Abstract
Circadian Uhren sind funktional in allen lichtempfindlichen Organismen, so dass eine Anpassung an die Außenwelt durch tägliche Umweltveränderungen antizipieren. Erhebliche Fortschritte in unserem Verständnis der engen Verbindung zwischen der inneren Uhr und die meisten Aspekte der Physiologie wurde auf dem Gebiet in den letzten zehn Jahren gemacht. Um jedoch die molekulare Basis zu entwirren, die beim Menschen bleibt der höchste technische Herausforderung, die Funktion des zirkadianen Oszillators zugrunde liegt. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung eines experimentellen Ansatzes für die langfristige (2-5 Tage) Biolumineszenz Aufnahme und Abfluss Medium Sammlung in kultivierten menschlichen Primärzellen. Zu diesem Zweck haben wir Primärzellen mit einem lentiviralen Luciferase-Reporter transduziert, die unter der Kontrolle eines Kerntakt Genpromotor ist, der für die Beurteilung der parallel Hormonsekretion und circadian Biolumineszenz ermöglicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Bedingungen für die in pr die innere Uhr zu störenimary menschlichen Zellen durch Transfektion von siRNA Targeting CLOCK. Unsere Ergebnisse auf der zirkadianen Regulation der Insulinsekretion durch menschliche Pankreasinseln und Myokine Sekretion durch humane Skelettmuskelzellen, werden hier vorgestellt, um die Anwendung dieser Methodik zu veranschaulichen. Diese Einstellungen können verwendet werden, um die molekulare Zusammensetzung von menschlichen peripheren Uhren zu studieren und ihre funktionellen Auswirkungen auf primäre Zellen unter physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen zu analysieren.
Introduction
Die zirkadiane Zeitsystem (aus dem Lateinischen "Circa diem") hat sich in allen lichtempfindlichen Organismen, als ein adaptiver Mechanismus zur Rotation der Erde entstanden. Bei Säugetieren wird sie in einer hierarchischen Weise organisiert, die zentrale Uhr umfasst, die in den suprachiasmatischen Kern des Hypothalamus ventral liegt und peripheren (oder Slave) Oszillatoren, die in verschiedenen Organen wirksam sind. Außerdem sind funktionelle diese Zelle autonom selbsterhaltende Oszillatoren in fast jeder Zelle des Körpers 1. Photic Signale stellen eine dominante Synchron Cue (Zeitgeber) für die SCN - Neuronen, während neuronale und humorale Signale von der SCN die peripheren Uhren zurückgesetzt ausgeht. Zusätzlich Rest-Aktivitätsrhythmen, die wiederum Fütterung-Fasten - Zyklen fahren, sind weitere Synchronisierungen für periphere Uhren 2. Nach unserem derzeitigen Verständnis wird die molekulare Zusammensetzung des Kerntakt basiert auf der Transkription und Übersettionalen Rückkopplungsschleifen, die zwischen den Organismen konserviert sind. Dies umfasst die Transkriptionsaktivatoren BMAL1 und CLOCK, die zusammen die Transkription der negativen Gene Kerntakt PER und CRY aktivieren. Hohe Konzentrationen von PER und CRY Proteine ihre eigene Transkription durch Hemmung des BMAL1 / CLOCK Komplexes hemmen. Eine Hilfsschleife besteht aus den Kernrezeptoren REV-ERBs und RORs, der auch die Transkription von BMAL1 und CLOCK regulieren. Darüber hinaus repräsentieren posttranslationale Ereignisse , einschließlich Phosphorylierung, sumoylation, Acetylierung, O-GlcNAcylierung, Abbau und Kern Eintritt der Kerntakt Proteine eine zusätzliche wichtige regulatorische Schicht bei der Festlegung der 24 - Stunden - Schwingungszyklus 3.
Thesaurierend Beweis stammt aus Studien in Tiermodellen und unterstreicht die entscheidende Rolle des zirkadianen Systems bei der Koordination von metabolischen und endokrinen Funktionen 4-5. Eine Anzahl von largE-Skala vorschlagen Transkriptom - Analyse , dass Fütterung - Nüchtern - Zyklen 6-8 eine zentrale Rolle bei der Synchronisation der peripheren Oszillatoren spielen. In einer Vereinbarung mit diesen Studien, Metabolom und lipidomic Analyse bei Nagern und Menschen haben gezeigt , dass eine große Anzahl von Metaboliten im Gewebe schwingen, Plasma und Speichel in einem zirkadianen Weise 9-11. Wichtig ist , zeigen die meisten Hormone zirkadianen Rhythmen im Blut 5,12-13. Darüber hinaus Zirkadianrhythmen des entsprechenden Hormons peripheren Gewebe produzieren könnte Hormonsekretion lokal regulieren. Zellautonome zirkadianen Oszillatoren wurden in Nagetieren und menschlichen Pankreas - Inselzellen 14-16 beschrieben. Diese Oszillatoren spielen eine wesentliche Rolle in der Pankreas - Insel Transkriptom Regulierung und Funktion 15,17-18. Weiterhin wurde Myokine Sekretion durch menschliche Skelett Myotuben kürzlich eine zirkadiane Muster aufweisen gezeigt, die durch zellautonomen oscillato geregeltrs operative in diesen Zellen 19.
