Abstract
Dygnsklockan är funktionella i alla ljuskänsliga organismer, vilket möjliggör en anpassning till den yttre världen genom att förutse dagliga miljöförändringar. Betydande framsteg i vår förståelse av den täta förbindelsen mellan dygnsrytm klocka och de flesta aspekterna av fysiologi har gjorts på området under det senaste decenniet. Emellertid unraveling den molekylära grunden som ligger bakom funktionen av den cirkadiska oscillatorn hos människor stannar av högsta teknisk utmaning. Här ger vi en detaljerad beskrivning av en experimentell metod för långsiktig (2-5 dagar) mareld inspelning och utflöde medel samling i odlade humana primära celler. För detta ändamål har vi transducerade primära celler med en lentiviral luciferas reporter som är under kontroll av en klockfrekvens genpromotor, som möjliggör för den parallella bedömning av hormonutsöndring och dygnsrytm bioluminescens. Dessutom beskriver vi förutsättningarna för att störa dygnsrytm klocka i primary humana celler genom transfektion siRNA inriktning klocka. Våra resultat på den cirkadiska regleringen av insulinsekretion av humana pankreasöar, och myokine utsöndring av humana skelettmuskelceller, presenteras här för att illustrera tillämpningen av denna metod. Dessa inställningar kan användas för att studera den molekylära makeup av humana perifera klockor och analysera deras funktionella effekter på primära celler under fysiologiska eller patofysiologiska tillstånd.
Introduction
Dygnsrytm tidtagningssystem (från latin "Circa diem") har framkommit i alla ljuskänsliga organismer, som en adaptiv mekanism till jordens rotation. I däggdjur, är det organiserat i ett hierarkiskt sätt, som omfattar den centrala klockan, som är belägen i suprachiasmatiska kärnan av den ventrala hypotalamus, och perifer (eller slav) oscillatorer som är operativa i olika organ. Dessutom är dessa cell autonoma självunderhållande oscillatorer är funktionella i nästan varje cell i kroppen 1. Fotiska signaler utgör en dominerande synkroniserings cue (Zeitgeber) för SCN nervceller, medan neurala och humorala signalerna från SCN återställa perifera klockor. I tillägg vila aktivitetsrytmer, som driver i sin tur inmatnings fasta cykler, är ytterligare synkroniserings för perifera klockor 2. Enligt vår nuvarande kunskap, är den molekylära makeup av klockfrekvens baserat på transkriptionell och översätttionella återkopplingsslingor, vilka är konserverade mellan organismer. Detta omfattar transkriptionsaktivatorer BMAL1 och klocka, som tillsammans aktiverar transkription av de negativa klockfrekvens PER och gråta gener. Höga nivåer av PER och Cry-proteiner kommer att hämma sin egen transkription genom hämning av BMAL1 / CLOCK-komplexet. En extra slinga består av nukleära receptorer REV-Erbs och speglarna, som också reglerar transkriptionen av BMAL1 och klocka. Dessutom posttranslationella händelser, inklusive fosforylering, sumoylation, acetylering, O-GlcNAcylation, nedbrytning och nukleära inträde av klockfrekvens proteiner representerar en ytterligare viktig reglerande skikt i upprättandet 24 hr svängningscykel 3.
Ackumulerande bevis kommer från studier i gnagarmodeller och belyser den avgörande betydelsen av dygnsrytm systemet i samordningen av metabola och endokrina funktioner 4-5. Ett antal large-skala transkriptom analys tyder på att utfodring - fasta cykler spelar en central roll i synkroniseringen av perifera oscillatorer 6-8. I ett avtal med dessa studier har metabolomic och lipidomic analys hos gnagare och människor visade att ett stort antal metaboliter svänga i vävnad, plasma och saliv på en dygnsrytm sätt 9-11. Viktigt är de flesta hormoner uppvisar dygnsrytmen i blodet 5,12-13. Dessutom kan dygns klockor motsvarande hormonproducerande perifer vävnad reglera hormonutsöndring lokalt. Cell autonom dygnsrytm oscillatorer har beskrivits i gnagare och humana bukspottcellöar 14-16. Dessa oscillatorer spelar en viktig roll i regleringen av pankreasö transkriptom och funktion 15,17-18. Dessutom har myokine utsöndring av mänskliga skelett myotuber nyligen visat sig uppvisa en dygnsrytm mönster, som regleras genom cellautonoma oscillators operativa i dessa celler 19.
