応ソフトウェアの「停止」アイコンをクリックして、生物発光記録媒体流を停止します。金属製のキャップを外し、皿から残留培地を吸引除去します。
- 別の実験で得られた分泌タンパク質値を正規化し、いずれかのDNA（筋管19のためのゲノムDNA含有量によって正規化）を抽出し、またはに溶解酸-エタノール緩衝液（膵島細胞18の総ホルモン含有量による正規化）の1ミリリットルを追加するために料理。
- 灌流媒体を製造するために、培地にルシフェリンの100μMを追加します。
5.流出で膵島ホルモンとMyokineレベルを測定しますヒト原発内分泌細胞の連続灌流によって得られるミディアム
- インスリン
- 製造業者の説明書に従ってヒトインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットを使用して収集した時点から流出媒体に基礎インスリンレベルを定量化します。
- 実験（ステップ4.1.9）18の終了時に酸-エタノール処理した細胞から抽出された各ウェル中の、総インスリン含量に収集媒体の絶対的なボリュームにデータを正規化します。
- インターロイキン-6（IL-6）
- 定量化します 収集時点から流出媒体における基礎IL-6レベルを、製造業者の説明書に従って、ヒトIL-6 ELISAキットを使用して。
- 各ウェルの収集媒体の絶対量にし、実験（ステップ4.1.9）の終了時に、ゲノムDNAのコンテンツにデータを正規化します。
Biolumines 6.サーカディアンデータセットの分析cenceやホルモン分泌のプロフィール
- 生物発光分析
- 提供されるソフトウェア19を使用して生物発光プロファイルを分析します。
- JTK-サイクル分析
- JTK_CYCLEアルゴリズム32を使用してホルモンの分泌プロファイルおよび生物発光の記録結果を分析します。
- 20-24時間で概日周期の幅を設定します。
注：実験条件を並列に記録された場合には、対の統計分析実験を比較するために行うことができます。
- CosinorJ分析
- また、ホルモンの分泌とCosinorJソフトウェア28を使用して、概日生物発光プロファイルを分析します。
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Representative Results
浴液洗浄ヒト膵島細胞からのパラレルサーカディアン生物発光の記録と膵島ホルモン分泌の評価
概日時計の最初の分子特性を提供した後、ヒトの膵島細胞16内の作動は、我々は、膵島機能と転写18上のクロックの混乱の影響を研究することを目的としました。私たちは、CLOCK mRNAの80％以上のノックダウンをもたらした、（詳細については、 議定書を参照してください）分散ヒト膵島細胞に効率的なSICLOCKトランスフェクションプロトコルを設定し、効率的なクロックアブレーションで18プロファイリング概日生物発光により測定されます。グルコース誘導性インスリン分泌（GSIS）分析は、有意に減少し、基礎を明らかにし、このようなクロック破壊（図示せず）上に、インスリン分泌を刺激しました。アラウンド・クロックのヒト膵島細胞、CONTINによってホルモンの分泌を評価するために、uous灌流システムは、（ 図1Bに示される）ルミノメーターに接続しました。機能（siControl）または機能不全（SICLOCK）発振器を保有するヒト膵島細胞は、Bmal1の-LUCレンチウイルス粒子で形質導入しました。続いて、細胞を48時間（ 図1C、D 18）の間に流出媒体に概日生物発光とインスリン分泌の平行分析に続いてアデニル酸シクラーゼ活性化剤のパルスに同期しました。これらの実験は、一定の生理的グルコース濃度（5.6 mMグルコース）、in vitroでの同期のヒト膵島細胞によるインスリン分泌の下でSICLOCKベアリングサンプル（ 図1D）で破壊された概日プロファイルを示すことを示唆しています。
機能クロックの存在下または非存在下でin vitroでヒト骨格筋管シンクロナイズドによってMyokine分泌を学びます
33におけるグルコース代謝の調節における骨格筋クロックの潜在的な役割を考慮して、我々は初代ヒト骨格に概日リズムを特徴づけることを目的としました筋管および筋管機能19におけるそれらの役割を調査しました。この目的を達成するために、骨格筋管における概日時計の破壊は、CLOCKを標的とする siRNAをトランスフェクトすることによって達成されました。 Bmal1の-LUCとPer2の-LUC記者とサーカディアン生物発光レポーターアッセイは、 インビトロで同期ヒト骨格筋管は、さらに内因性コアクロック転写発現（; 19 図2B）により確認した自立概日リズムを示すことが明らかになりました。この内因性のクロックを効率的に標的とするsiRNA CLOCK（ 図2B）の存在下で破壊しました。また、IL-6（ 図2C）の基礎分泌、インターロイキン8（IL-8）ここによって評価同期骨格筋管による単球走化性タンパク質1（MCP-1）（図示せず）、灌流システム（ 図1B）およびその後の大規模myokine多重分析（図示せず）について説明する概日プロファイルを示します強くクロック中断（ 図2C 19）の際に調節不全。