Verschiedene Ansätze wurden für die weithin in vivo beim Menschen zirkadianen Rhythmen zu studieren. Zum Beispiel Plasma Melatonin oder sowie Brust-Hautoberflächentemperatur ( zusammengefasst in Referenzen 3,20) Cortisolspiegel wurden endogene zirkadiane Uhren zu bewerten untersucht. Obwohl diese Verfahren die systemische circadian Oszillationen in vivo erlauben , zu studieren, sind sie weit eine zuverlässige Beurteilung der Freilauf autonomen zirkadianen Rhythmen in verschiedenen Organen und Geweben von der Bereitstellung. Dennoch würde eine solche Präparation aus dem systemischen Regulation ein unverzichtbares Werkzeug für das Verständnis der spezifischen Wirkung der intrazellulären molekularen Uhren auf die Funktion dieser Zellen. Daher ist eine erhebliche Anstrengungen unternommen worden , zuverlässige Ansätze zur Untersuchung der menschlichen Uhren in immortalisierten oder primären kultivierten Zellen in vitro synchronisiert zu entwickeln , durchgeführt. Wichtig ist, wurde gezeigt, dassTakteigenschaften gemessen in kultivierten primären Haut - Fibroblasten - Zellen reflektieren eng die einzelnen Takteigenschaften des gesamten Organismus 21. Die Entwicklung von fluoreszierenden und Biolumineszenz circadian Reporter hat diesen Ansatz 22-27 stark vorangetrieben . Weiterhin Studium primären Zell Uhren , die von verschiedenen peripheren Organen ableiten ermöglicht die Untersuchung der molekularen Eigenschaften von menschlichem Gewebe-spezifischen Takte 3,5,16,19-20,28. Somit Beurteilung der inneren Uhren in in vitro synchronisiert primäre Explantate oder Zellen, durch Biolumineszenz Reporter Verwendung stellt eine sehr nützliche Methode , um die molekulare Zusammensetzung von menschlichen peripheren Uhren und ihre Auswirkungen auf die Organfunktion zu untersuchen.
In diesem Artikel werden wir detaillierte Protokolle für die Beurteilung der zirkadianen Genexpression in primären menschlichen Inselchen und Skelettmuskelzellen in vitro synchronisiert präsentieren sowie die Auswirkungen der autonomen Zell UhrStörungen auf der sekretorischen Funktion dieser Zellen.
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Protocol
Ethik - Anweisung: Manipulations in diesem Protokoll enthalten von der Ethikkommission der Universität Genf Krankenhaus genehmigt wurden und von der Ethikkommission SUD EST IV (Abkommen 12/111) 19. Menschliche Inseln wurden aus Bauchspeicheldrüsen von hirntoten Multi-Organ - Spender in der Inseltransplantation Zentrum an der Universitätsklinik von Genf (Schweiz) isoliert , wie von uns in Referenzen 16,18 beschrieben, oder von einer kommerziellen Quelle erhalten.
1. Herstellung von primären Zellkultur
- Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation, Distanzierung und Kultur
HINWEIS: Mantel jedes Rohr, Kunststoffspitze oder Pipette mit Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) Medium, um ein Verkleben der Kunststoffoberfläche Inseln oder Inselzellen zu verhindern, was zu einem erheblichen Verlust an Zellmaterial führen kann.- Einen Tag vor der Dissoziation zu Inselzell 1 ml Laminin-5-reichen extrazellulären Matrix (abgeleitet von 804G-Zellen als descriBett in Bezug 29) pro 3,5 cm Schale. Bevor Zellen Plattierung absaugen Matrix und waschen Sie die Schale 3 mal mit sterilem bi-destilliertem Wasser. Dann wird die Schale unter dem Laminar-Flow-Schrank für 5 min trocknen lassen.
- Im Inneren des Laminarflowbox, verteilen die erhaltenen kleinen Inseln mit CMRL Medium in 15-ml-Röhrchen (s). Zentrifuge bei 272 × g für 5 min.
- Den Überstand aspirieren, und dann das Pellet in 1 ml steriler Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) vorgewärmt auf 37 ° C ohne Calcium und Magnesium. Zentrifuge bei 272 × g für 5 min.
- Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 1 ml DPBS.
- Um die Gesamtzahl der Inseln, pipettieren 10 & mgr; l aus der 1 ml Insel-Suspension in ein neues 3,5-cm-Schale zählen. Zähle die Anzahl der Inselchen in dem 10 & mgr; l Tropfen unter dem Mikroskop und daraus die Berechnung der Gesamtzahl der Inselchen in dem 1 ml Insel-Suspension. In 14 ml DPBS und Zentrifuge die Zellsuspension eine weitereZeit bei 272 xg für 5 min.
- Für Inselzell-Dissoziation, den Überstand aspirieren und 1 ml Zellablösung Lösung für maximal 1.000 Inseläquivalenten (IEQ). Das Röhrchen wird in einem Wasserbad bei 37 ° C und sanft die Inseln mischen durch Auf- und Abpipettieren mehrmals jede Minute, während 6-10 min.
HINWEIS: Um die Verdauung Qualität zu überprüfen, pipettieren ein 2 ul Tropfen Suspension auf einem Glasträger und überprüfen unter dem Mikroskop, dass alle Zellen gut getrennt sind, und dass keine Dubletten oder Zellklumpen geblieben. - Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 14 ml kaltem CMRL mit Supplementen (10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% Penicillin-Streptomycin (P / S), 1% Gentamycin, 1 % Natriumpyruvat). Zentrifuge bei 425 × g für 5 min. Den Überstand aspirieren und 15 ml CMRL Medium zu dem Zellpellet.
- Das Pellet in einem kleinen Volumen von CMRL mit Ergänzungen. Zähle die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop unter Verwendung eines hemocytoMeter, stellen Sie die CMRL Volumen, um eine Zellkonzentration von ~ 650, 000 Zellen / ml zu erhalten.
- Pipettieren 3 getrennt Tropfen von 100 ul jeweils von der dispersen in Schritt 1.1.8 in einer 3,5-cm-Schale erhalten Zellsuspension mit Laminin vorbeschichtet.