Flera tillvägagångssätt för att studera dygnsrytmen i människor in vivo har använts i stor utsträckning. Till exempel, har plasma melatonin eller kortisolnivåer samt bröst hud yttemperatur (granskas i referenserna 3,20) studerats för att bedöma endogena dygnsklockan. Även om dessa metoder tillåter att studera system dygnsrytm svängningar in vivo, de är långt från att ge en tillförlitlig bedömning av fritt rinnande autonoma dygnsrytm i olika organ och vävnader. Ändå skulle en sådan dissektion från den systemiska regleringen vara ett oumbärligt verktyg för att förstå den specifika effekten av intracellulära molekylär klocka på funktionen av dessa celler. Därför har stora ansträngningar gjorts för att utveckla tillförlitliga metoder för att studera mänskliga klockor i immortaliserade eller primära odlade celler synkroniserade in vitro. Viktigare, har det visats attklocka egenskaper mätt i odlade primära hudfibroblastceller noggrant återspegla de enskilda klock egenskaperna hos hela organismen 21. Utvecklingen av fluorescerande och självlysande dygnsrytm reportrar har i hög grad avancerade detta tillvägagångssätt 22-27. Dessutom studerar primära cell klockor som härrör från olika perifera organ gör det möjligt att undersöka de molekylära egenskaperna hos humana vävnadsspecifika klockor 3,5,16,19-20,28. Således, bedömning av dygns klockor i in vitro synkroniserade primära explantat eller celler genom att använda självlysande reportrar, utgör en mycket användbar metod för att studera den molekylära makeup av humana perifera klockor och deras inverkan på organfunktion.
I denna artikel kommer vi att presentera detaljerade protokoll för att bedöma dygns genuttryck i humana primära ö och skelettmuskelceller synkroniserade in vitro liksom effekterna av autonoma cellulära klockastörningar på den sekretoriska funktionen hos dessa celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Manipulationer som ingår i detta protokoll godkändes av den etiska kommittén i Genèveuniversitetssjukhuset och den etiska kommittén SUD EST IV (avtal 12/111) 19. Humana öar isolerades från pankreas av hjärndöd flera organdonatorer i ö-transplantation Centre vid universitetssjukhuset i Genève (Schweiz) som beskrivits av oss i referenserna 16,18, eller erhållas från en kommersiell källa.
1. Beredning av primär Cell Culture
- Human Pancreatic Islet Isolering, dissociation och kultur
OBS: Vapen varje rör, plastspets eller en pipett med Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) medium för att förhindra att cellöar eller öceller från att fastna till plastytan, vilket kan leda till en betydande förlust av cellmaterial.- En dag före öceller dissociation tillsätt 1 ml av laminin-5-rika extracellulära matrix (härlett från 804G-celler som descrisäng i 29 referens) per 3,5 cm skål. Innan plätering celler, aspirera matrisen och tvätta skålen 3 gånger med sterilt dubbel destilleras vatten. Låt skålen torka under laminärt flöde skåp för 5 min.
- Inne i skåp med laminärt flöde, distribuera de erhållna cellöarna med CMRL medium i 15 ml rör (er). Centrifugera vid 272 x g under 5 min.
- Aspirera supernatanten och sedan återsuspendera pelleten i 1 ml steril Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) värmts upp till 37 ° C utan kalcium och magnesium. Centrifugera vid 272 x g under 5 min.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 1 ml DPBS.
- Att räkna det totala antalet cellöar, pipet 10 pl från en ml ösuspensionen i en ny 3,5 cm skål. Räkna antalet cellöar i 10 | il droppe under mikroskop och från denna beräkna det totala antalet cellöar i en ml ösuspensionen. Lägga 14 ml DPBS och centrifugera cellsuspensionen ett mertid vid 272 xg under 5 min.