図1：添付のヒト膵島細胞の浴液洗浄ヒト膵島細胞からのパラレルサーカディアン生物発光の記録を持つホルモン分泌の評価 （A）代表画像膵島解離後の1日。 （B）灌流媒体とボトル、ポンプ、遮光インキュベータ内で光電子増倍管（PMT）を備えた計測プラットフォームを含む自家製灌流システムの概略図、記録ソフトウェアによって制御ルミノメーターデバイス、および半自動サンプルコレクター。挿入：（B1）の流入接続管を、 （B2）3.5センチメートルペトリ皿のための金属製のキャップ。 （B3）測定プラットフォーム（B4）にキャップを付加ねじ込み可能なアダプター。 （B5）流出接続管。 （B6）に自動的に制御媒体の販売代理店。 （C）ヒト膵島細胞は、スクランブルsiRNA（siControl）またはsiRNAのいずれかがCLOCK（SICLOCK）を標的とし、Bmal1の-Lucレポーターを形質導入してトランスフェクトしました。細胞は常に5.6 mMグルコースを含む培地で浴液洗浄しました。サーカディアン生物発光は、アデニル酸シクラーゼ活性化パルスによる同期以下を記録しました。 （D）は、インスリンレベルは48時間の間4時間毎に収集した流出サンプルにおいてELISAによって評価しました。 JTK_CYCLEアルゴリズム32のアプリケーションは、pでいることを確認しました機能クロック（siControl）、インスリン分泌の平均プロファイルのresenceは24.19±0.89時間の周期長で、48時間以内に概日でした（** P = 0.009; N = 7ドナー）。この概日プロファイルは、クロック中断（SICLOCK）の際に失われました。データは、全ホルモンコンテンツから分泌されるホルモンの％として提示されている（平均±SEM）用のn = 7ドナー（各ドナーのための1つの複製）.This図は、基準18から変更されている。 これの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。
図2： 基礎IL-6分泌ヒト骨格筋管によっては、機能性概日時計の不在下で強く阻害された筋芽細胞は、レンチウイルス粒子で形質導入しました。筋管に分化Bmal1の-LUCの導入遺伝子を含む、およびsiControlまたはSICLOCK siRNAのいずれかでトランスフェクトしました。トランスフェクションの24時間は、筋管は、アデニル酸シクラーゼ活性化パルスに同期して並列生物発光の記録で連続灌流を行いました。 （A）代表的な画像は筋管の分化を誘導するために培地を含む20％から2％のFBSからスイッチ以下の0日（D0）およびD7で採取しました。分化プロセス中に、ヒト筋芽細胞を再配向され、細長いなり、plurinuclatedシンシチウムを形成するために一緒に融合します。 siControlの（B）Bmal1の-LUC生物発光プロファイルは、筋管（黒線） -トランスフェクトし、SICLOCKは、筋管（灰色の線） -トランスフェクト。Bmal1の-LUC振動プロファイルは、3つの独立した実験（実験あたり1ドナー）で記録しました。 （C）代表基底 IL-6の分泌機能クロックの存在下または非存在下で、プロファイル。灌流流出媒体（0-4 0時間と4時間の間にIL-6の蓄積に相当）48時間の間4時間間隔で採取しました。培地中のIL-6レベルは、3つの独立した実験から二つの技術的な複製にELISAによって評価しました。結果は、総DNA含量に対して正規化基底IL-6レベルを表します。 IL-6分泌は体内時計の混乱時に69.30±10.61パーセントの平均に減少した（平均±SEM、 N = 3。 * P <0.05、t検定）。この図は、基準19から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する実験的な設定は、その後のin vitroでの同期や数日間の生物発光の連続記録、および同細胞によるホルモン分泌の平行分析に続いて、培養されたヒト初代細胞への概日生物発光レポーターのレンチウイルスデリバリーで構成されています。彼らは、ヒト初代細胞内で分子機構と概日時計の機能的な側面を探索するための効率的なアプローチを表します。