Hinweis: Zellen legen in etwa 24 Stunden auf dem Teller. - Inkubiere Zellen (1A) in einem Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C in einer feuchten Kammer. Ändern das Medium der Zelle alle 2-3 Tage Tropfen durch Absaugen 100 & mgr; l aus jedem Tropfen und mit dem gleichen Volumen an frischem Medium ersetzt.
- Menschliche primäre Myoblastenkultur und Differenzierung in Myotuben
- Gewebebiopsie, Satelliten-Zellisolierung und Myoblastenkultur
Hinweis: Muskelbiopsien aus der Gruppe von Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Frankreich) erhalten 19.- Reinige primären Skelettmyoblasten nach dem zuvor beschriebenen Verfahren von 30.
- Differenziert primary menschlichen Myoblasten in Myotuben
- Nehmen Sie eine Phiole (1 x 10 6 Zellen) menschlicher in flüssigem Stickstoff gelagert Myoblasten und auftauen Zellen schnell durch das Fläschchen für 30 sec bis 1 min in einem Wasserbad unter Rühren bei 37 ° C bringen.
- Pipetten Zellen (1 ml) in 24 ml Wachstumsmedium, bestehend aus HAM-F 10 mit 20% FBS ergänzt, 1% P / S, 0,5% Gentamycin und 0,2% Amphotericin B.
- Zentrifuge 5 min bei 150 x g.
- Entfernen des Überstandes und Resuspendieren Zellen mit 15 ml frischem Wachstumsmedium pro 2,5 x 10 5 Zellen.
- Platte mindestens 2,5 x 10 5 Zellen pro F75 adhärenten Kolben. Halten die Myoblasten in einem Zellinkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Sobald Zellen 60-80% Konfluenz erreichen, dissoziieren die Zellen mit Trypsin-EDTA 0,05% für 1-2 min und in 2 ml Wachstumsmedium auf adhärente 3,5 cm Petrischalen plattieren.
- Nach Erreichen der Konfluenz, das Wachstumsmedium zu entfernen.
- Starten Sie die Differenzierung Protocol menschlicher Myoblasten in Myotuben, indem sie in 2 Züchten ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 1 g / l Glucose, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% Gentamycin und 0,2% Amphotericin B (Differenzierungsmedium) in einem Zellinkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Ändern Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage.
HINWEIS: Myotuben sind in der Regel innerhalb von 7-10 Tagen gebildet. - Überprüfen Muskelzelldifferenzierung unter dem Mikroskop (2A) durch die Fusion von Myoblasten in kernigen Myotuben beobachten 19.
- Gewebebiopsie, Satelliten-Zellisolierung und Myoblastenkultur
2. small interfering RNA (siRNA) Transfektion
- siRNA Transfektion von humanen Inselzellen
HINWEIS: Die Transfektions-Protokoll wird in Tropfen von 100 & mgr; l am nächsten Tag nach der Zell Dissoziation durchgeführt (Schritte 1.1.1-1.1.10).- Absaugen 100 ul CMRL Medium aus jedem Tropfen und ersetzen Sie es mit dem gleichen Volumen an Serum-freien Minimal Essential Medium (MEM) 2 hvor der Transfektion durch Pipettieren.
- Bereiten Sie eine MEM-basierte Mischung aus Transfektionsreagenz und 50 nM Ziel siRNA (SICLOCK) oder 50 nM nicht-Targeting siControl gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Für eine Schale mit 3 Tropfen bereiten zwei 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul MEM jeder.
- In einer dieser Röhren 4 ul Transfektionsreagenz.
- In dem zweiten Rohr 1 ul des geeigneten siRNA-Stammlösung (20 & mgr; M).
- Agitieren, diese beiden Röhren langsam auf dem Orbitalschüttler für 5 min und dann mischen den Inhalt der Rohre zusammen und agitieren für weitere 20 min.
- Absaugen 100 ul MEM aus jedem Tropfen und ersetzen Sie es mit dem gleichen Volumen im vorherigen Schritt durch Pipettieren erhalten Transfektionsgemisch.
- Ersetzen Sie die Transfektion Lösung mit CMRL Medium nach 4 h Inkubation bei 37 ° C. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 am nächsten Tag für die Zellwieder Transfektion.
- siRNA Transfektion von humanen Myotuben
- Vor der Transfektion, ersetzen Sie das Medium (siehe Schritt 1.2.2.8) mit 2 ml frischem Differenzierungsmedium pro 3,5 cm Petrischale.
- In einem sterilen 1,5 ml - Röhrchen, Herstellung einer Mischung aus 20 nM siRNA (siControl oder SICLOCK), die zu 2,4 ul einer 20 uM siRNA - Lösung und 12 ul von Transfektionsreagenz verdünnt in 100 ul Differenzierungsmedium entspricht. Inkubieren der Lösung bei Raumtemperatur für 15 min unter leichtem Schütteln.
- Transfizieren Zellen mit 114,4 & mgr; l der siRNA Mischung pro 3,5 cm - Petrischale und legen Zellen in eine Gewebekultur - Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Std.
3. Kontinuierliche Langzeit Circadian Biolumineszenz Aufnahme in Parallel mit der Bewertung der Hormonausschüttung in lebenden menschlichen primären Zellen durchgeführt
- Einführung in Circadian Biolumineszenz Reporter in primären humanen Zellen, die durchLentivirale Transduction
HINWEIS: Alle Verfahren mit lentiviralen Partikel müssen in einer Biosicherheitsstufe 2 Einrichtung durchgeführt werden, mit Mitteln zur Arbeit zusätzliche Vorkehrungen zu treffen, die eine moderate potentielle Gefahr für Mensch und Umwelt darstellen.- Bereiten reporter lentivirale Partikel durch Co-Transfizieren des Vektors von Interesse pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc oder pLV156-Per2-dLUC (genannt Bmal1-luc und Per2-luc jeweils) Plasmid 31 mit lentiviralen Vektoren pMD2G und psPAX in 293T - Zellen , die Polyethylenimin - Methode (für Einzelheiten des Verfahrens siehe Referenz 16).