- För öceller dissociation, aspirera supernatanten och tillsätt 1 ml av cell lossnar lösning för högst 1000 ö ekvivalenter (IEQ). Placera röret i ett vattenbad vid 37 ° C och försiktigt blanda öarna genom att pipettera upp och ned flera gånger varje minut, under 6-10 min.
OBS: För att kontrollera matsmältningen kvalitet, pipettera en 2 l droppe av suspensionen på en glasskiva och kolla under mikroskop att alla celler är väl separerade, och att inga dubbletter eller cellklumpar har kvar. - Stoppa reaktionen genom att tillsätta 14 ml kallt CMRL med tillskott (10% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% penicillin-streptomycin (P / S), 1% gentamycin, 1 % natriumpyruvat). Centrifugera vid 425 x g under 5 min. Aspirera supernatanten och tillsätt 15 ml CMRL-medium till cellpelleten.
- Resuspendera pelleten i en liten volym CMRL med kosttillskott. Räkna antalet celler i mikroskop med användning av en hemocytomätare, justera CMRL volym för att erhålla en cellkoncentration av ~ 650 000 celler / ml.
- Pipett 3 separerade droppar 100 pl vardera från den dispergerade cellsuspensionen som erhölls i steg 1.1.8 i en 3,5 cm skål i förväg belagd med laminin.
NOT: Celler fästa till skålen i omkring 24 timmar. - Inkubera cellerna (Figur 1A) i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C i en fuktig kammare. Ändra mediet i cellen sjunker var 2-3 dagar genom att aspirera 100 ul från varje droppe och ersätta den med samma volym av färskt medium.
- Humant Primär myoblast Kultur och differentiering till myotuber
- Vävnadsbiopsi, satellit cellisolering och myoblast kultur
Obs: Muscle biopsier erhölls från gruppen av Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Frankrike) 19.- Rena primära skelett myoblaster enligt tidigare beskrivna förfarandet 30.
- differentiera primary humana myoblaster till myotuber
- Ta en injektionsflaska (1 x 10 6 celler) av humana myoblaster lagrade i flytande kväve och tina cellerna snabbt genom att sätta flaskan under 30 sek till 1 min i ett vattenbad vid 37 ° C under omrörning.
- Pipettera celler (1 ml) i 24 ml tillväxtmedium som består av HAM F-10 kompletterat med 20% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycin och 0,2% amfotericin B.
- Centrifugera 5 min vid 150 x g.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 15 ml färskt tillväxtmedium per 2,5 x 10 5 celler.
- Plate åtminstone 2,5 x 10 5 celler per F75 vidhäftande kolv. Håll myoblaster i en cell inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- När cellerna når 60-80% konfluens, dissociera cellerna med trypsin-EDTA 0,05% för 1-2 min och plattan dem i 2 ml tillväxtmedium på adherenta 3,5 cm petri rätter.
- Efter att ha nått konfluens, avlägsna tillväxtmediet.
- Starta differentierings protocol av humana myoblaster till myotuber genom odling dem i 2 ml Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) innehållande 1 g / L glukos, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycin och 0,2% amfotericin B (differentieringsmedium) i en cellinkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra mediet var två till tre dagar.
OBS: myotuber bildas vanligen inom 7-10 dagar. - Kontrollera muskelcelldifferentiering under mikroskop (Figur 2A) genom att observera fusion av myoblaster in i polynucleated myotuber 19.
- Vävnadsbiopsi, satellit cellisolering och myoblast kultur
2. små störande RNA (siRNA) Transfektion
- siRNA Transfektion av humant ö-celler
OBS! Transfektion protokollet utförs i droppar 100 pl på nästa dag efter cell dissociation (steg 1.1.1-1.1.10).- Aspirera 100 | j, l av CMRL medium från varje droppe och ersätta den med samma volym av serumfritt Minimal Essential Medium (MEM) 2 timföre transfektion genom pipettering.
- Förbered en MEM baserad blandning av transfektionsreagens och 50 nM mål siRNA (siClock) eller 50 nM icke-targeting siControl enligt tillverkarens anvisningar.