ドナー材料の品質は、実行可能な一次組織培養物の調製のための重要な課題です。ヒト膵島の品質は、実験を開始する前に毎回評価されるべきです。推定純度および/または70％に劣る生存率膵島は、これらの実験のために推奨されていません。膵島細胞はそれらの生存及び機能に重要な役割を果たして解離培養物での接触を再確立する傾向があります。膵島細胞は、Cuで増殖しないのでlture、彼らは、細胞が隣接細胞との接触を確立することを可能にする高密度、でプレーティングされなければなりません。これは、小さな体積の液滴で細胞をプレーティングすることによって達成されます。重要なことには、細胞死は、低密度膵島細胞培養物において高いです。培地交換は、細胞の乾燥を避けるために、速やかに実施すべきであることに注意してください。
高い密度が筋芽細胞分化を誘導することができるので、筋芽細胞は、60％コンフルエンスで、好ましくは、継代する必要があります。トリプシン処理した後、筋芽細胞を慎重に再懸濁し、細胞塊を回避するために、分散されるべきです。
初代細胞の細菌や真菌の汚染は灌流アッセイを開始する前に、微視的に除外すべきです。培養培地は、抗真菌性物質を補充している可能性があります。さらに、灌流チューブはアルコールのヨウ素消毒/滅菌水によりすすぐべきであると金属キャップは、オートクレーブ滅菌する必要があります。これらのステップは、各電子の間で推奨されていますxperiment。
効率的な生物発光の記録のために、レポーターレンチウイルス調製物の質は、生物発光シグナルの強度によって決定されるべきです。トラブルシューティングを含むレンチウイルス生産の詳細はhttp://lentilab.unige.ch/で見つけることができます。レンチウイルス生産のためのトランスフェクションプラスミドの前に、293T細胞は、30〜50％コンフルエンスで播種する必要があります。非常にCMV-GFPまたは代替蛍光レンチベクターを使用して、インスタンスのために、並列皿にトランスフェクション効率の制御を行うことが推奨されます。ウイルス力価が確立されるべき各ウイルスの製造のための使用に関する。
記載された実験は、典型的には、長期間持続する（48時間以上）であるため、この期間の間に安定したサイレンシングを有することが重要です。 siRNAの濃度は、siRNA試薬プロトコルに従って細胞集密度ならびに最適化されるべきです。遺伝子サイレンシングの効率はexperimeの終わりにテストされなければなりませんNT RT-qPCRによりまたはウェスタンブロッティングによる。
灌流の間、流量は、完全に皿に培地を交換するのに必要な時間を決定するだけでなく、一次細胞培養物に機械的衝撃を有します。実際、低すぎる速度で流れを設定し、シャーレ内の培地の完全な交換を可能にしません、と方法の感度が低下します。逆に、高速の流量は、細胞に損傷を与えることができます。我々の手では、両方の細胞型のための最適な速度は、1時間あたりの流出培地0.5mlを収集することを可能にするました。
重要なことには、流出媒体中の物質の測定可能な濃度を得るために、分泌細胞の十分な数の浴液洗浄皿で存在すべきです。分泌された物質の検出のためのフォローアップの方法（ELISAまたは他の）は、特に非常に低濃度で分泌する物質のために、十分な感度であるべきです。より高い細胞密度を克服することが推奨されるかもしれませんこの問題は、可能な場合。参照19で詳細に我々が説明したようにあるいは、流出媒体が、透析によって、または遠心分離フィルターを用いて濃縮することができます。
まとめると、ヒト膵島細胞および一次筋管における我々の実験は、初めてこれらのヒトの細胞は高振幅の細胞自律的な概日時計に18-19を有することを説得力のある証拠を提供します。照度計デバイス、我々はこれらのクロックは、膵島細胞による基礎インスリン分泌の概日調節（ 図1D）において重要な役割を果たすことを実証した（ 図1B）で、骨格筋管によって基底IL6の分泌の合成ここに記載灌流システムを採用します（ 図2C）。また、両方の実験系ではコアクロック遺伝子CLOCKをノックダウンすることにより、我々は、機能概日振動子が適切なリズミカルなインスリンおよびIL-6分泌のために必要とされていることを示していますヒト膵島および骨格筋細胞、それぞれ（ 図1C、D及び図2B、C）によって。我々の結果は、適切なインスリン分泌のためのヒト膵島クロックの重要な役割を示し、齧歯類遺伝モデル15,17で行われる作品とよく一致しました。生物は毎日の環境の変化を予測するのではなく、それらに反応させることで体内時計の主要な役割を考えると、基礎インスリンとmyokine分泌の概日調節はREST-に膵島および骨格筋の分泌活動を調整するような先行メカニズムを表す可能性があります全身の活動周期。