- Titrieren der erhaltenen lentivirale Partikel (Details auf der Titration kann bei http://lentilab.unige.ch/ erhältlich). Für weitere Experimente verwenden Lentiviren mit Titern April 10.-Mai 10. transduzierenden Einheiten im Bereich [TU / ul].
- Platz Gerichte mit menschlichen Inselzellen oder menschlichen Myoblasten (bei 30-50% Konfluenz) in der Laminar-Flow-Kabineet und ersetzen Sie das Medium mit 2 ml frischem ergänzten CMRL Medium (siehe Schritt 1.1.7) oder Wachstumsmedium (siehe Schritt 1.2.2.2) sind.
- Berechnen Sie die Vielzahl der Infektion (MOI) (dh infektiöse Partikel (transduzierenden Einheiten) / Anzahl der Zellen).
- Transduzieren die primäre Zellkultur durch Pipettieren Lentivirus - Lösung in die Schale, um ein MOI = 3 (beispielsweise bei 65.000 anhaftenden Zellen werden 3 ul der Viruslösung mit dem Titer von 6,5 x 10 4 bis 100 & mgr; l Medium drop) zu erhalten.
- über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren. Ändern Medium am nächsten Tag.
HINWEIS: Transduktion menschlicher Inselzellen mindestens 4 Tage vor der Biolumineszenz Aufzeichnung, um eine ausreichende Expression des Reporterkonstrukts zu erreichen. Myoblasten werden während der Expansionsphase transduziert, dann bis zur Konfluenz gezüchtet und anschließend in Myotuben differenziert.
- In - vitro - Synchronisation von primären humanen Zellen
- <li> 10 uM Adenylylcyclase Aktivator Hinzufügen in 2 ml Medium pro 3,5 cm-Petrischale, die Primärzellen zuvor transduzierten in Schritt 3.1.5 enthält.
- in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C für 60 min inkubieren.
- Ändern des Mediums mit dem Adenylatzyklase-Aktivator mit 2,5 ml des Aufzeichnungsmediums, das 100 & mgr; M Luciferin.
HINWEIS: Für Zellen menschlichen Insel verwenden CMRL ergänzt mit 10% FBS, 1% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% P / S, 1% Gentamycin; für den menschlichen Myotuben Phenolrot verwenden - mit 2% FBS-freiem DMEM mit 1 g / L Glucose supplementiert, 2% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% P / S, 0,5% Gentamycin und 0,2% Amphotericin B.
4. Parallele Beurteilung von Circadian Biolumineszenz Aufnahme und die Hormonausschüttung Profile in Synchronized Menschen Sekretorisches Primärzellen
- Einrichten Langzeit Constant Perifusion und Biolumineszenz-Aufnahme für Human Primärzellen.
HINWEIS: Bei der Arbeit outside die Laminarflowbox, reinigen Sie alle Kontaktflächen und begrenzen Exposition der Kulturen oder Medium zu der Luftverunreinigung zu vermeiden.- Um das Perifusion Medium herzustellen, werden 100 & mgr; M Luciferin zu dem Medium.
HINWEIS: Für Zellen menschlichen Insel verwenden CMRL ergänzt mit 10% FBS, 1% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% P / S, 1% Gentamycin; für den menschlichen Myotuben Phenolrot verwenden - mit 2% FBS-freiem DMEM mit 1 g / L Glucose supplementiert, 2% L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 1% P / S, 0,5% Gentamycin und 0,2% Amphotericin B. - Im Inneren des Laminarflowbox, öffnen Sie die 3,5-cm-Schalen der transduzierten, transfiziert und synchronisierten primären Zellkulturen (Inselzellen oder Myotuben), die wie oben beschrieben. Legen Sie sterile metallischen Kappen (entwickelt im Haus) (Abbildung 1B2) in die 3,5 - cm - Schalen , die mit Silikon Zustrom / Ausfluß Verbindungsrohre (Abbildung 1B1 / B5) ausgestattet sind.
- Die Schalen werden auf der Messplattform im 37 ° C light dichten Inkubator. Befestigen Sie die Gerichte auf die Plattform durch einen schraubbaren Adapter (Abbildung 1B3). Legen Sie die Zustrom / Ausfluß Rohre des Perifusion System in die entsprechenden Silikonschläuche der Kappe (Abbildung 1B1 / B5) und die Drehzahl der Pumpe mit einer Flussrate von ~ 0,5 ml Medium pro 1 Stunde eingestellt.
- Öffnen Sie die in-house entwickelt Drip-biolumicorder Software, die die Signale der Photomultiplier-Röhre (PMT) -Detektor aufzeichnet. Wählen Sie das Verzeichnis, in dem die Daten gespeichert werden und kontinuierlich Biolumineszenz starten von jedem Gericht die Aufnahme der "Start" Symbol anklicken.
HINWEIS: Alternativ zu der Drip-biolumicorder Software, andere Programme (zB LumiCycle) können verwendet werden , um Signale von PMT - Detektor aufzunehmen. - Legen Sie sterile 6-Well-Gewebekulturplatten in der Sammelbox auf Eis.
- Öffnen Sie die Steuerungssoftware, die den Zeitpunkt des automatischen Schalter unter den Sammelbrunnen steuert. Stellen Sie die Zeit window mittlerer Sammlung (sec). Beginnen Sammlung des Abflusses Medium alle 4 h (14,400 sec; ~ 2 ml pro Zeitpunkt), indem Sie den "run" Symbol klicken.