- För en maträtt med 3 droppar förbereda två 1,5 ml rör med 200 pl MEM vardera.
- Lägg till ett av dessa rör 4 | il av transfektionsreagens.
- Lägg till det andra röret 1 pl av lämplig siRNA stamlösning (20 ^ M).
- Agitera dessa två rör långsamt på orbitalskak under 5 min och sedan blanda innehållet i rören tillsammans och agitera för 20 mer min.
- Aspirera 100 pl MEM från varje droppe och ersätta den med samma volym av transfektion mix som erhållits i föregående steg genom pipettering.
- Ersätta transfektionslösningen med CMRL medium efter 4 h av inkubering vid 37 ° C. Upprepa steg 2.1.1-2.1.3 följande dag för omval av en cell transfektion.
- siRNA Transfektion av mänskliga myotuber
- Före transfektion, byt medium (se steg 1.2.2.8) med 2 ml färskt differentieringsmedium per 3,5 cm petriskål.
- I ett sterilt 1,5 ml rör, förbereda en blandning av 20 nM siRNA (siControl eller siClock), vilket motsvarar 2,4 | il av en 20 pM siRNA lösning, och 12 | il av transfektionsreagens utspädda i 100 pl differentieringsmedium. Inkubera lösningen vid rumstemperatur under 15 min med försiktig omrörning.
- Transfektera celler med 114,4 | il av siRNA mix per 3,5 cm petriskål och placera celler i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 timmar.
3. Kontinuerlig Långsiktig Circadian mareld inspelning utförs parallellt med bedömning av hormonutsöndring i levande mänsklig primära celler
- Presentation Circadian Bioluminescence Reportrar i humana primära celler genomLentiviral Transduction
OBS: Alla förfaranden med lentivirala partiklar måste utföras i en skyddsnivå 2 möjlighet att vidta ytterligare försiktighetsåtgärder för arbete med medel som utgör en måttlig potentiell risk för personal och miljö.- Förbered reporter lentivirala partiklar genom samtransfektering vektorn av intresse pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc eller pLV156-PER2-dLuc (kallad Bmal1-luc och PER2-luc, respektive) plasmiden 31 med lentivirala vektorer pMD2G och psPAX i 293T-celler med användning av polyetylenimin metoden (för detaljerade instruktioner se referens 16).
- Titrera de erhållna lentivirala partiklarna (detaljer om titreringen kan erhållas http://lentilab.unige.ch/). För ytterligare experiment, använder lentivirus med titer som sträcker sig 10 4 till 10 5 transducerande enheter [TU / l].
- Placera rätter med humana öceller eller mänskliga myoblaster (vid 30-50% konfluens) inne i laminärt flöde kabinenet och ersätta mediet med 2 ml färskt kompletterat CMRL-medium (se steg 1.1.7) eller tillväxtmedium (se steg 1.2.2.2), respektive.
- Beräkna infektionsmultiplicitet (MOI) (dvs. infektiösa partiklar (transducerande enheter) / antal celler).
- Transducera den primära cellkulturen genom att pipettera lentivirus lösning på skålen för att erhålla en MOI = 3 (till exempel för 65000 vidhäftade celler tillsätt 3 | il av viruslösningen med titern av 6,5 x 10 4-100 pl mediet droppe).
- Inkubera över natten i en vävnadsodlingsinkubator. Byt medium nästa dag.
OBS: transducera humana öceller minst 4 dagar före bioluminescens inspelning för att uppnå tillräcklig expression av reporterkonstruktionen. Myoblaster transduceras under expansionsfasen, sedan vuxit till sammanflödet, och därefter differentieras i myotuber.
- I vitro Synkronisering av humana primära celler
- <li> Lägg till 10 | iM av adenylylcyklas aktivator i 2 ml medium per 3,5 cm petriskål innehållande de primära celler som tidigare transduced i steg 3.1.5.
- Inkubera i 60 min vid 37 ° C i en cellodlingsinkubator.
- Ändra mediet innehållande adenylylcyklas aktivator med 2,5 ml av registreringsmediet innehållande 100 | iM luciferin.