ここで提案する方法は、容易に、同じ組織からの追加のホルモンの分泌を研究するために修飾することができます。我々はすでに多重人間myokineアレイ19を使用して、骨格筋細胞によって分泌されるmyokinesの追加の大きなパネルを分析し、そして我々は、評価の過程にありますグルカゴンELISAキットを用いてヒト膵島細胞によるグルカゴン分泌をる（データは示さず）。また、これらの実験条件等アディポカイン分泌、甲状腺ホルモンの分泌を研究するための主要な甲状腺、インクレチン分泌を研究するための主要な腸細胞を研究するための本システムの追加の重要なアプリケーションはである可能性があり、例えば一次脂肪細胞のために、他の細胞型のために最適化することができます携帯概日時計機能および分泌に対する生理学的および/または薬理学的化合物の影響を探ります。関心対象の化合物は、（高グルコースまたは遊離脂肪酸の異なるレベルの存在下でのヒト膵島細胞によるインスリン分泌を研究例えば）実験全体にわたって連続的に適用されることがあり、または化合物は、概日の選択された段階で添加されることがありサイクル。
この技術は、in vitro試験の限界を有しており、概日リズムのReguの複雑さを表すものではありません。全身レベルでレーション。同時に、制御された条件下で、細胞代謝に自律クロックの役割を区別するのに役立ちます。現在利用可能な方法は、 インビトロ同期17以下の細胞または外植片における分泌活性のスナップショットの測定に基づいています。ここで説明するプロトコルは、同じ細胞培養液内の概日リズムと分泌活性の調和と継続的な分析を可能にするユニークな方法を表しています。あるいは、この方法は、細胞分泌と関連して、ならびに細胞機能の灌流培地に加え、異なる物質の効果を検出するために、非概日生物発光レポーターの動態を研究するために適用することができます。プロトコルにおける重要なステップは以下のとおりですsiRNAおよびレポーターベクター形質導入1）効率的なレンチウイルスの調製、2）効率的な細胞トランスフェクション; 3）一定の媒体流出収集および4）を確認し、そのCEの十分な数LLS収集流出媒体中のホルモンまたはサイトカインの測定可能なレベルを得るために使用されている（上記のトラブルシューティングを参照）。
潜在的なクロック接続を理解するための重要かつユニークなアプローチを表すことができる初代培養物におけるヒト末梢時計の特性を研究する人間3-4,28,34-35で体内時計の乱れや代謝性疾患と癌との間のリンクに関する最近の証拠、の観点でこれらの疾患へ。このように、機能的なヒト膵島および骨格筋クロックとインスリンとmyokinesの基礎分泌の間のリンクの有無の我々の発見は、そのような肥満や2型糖尿病18-19のような慢性疾患の開発の理解のための潜在的な影響を負担する可能性がありますこれらの疾患の治療に新たな道をもたらします。重要なことは、確立されたin vitroで評価した発振回路の特性との相関関係とに起因するin vivoで 36、疾患の特徴として、人間の体内時計の特性の含意は、最高と即時臨床的関連20です。
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Acknowledgments
私たちは、ジュネーブ大学からの私達の同僚に感謝しています：ジャック・フィリップこの作業に関する建設的なコメントのために、Ueli Schibler灌流システムの開発で、科学のインスピレーションのための貴重な助けのための、設計、製造、試運転の考案したためアンドレLianiレンチウイルス調製物のための批判的に原稿を読み取るための灌流実験の支援のために潅流システム、灌流システムとドリップbiolumicorderソフトウェア開発の支援のためのレサ・テクノロジー株式会社の会社、ジョージセベーリ、ウルスラLoizides-マンゴールド、アン・マリーMakhlouf ;エティエンヌLefai、ステファニーChanonヒューバート・ヴィダル（INSERM、リヨン）へのヒト一次筋芽細胞を調製します。そして、ドメニコ・ボスコとティエリー・バーニー（ヒト膵島移植センター、ジュネーブ大学病院）へのヒト膵島を提供します。この作品は、スイス国立科学財団助成金番号31003A_146475 / 1に、Siによって賄われていましたnergiaスイス国立科学財団助成金番号CRSII3-154405、財団ロマンドはラRECHERCHEシュールDiabète、ボーHjelt財団、財団エルンストらルーシーシュミットハイニー、およびソシエテAcadémiqueドゥジュネーブ（CDを）注ぎます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
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