- Übertragen und messen Sie den Abfluss Medium aus jeder Ansammlung gut in sterile 2 ml-Röhrchen durch Pipettieren. Halten Röhrchen in einem -20 ° C Gefrierschrank, bevor der nächste Schritt beginnt. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.5-4.1.6 alle 24 Stunden.
- Stoppen Sie die Biolumineszenz Aufnahme und den Mediumstrom durch das Symbol "Stop" auf der entsprechenden Software klicken. Entfernen Sie die Metallkappen und absaugen Restmittel aus den Gerichten.
- Um die sekretierte Protein erhaltenen Werte in verschiedenen Experimenten, entweder extrahieren DNA (Normalisierung durch genomische DNA - Gehalt für Myotuben 19) oder 1 ml Lyse - Säure-Ethanol - Puffer (Normierung durch Gesamthormongehalt für Inselzellen 18) mit dem zu normalisieren Geschirr.
- Um das Perifusion Medium herzustellen, werden 100 & mgr; M Luciferin zu dem Medium.
5. Messung Islet Hormone und Myokine Ebenen im OutflowMedium erhalten durch kontinuierliche Perifusion von primären humanen endokrinen Zellen
- Insulin
- Quantifizierung basalen Insulinspiegel im Abflussmedium von gesammelten Zeitpunkten von einem menschlichen Insulin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -Kit unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers folgend.
- Normalisieren Daten an das absolute Volumen des gesammelten Mediums in jeder Vertiefung gegeben und auf die Gesamtinsulingehalt, extrahiert aus Säure-Ethanol - behandelten Zellen am Ende des Experiments (Schritt 4.1.9) 18.
- Interleukin-6 (IL-6)
- Quantifizieren basal IL-6-Spiegel in Ausströmrichtung Medium von gesammelten Zeitpunkten durch einen menschlichen IL-6 ELISA Kit Anweisungen des Herstellers folgend.
- Normalisieren Daten an das absolute Volumen des gesammelten Mediums in jeder Vertiefung und genomischen DNA-Gehalt am Ende des Experiments (Schritt 4.1.9).
6. Circadian Dataset Analysen für Biolumineszenz und die Hormonausschüttung Profile
- Biolumineszenz-Analyse
- Analysieren Biolumineszenz Profil mit Hilfe der mitgelieferten Software 19.
- JTK-Zyklus-Analyse
- Analysieren Sie Hormonsekretion Profile und Biolumineszenz Aufnahmeergebnisse durch den JTK_CYCLE Algorithmus 32 verwendet wird .
- Stellen Sie die zirkadiane Periodenbreite bei 20 bis 24 Stunden.
HINWEIS: Falls die experimentellen Bedingungen wurden parallel aufgezeichnet, ein gekoppeltes statistische Analyse können die Experimente zum Vergleich durchgeführt werden.
- CosinorJ Analyse
- Alternativ analysieren Hormonausschüttung und circadian Biolumineszenz Profile der Software CosinorJ mit 28.
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Representative Results
Beurteilung der Islet Hormonausschüttung mit Parallel Circadian Biolumineszenz Aufnahme von peri-kondensierte menschlichen Inselzellen
Nach dem Bereitstellen 18 eine erste molekulare Charakterisierung des zirkadianen Uhr, wirksam in menschlichen Inselzellen 16, wollten wir bei der Untersuchung der Auswirkungen von Taktstörungen auf die Inselfunktion und Transkription. Wir setzen eine effiziente SICLOCK Transfektionsprotokoll in dispersen menschlichen Inselzellen (siehe Protokoll für Details), die in mehr als 80% Zuschlag von CLOCK mRNA führte, und in effizienter Uhr Ablation als 18 durch circadian Biolumineszenz Profilierung gemessen. Glucose induzierten Insulinsekretion (GSIS) Analyse ergab signifikant reduziert und basal stimuliert die Insulinsekretion bei einer solchen Taktunterbrechung (nicht gezeigt). Zur Beurteilung der Hormon-Sekretion durch menschliche Inselzellen rund um die Uhr, ein Continnuierlichen Perifusion System wurde auf einem Luminometer (in 1B dargestellt) verbunden ist . Menschliche Inselzellen, eine funktionelle (siControl) Lager oder dysfunktional (SICLOCK) Oszillator wurden mit Bmal1-luc lentivirale Partikel transduziert. Die Zellen wurden anschließend mit einem Impuls von Adenylylcyclase Aktivator gefolgt von parallelen Analyse von zirkadianen Biolumineszenz und Insulinsekretion in den Ablauf Medium während 48 h (Figur 1C, D 18) synchronisiert. Diese Experimente deuten darauf hin , dass unter konstanten physiologischen Glucosekonzentration (5,6 mM Glucose), Insulin - Sekretion von in - vitro - synchronisierten menschlichen Inselzellen zeigt eine zirkadiane Profil, das in SICLOCK Lagerproben (1D) gestört ist.
Studieren Myokine Sekret von Human Skeletal Myotuben Synchronized in vitro in der Gegenwart oder Abwesenheit von Funktionsuhr
33 wollten wir an zirkadianen Rhythmen in primären menschlichen Skelett charakterisierenden Myotuben und ihre Rolle in der Myotube Funktion 19 zu untersuchen. Zu diesem Zweck Störung des zirkadianen Uhr in der Skelett Myotuben wurde durch Transfektion von siRNA Targeting CLOCK erreicht. Circadian Biolumineszenz Reporter - Assays mit Bmal1-luc und Per2-luc - Reporter zeigte , dass menschliche Skelett Myotuben, in vitro synchronisiert, weisen eine sich selbst erhaltzirkadianen Rhythmus, der durch endogene Kerntakt transcript Ausdruck (2B; 19) bestätigt wurde. Diese endogene Uhr wurde in Gegenwart von siRNA Targeting CLOCK (2B) effizient gestört. Darüber hinaus ist die basale Sekretion von IL-6 (Figur 2C), Interleukin-8 (IL-8)und Monocyte Chemotactic Protein 1 (MCP-1) (nicht gezeigt) durch synchronisierte Skelett Myotuben, durch die hier beschriebenen Perifusion System bewertet (1B) und die anschließende große Myokine multiplex - Analyse (nicht gezeigt), zeigt eine circadian Profil, das ist stark dysreguliert auf Taktstörungen (2C 19).