NOTERA: För humana öceller använda CMRL kompletterat med 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 1% gentamycin; för mänskliga myotuber använda fenolrött - fri DMEM med 1 g / L glukos som kompletterats med 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 0,5% gentamycin och 0,2% amfotericin B.
4. Parallell Bedömning av dygns mareld inspelning och hormon profiler i Synkroniserad Human sekretorisk primära celler
- Konfigurera Långsiktig Konstant perifusion och mareld inspelning för mänskliga primära celler.
OBS: Vid arbete outside laminärt flöde skåp, rena alla kontaktytor och begränsa exponering av kulturer eller medium till luften för att undvika kontaminering.- För att framställa den perifusion mediet, tillsätt 100 | iM av luciferin till mediet.
NOTERA: För humana öceller använda CMRL kompletterat med 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 1% gentamycin; för mänskliga myotuber använda fenolrött - fri DMEM med 1 g / L glukos som kompletterats med 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 0,5% gentamycin och 0,2% amfotericin B. - Inne i skåp med laminärt flöde, öppnar de 3,5 cm skålar innehållande de transducerade, transfekterade och synkroniserade primära cellkulturer (öceller eller myotuber) såsom beskrivits ovan. Sätt sterila metallkåpor (egenutvecklade) (Figur 1B2) i 3,5 cm skålar som är utrustade med silikon inflöde / utflödes ansluter rören (figur 1B1 / B5).
- Placera skålarna på mätplattan i 37 ° C light tätt inkubator. Fäst rätter till plattformen med hjälp av en skruvbart adapter (Figur 1B3). Sätt i inflöde / utflödesrören hos perifusion systemet i lämpliga silikonrören hos locket (Figur 1B1 / B5) och ställa in hastigheten på pumpen vid en flödeshastighet av ~ 0,5 ml medium per 1 timme.
- Öppna egenutvecklade Dropps biolumicorder programvara som registrerar signalerna från fotomultiplikatorröret (PMT) detektor. Välj den katalog där data lagras och starta kontinuerlig bioluminiscens inspelning från varje skål genom att klicka på ikonen "start".
OBS: Som alternativ till den Dropps biolumicorder programvara, andra program (t ex LumiCycle), kan användas för att spela in signaler från PMT detektor. - Placera sterila 6-brunnars vävnadskulturplattor i uppsamlingslådan på is.
- Öppna styrprogram som styr tidpunkten för den automatiska brytaren bland uppsamlingsbrunnarna. Ställ in tid window av medel samling (sek). Starta insamling av utflödet mediet var 4 timmar (14.400 sek; ~ 2 ml per tidspunkt) genom att klicka på ikonen "run".
- Överföra och mäta utflödet mediet från varje uppsamlingsbrunn i sterila 2 ml rör genom pipettering. Hålla rören i en -20 ° C frys innan nästa steg. Upprepa steg 4.1.5-4.1.6 varje 24 timmar.
- Stoppa mareld inspelning och mediumflödet genom att klicka på "stopp" -ikonen på motsvarande programvara. Ta bort metall locken och aspirera återstående mediet från skålarna.
- För att normalisera det utsöndrade proteinet värden som erhållits i olika experiment, antingen extrahera DNA (normalisering av genomisk DNA-innehåll för myotuber 19), eller tillsätt 1 ml lys syraetanol buffert (normalisering av total hormonhalten för öceller 18) till rätter.
- För att framställa den perifusion mediet, tillsätt 100 | iM av luciferin till mediet.
5. Mätning Islet hormon och Myokine nivåer i utflödetMedium uppnådda genom kontinuerlig perifusion av humana primära endokrina celler
- Insulin
- Kvantifiera basala insulinnivåer i utflödet mediet från uppsamlade tidpunkter genom användning av en humaninsulin enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) -kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Normalisera data till den absoluta volymen av uppsamlat medium i varje brunn och att den totala halten insulin, extraheras från syra-etanol behandlade cellerna vid slutet av experimentet (steg 4.1.9) 18.