Abbildung 1: Bewertung der Hormonsekretion mit Parallel Circadian Biolumineszenz Aufnahme von peri - kondensierte menschlichen Inselzellen (A) repräsentatives Bild der angeschlossenen menschlichen Inselzellen einen Tag nach der Insel Dissoziation.. (B) Schematische Darstellung der hausgemachten Perifusion System , das eine Flasche mit dem Perifusion Medium umfasst, eine Pumpe, mit einer Messplattform mit einer Photomultiplierröhre (PMT) ausgestattet innerhalb des lichtdichten Inkubator, Ein Luminometer Gerät, das von der Aufzeichnungssoftware gesteuert, und ein halbautomatisches Probensammler. Einfügen: (B1) Influx Verbindungsrohr; (B2) Metallkappe für den 3,5 cm Petrischale; (B3) schraubbaren Adapter, der die Kappe an der Messplattform befestigt (B4); (B5) Efflux Verbindungsrohr; (B6) automatisch Mittelverteiler gesteuert. (C) Menschliche Inselzellen wurden entweder mit verschlüsselten siRNA (siControl) oder siRNA Targeting CLOCK (SICLOCK) transfiziert und mit dem Bmal1-luc Reporter transduziert. Die Zellen wurden mit Kulturmedium, das 5,6 mM Glukose ständig peri-kondensierte. Circadian Biolumineszenz wurde nach der Synchronisation durch einen Adenylylcyclase Aktivator Puls aufgezeichnet. (D) Der Insulinspiegel wurden mittels ELISA in den Abfluss Proben alle 4 Stunden während 48 Stunden gesammelt bewertet. Anwendung des Algorithmus JTK_CYCLE 32 bestätigt , dass in dem präsenz eines funktionellen Takt (siControl), das Durchschnittsprofil von sekretiertem Insulin wurde circadian innerhalb von 48 h, mit einer Periodenlänge von 24,19 ± 0,89 h (** p = 0,009; n = 7 Spendern). Dieser zirkadiane Profil wurde auf Taktstörungen (SICLOCK) verloren. Die Daten werden als% der sekretiertes Hormon aus dem Gesamthormongehalt dargestellt (Mittelwert ± SEM) für n = 7 Geber (eine Wiederholung für jeden Spender) .Diese Zahl hat sich von der Referenz 18 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version davon zu sehen Zahl.
Abbildung 2:. Basal IL-6 Sekretion von Human Skeletal Myotuben ist stark in der Abwesenheit eines funktionellen Circadian Clock Inhibierte Myoblasten wurden mit lentiviralen Partikel transduziertmit dem Bmal1-luc - Transgens in Myotuben differenziert, und entweder mit oder siControl SICLOCK siRNA transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion Myotuben wurden mit einem Adenylylcyclase Aktivator Impuls synchronisiert und auf kontinuierliche Perifusion mit parallel Biolumineszenz Aufzeichnung unterworfen. (A) Repräsentative Bilder wurden am Tag genommen 0 (D0) und D7 nach der Umstellung von 20% auf 2% FBS - Medium , enthaltend Myotuben Differenzierung zu induzieren. Während des Differenzierungsprozesses werden menschliche Myoblasten umorientiert, werden verlängert und miteinander verschmelzen eine plurinuclated Syncytium zu bilden. (B) Bmal1-luc Biolumineszenz Profile von siControl transfizierten Myotuben (schwarze Linie) und SICLOCK transfizierten Myotuben (graue Linie). Bmal1-luc Schwingungsprofile in drei unabhängigen Experimenten aufgezeichnet wurden (ein Spender pro Experiment). (C) Repräsentative basalen IL-6-SekretionProfil in Gegenwart oder Abwesenheit eines funktionellen Takt. Der Ausfluß Perifusion Medium wurde in 4 Stunden-Intervallen während 48 Stunden gesammelt (0-4 entspricht der Anreicherung von IL-6, die zwischen 0 h und 4 h). IL-6-Spiegel im Medium wurden in zwei technische Duplikaten aus drei unabhängigen Experimenten durch ELISA beurteilt. Die Ergebnisse stellen die basale IL-6-Spiegel normalisiert auf die Gesamt-DNA-Gehalt. IL-6-Sekretion im Durchschnitt von 69,30 ± 10,61% bei der zirkadianen Uhr Störung reduziert wurde (Mittelwert ± SEM, n = 3; * P <0,05, paired t - Test). Diese Zahl hat sich von der Referenz 19 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die experimentellen hier beschriebenen Einstellungen bestehen aus lentiviralen Lieferung von circadian Biolumineszenz Reporter in kultivierten humanen primären Zellen, gefolgt von der anschließenden in vitro - Synchronisation und eine kontinuierliche Aufzeichnung der Biolumineszenz für mehrere Tage, und die parallele Analyse von Hormonsekretion durch die gleichen Zellen. Sie stellen einen effizienten Ansatz für molekulare Mechanismen und funktionelle Aspekte der zirkadianen Uhren in primären menschlichen Zellen zu erforschen.