- Interleukin-6 (IL-6)
- Kvantifiera basal IL-6-nivåer i utflödet mediet från uppsamlade tidpunkter genom användning av en human IL-6 ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Normalisera data till den absoluta volymen av uppsamlat medium i varje brunn och att genomiskt DNA-innehåll vid slutet av experimentet (steg 4.1.9).
6. Circadian Dataset Analys för Bioluminesscens och hormonutsöndring Profiler
- bioluminescence Analys
- Analysera bioluminiscens profil med den medföljande programvaran 19.
- JTK-cykel analys
- Analysera hormon profiler och mareld inspelning resultat genom att använda JTK_CYCLE algoritmen 32.
- Ställ dygnsperioden bredd på 20-24 timmar.
OBS: Vid de experimentella betingelserna registrerades parallellt, kan utföras ett parat statistisk analys för att jämföra experimenten.
- CosinorJ Analys
- Alternativt, analysera hormonutsöndring och dygns mareld profiler med hjälp av CosinorJ programmet 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bedömning av Islet hormon med parallell Circadian mareld inspelning från Perifused Human ö-celler
Efter att ge en första molekylär karakterisering av dygnsrytm klocka, verksam i humana öceller 16, vi syftar till att studera effekterna av störningar klocka på holme funktion och transkription 18. Vi satte upp ett effektivt siClock transfektion protokoll i spridda humana öceller (se protokoll för detaljer), vilket resulterade i mer än 80% knockdown av KLOCKAN mRNA, och en effektiv klock ablation mätt med dygnsrytm bioluminiscens profilering 18. Glukos insulinsekretion (GSIS) analys visade signifikant reducerad basal och stimulerad insulinsekretion vid sådana störningar klocka (ej visad). För att bedöma hormon av humana cellöar runt dygnet, en Continnuerlig perifusion systemet var anslutet till en luminometer (avbildad i figur 1B). Humana cellöar, som bär en funktionell (siControl) eller dysfunktionella (siClock) oscillator transducerades med Bmal1-Luc Lentiviral partiklar. Cellerna därefter synkroniseras med en puls av adenylylcyklas aktivator följt av parallell analys av dygnsrytm bioluminiscens och insulinutsöndring i utflödet mediet under 48 timmar (Figur 1C, D 18). Dessa experiment antyder att under konstant fysiologiska glukoskoncentration (5,6 mM glukos), insulinutsöndring av in vitro synkroniserade humana öceller uppvisar en dygnsprofilen, som avbryts i siClock lager prover (Figur 1D).
Studera Myokine Utsöndring av Human Skeletal myotuber Synchronized in vitro i närvaro eller frånvaro av funktionell klocka
33, vi syftar till att karakterisera dygnsrytmen i primära humana skelett myotuber och till att undersöka deras roll i myotube funktion 19. För detta ändamål har störningar i dygnsrytm klocka i skelett myotuber uppnås genom transfektion siRNA inriktning CLOCK. Dygns mareld reporter analyser med Bmal1-luc och PER2-Luc reportrar avslöjade att mänskliga skelett myotuber, synkroniserade in vitro, uppvisar en självbärande dygnsrytm, vilket ytterligare bekräftades genom endogen klockfrekvens avskrift uttryck (Figur 2B, 19). Denna endogena klocka var effektivt störs i närvaro av siRNA inriktning CLOCK (Figur 2B). Dessutom den basala sekretionen av IL-6 (figur 2C), interleukin-8 (IL-8)och monocytkemotaktisk Protein 1 (MCP-1) (ej visat) genom synkroniserade skelett myotuber, som bedömts av här beskrivna perifusion system (figur 1 B) och efterföljande storskalig myokine multiplex-analys (ej visat), uppvisar en cirkadisk profil, som är starkt oreglerad vid störningar klocka (figur 2C 19).