Die Qualität des Spendermaterial ist ein wichtiges Thema für die Herstellung von lebensfähigen primären Gewebekulturen. Die Qualität der menschlichen Inseln sollte jedes Mal vor dem Start des Experiments ausgewertet werden. Inselchen mit einer geschätzten Reinheit oder / und die Lebensfähigkeit schlechter als 70% sind nicht für diese Experimente empfohlen. Inselzellen neigen dazu, Kontakte in dissoziierten Kulturen wieder herzustellen, die eine wichtige Rolle in ihrem Überleben und die Funktion spielt. Da Inselzellen vermehren sich nicht in culture, müssen sie in einer hohen Dichte überzogen werden, die Zellen Kontakt mit benachbarten Zellen herstellen können. Dies wird durch Plattieren Zellen in Tröpfchen eines kleinen Volumens erreicht. Wichtig ist, dass Zelltod höher in geringer Dichte Inselzellkulturen. Beachten Sie, dass Medium Ersatz sollten umgehend ausgeführt werden, um Zell Austrocknen zu verhindern.
Myoblasten sollte vorzugsweise bei 60% Konfluenz passagiert werden, da eine höhere Dichte Myoblasten Differenzierung induzieren können. Nach Trypsinierung sollte Myoblasten sorgfältig zu vermeiden Zellcluster erneut suspendiert und dispergiert werden.
Bakterien oder Pilzen Kontamination von primären Zellen sollten mikroskopisch vor dem Start des Perifusion Test ausgeschlossen werden. Das Kulturmedium kann mit antimykotische Substanzen ergänzt werden. Darüber hinaus sollte die Perifusion Schlauch durch Alkohol Jod Desinfektion / sterilem Wasser und den Metallkappen gespült werden sollten, im Autoklaven sterilisiert werden. Diese Schritte werden zwischen jedem e empfohlenxperiment.
Für eine effiziente Biolumineszenz Aufnahme sollte die Qualität des Reporter Lentivirus Zubereitung durch die Intensität des Biolumineszenz-Signal bestimmt werden. Die Einzelheiten der Lentiviren Produktion einschließlich Fehlerbehebung finden Sie unter http://lentilab.unige.ch/ finden. Vor der Transfektion für Lentivirus Produktion zu Plasmid sollte 293T-Zellen bei 30-50% Konfluenz plattiert werden. Es wird sehr durch die Verwendung CMV-GFP oder eine alternative Fluoreszenz lentivector eine Kontrolle der Transfektionseffizienz in einer parallelen dish, beispielsweise zur Durchführung empfohlen. Für jede Viruspräparation sollte der Virustiter hergestellt werden.
Da die beschriebenen Experimente sind in der Regel lang anhaltende (48 Stunden oder mehr), ist es entscheidend stabiler silencing während dieser Zeitspanne haben. Die Konzentration der siRNA sollte, sowie die Zellkonfluenz optimiert werden gemäß der siRNA Reagenz Protokoll. Effizienz der Geninaktivierung muss am Ende des Experime getestet werdennt mittels RT-qPCR oder durch Western Blot.
Während Perifusion bestimmt die Strömungsgeschwindigkeit die notwendige Zeit, um vollständig um das Medium in der Schale auszutauschen, sondern hat auch eine mechanische Wirkung auf die primäre Zellkultur. Tatsächlich ist die Strömung mit einer Rate Einrichtung, die zu niedrig ist, wird nicht für einen vollständigen Austausch des Mediums in der Schale zu ermöglichen, und wird die Empfindlichkeit des Verfahrens zu verringern. Im Gegenteil, eine Strömungsrate hoher Geschwindigkeit können die Zellen beschädigt werden. In unseren Händen hat die optimale Geschwindigkeit für beide Zelltypen ermöglichen 0,5 ml des Abflusses Medium pro 1 Stunde zu sammeln.
Wichtiger ist, eine meßbare Konzentration von Substanzen in Ausströmrichtung Medium, eine ausreichende Anzahl von sezernierenden Zellen zu erhalten, sollte in der peri-kondensierte Schale vorhanden sein. Die Follow-up-Verfahren zum Nachweis des sezernierten Substanz (ELISA oder andere) sollten in sehr niedrigen Konzentrationen abgeschieden genug, vor allem für Substanzen empfindlich sein. Höhere Zelldichte könnte empfohlen werden, zu überwindenDieses Problem, wenn möglich. Alternativ kann der Ausfluß Medium durch Dialyse oder mit Fliehkraftfilter konzentriert werden, wie 19 von uns in Einzelheiten in Bezug beschrieben.
Zusammengenommen unsere Experimente in der menschlichen Pankreas - Inselzellen und in primären Myotuben bieten zum ersten Mal überzeugende Beweise dafür , dass diese menschlichen Zellen besitzen eine hohe Amplitude zellautonome Zirkadianrhythmen 18-19. Unter Verwendung des hier beschriebenen Perifusion System mit einem Luminometer Gerät kombiniert (Abbildung 1B) haben wir gezeigt, dass diese Uhren eine wichtige Rolle in der zirkadianen Regulation der Basal - Insulin - Sekretion von Pankreas - Inselzellen (Abbildung 1D) spielen, und der basalen IL6 Sekretion von Skelett-Myotuben (Abbildung 2C). Darüber hinaus wird durch den Kerntakt Gen CLOCK in beiden experimentellen Systemen umzuwerfen, zeigen wir , dass eine funktionelle circadian Oszillator für die richtige rhythmische Insulin und IL-6 - Sekretion erforderlich istvon menschlichen Inseln und Skelettmuskelzellen, bzw. (1C, D und 2B, C). Unsere Ergebnisse zeigen eine kritische Rolle der menschlichen Insel Uhr für die richtige Insulin - Sekretion und sind in guter Übereinstimmung mit den Arbeiten in Nagetier genetischen Modelle 15,17 durchgeführt. Angesichts der wichtigen Rolle des zirkadianen Uhr in so dass Organismen täglich Umweltveränderungen zu antizipieren, anstatt zu ihnen zirkadianen Regulation der Basal-Insulin und Myokine Sekretion zu reagieren könnten, eine solche antizipatorische Mechanismus dar, die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse und im Skelettmuskel sekretorischen Aktivitäten auf die Rest- Koordinaten Aktivitätszyklus des ganzen Körpers.
Die hier vorgeschlagene Methode kann leicht modifiziert werden, um zusätzliche Hormonausschüttung aus dem gleichen Gewebe zu untersuchen. Wir haben bereits eine weitere große Gruppe von myokines von Skelettmuskelzellen sezerniert analysiert, Multiplex - menschlichen Myokine Arrays 19 verwenden, und wir sind in den Prozess der BeurteilungGlukagon-Sekretion durch menschliche Inselzellen ing das Glucagon ELISA Kit (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus können diese experimentellen Bedingungen für andere Zelltypen optimiert werden, beispielsweise Adipozyten primäre, zur Untersuchung Adipokin Sekretion, primäre Thyreozyten für Schilddrüsenhormon - Sekretion zu studieren, primäre Enterozyten zur Untersuchung Incretine Sekretion usw. Eine weitere wichtige Anwendung dieses Systems könnte erforschen die Auswirkungen der physiologischen und / oder pharmakologische Verbindungen auf die zelluläre zirkadianen Uhr Funktion und Sekretion. Die Verbindung von Interesse kann kontinuierlich während des gesamten Experiments angewandt werden (beispielsweise das Studium Insulinsekretion durch menschliche Inselzellen in Gegenwart hoher Glukose oder verschiedenen Ebenen der freien Fettsäuren) oder die Verbindung könnte bei einer gewählten Phase des zirkadianen zugegeben werden Zyklus.
Diese Technik hat die Grenzen eines in - vitro - Studie und repräsentieren nicht die Komplexität des zirkadianen Rhythmus regelnung auf einer ganzen Körperebene. Zur gleichen Zeit, hilft es, die Rolle eines autonomen Uhr auf den Zellstoffwechsel unter kontrollierten Bedingungen zu unterscheiden. Derzeit werden auf Snapshot - Messungen von Sekretion Aktivität in den Zellen oder Explantaten nach in vitro - Synchronisation 17 verfügbaren Methoden. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine einzigartige Methode, um eine übereinstimmende und kontinuierliche Analyse von zirkadianen Rhythmus und sekretorischen Aktivität innerhalb der gleichen Zellkultur ermöglicht. Alternativ könnte diese Methode die Kinetik der nicht-circadian biolumineszierenden Reportern in Verbindung mit Zell Sekretion sowie zur Erfassung der Wirkung verschiedener Substanzen hinzugefügt, um die Perifusion Medium auf die Zellfunktion zu untersuchen angewendet. Die kritischen Schritte in dem Protokoll sind: 1) eine effiziente Lentiviren Vorbereitung, 2) eine effiziente Transfektion von Zellen mit siRNA und Reportervektoren Übertragung; 3) konstante mittlere Abfluss Sammlung und 4) dafür sorgen, dass eine ausreichende Anzahl von cells verwendet wird, um messbare Konzentrationen von Hormonen oder Cytokinen in dem gesammelten Abfluss Medium (siehe Fehlerbehebung oben) zu erhalten.
In Anbetracht der jüngsten Beweise über den Zusammenhang zwischen zirkadianen Uhr Störungen und Stoffwechselkrankheiten und Krebs beim Menschen 3-4,28,34-35, menschlichen peripheren Takt Immobilien in Primärkulturen studiert einen wichtigen und einzigartigen Ansatz darstellen kann das Potential Taktverbindung für das Verständnis auf diese Krankheiten. So sind unsere Entdeckung der Existenz von Verbindungen zwischen funktionellen humanen Inselzellen der Bauchspeicheldrüse und im Skelettmuskel Uhr und basale Sekretion von Insulin und myokines, könnten mögliche Konsequenzen zu tragen für das Verständnis der Entstehung von chronischen Krankheiten wie Fettleibigkeit und Typ - 2 - Diabetes 18-19 und bringt neue Möglichkeiten in der Behandlung dieser Krankheiten. Wichtig ist , dass aufgrund des festgelegten Korrelation zwischen den in vitro beurteilt Oszillatoreigenschaften und die in vivo 36, Implikation der menschlichen zirkadianen Uhr Eigenschaften als Markenzeichen von Krankheiten, ist der höchste und unmittelbare klinische Relevanz 20.
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Acknowledgments
Wir danken unseren Kollegen von der Universität Genf: Jacques Philippe für konstruktive Kommentare zu dieser Arbeit, Ueli Schibler für wertvolle Hilfe bei der Entwicklung des Perifusion System und für die wissenschaftliche Inspiration, André Liani für das Design konzipiert haben, Fertigung und Inbetriebnahme von das Perfusionssystem, Lesa-Technologie LTD Unternehmen für die Unterstützung bei der Perifusion System und Drip-biolumicorder Software-Entwicklung, George Severi für die Unterstützung bei den Perifusion Experimenten Ursula Loizides-Mangold zum Lesen kritisch das Manuskript, und Anne-Marie Makhlouf für Lentiviren Vorbereitungen ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon und Hubert Vidal (INSERM, Lyon) für die menschliche primäre Myoblasten vorzubereiten; und Domenico Bosco und Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Universitätsspital Genf) für die menschliche Inseln bieten. Diese Arbeit wurde von der Schweizerischen National Science Foundation Grant No finanziert 31003A_146475 / 1, die Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur Diabète, Bo Hjelt-Stiftung, Stiftung Ernst et Lucie Schmidheiny, und Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
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