Figur 1: Utvärdering av hormonutsöndring med parallell Circadian mareld inspelning från Perifused Human ö-celler (A) representativ bild av bifogade humana cellöar en dag efter holme dissociation.. (B) Schematisk presentation av hemgjorda perifusion system som innefattar en flaska med perifusion mediet, en pump, en mätning plattform utrustad med ett fotomultiplikatorrör (PMT) i den ljustätt inkubatorEn luminometer anordning, som styrs av inspelningsprogrammet, och en halvautomatisk provsamlare. Infoga: (B1) tillströmning anslutningsröret; (B2) metalliskt lock för 3,5 cm petriskål; (B3) skruvbar adapter som fäster locket till mätplattan (B4); (B5) utflöde anslutningsröret; (B6) automatiskt styrd medel distributör. (C) Mänskliga öceller transfekterades med antingen scrambled siRNA (siControl) eller siRNA targeting CLOCK (siClock) och transduceras med Bmal1-luc reporter. Cellerna ständigt perifused med odlingsmedium innehållande 5,6 mM glukos. Dygnsrytm bioluminiscens spelades in efter synkronisering av en adenylylcyklas aktivator puls. (D) Insulinnivåerna bedömdes genom ELISA i utflödet prover som samlats varje 4 h under 48 timmar. Tillämpning av JTK_CYCLE algoritm 32 bekräftade att presence av en funktionell klocka (siControl), den genomsnittliga profilen av utsöndrat insulin var dygnsrytm inom 48 h, med en period längd på 24,19 ± 0,89 h (** p = 0,009, n = 7 donatorer). Denna dygnsrytm profilen förloras vid störningar klocka (siClock). Data presenteras som% av utsöndrat hormon från total hormonhalt (medelvärde ± SEM) för n = 7 givare (en likadana för varje donator) .Detta siffra har ändrats från 18 referens. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2:. Basal IL-6-utsöndring av Human Skeletal myotuber starkt hämmas i frånvaro av en funktionell dygnsrytm klocka myoblaster var transduced med lentivirala partiklarinnehållande Bmal1-luc transgen, differentieras till myotuber, och transfekterades med antingen siControl eller siClock siRNA. 24 timmar efter transfektion, myotuber synkroniserades med en adenylylcyklas aktivator puls och utsattes för kontinuerlig perifusion med parallella bioluminiscens inspelning. (A) Representativa bilder togs vid dag 0 (D0) och D7 efter bytet från 20% till 2% FBS innehållande medium för att inducera myotuber differentiering. Under differentieringsprocessen, humana myoblaster omorienteras, bli långsträckt och smälta samman för att bilda en plurinuclated syncytium. (B) Bmal1-luc mareld profiler siControl transfekterade myotuber (svart linje) och siClock transfekterade myotuber (grå linje). Bmal1-luc svängningsprofiler registrerades i tre oberoende experiment (en donator per experiment). (C) representant basala IL-6-utsöndringprofilen i närvaro eller frånvaro av en funktionell klocka. Den perifusion utflödes mediet samlades upp i 4 h intervall under 48 h (0-4 motsvarar ackumuleringen av IL-6 mellan 0 h och 4 h). IL-6-nivåer i mediet bedömdes med ELISA i två tekniska dubbletter från tre oberoende experiment. Resultaten representerar basala IL-6-nivåer normaliserade till det totala DNA-innehållet. IL-6-utsöndring minskade i genomsnitt 69,30 ± 10,61% vid klockan störningar dygnsrytm (medelvärde ± SEM, n = 3; * P <0,05, parat t-test). Denna siffra har ändrats från referens 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De experimentella inställningar som beskrivs här består av Lentiviral leverans av dygns mareld reportrar i odlade humana primära celler, följt av efterföljande in vitro synkronisering och kontinuerlig registrering av bioluminiscens i flera dagar, och parallell analys av hormonutsöndring av samma celler. De representerar en effektiv strategi för att utforska molekylära mekanismer och funktionella aspekter av dygnsklockan i humana primära celler.
Kvaliteten på donatormaterialet är en viktig fråga för framställningen av viabla primära vävnadskulturer. Kvaliteten på humana öar bör utvärderas varje gång innan experimentet. Holmar med beräknad renhet och / eller lönsamheten sämre än 70% rekommenderas inte för dessa experiment. Öceller tenderar att återupprätta kontakter i dissocierade kulturer, som spelar en viktig roll i deras överlevnad och funktion. Eftersom cellöar inte förökar sig culture måste de pläteras vid en hög densitet, vilket tillåter celler att etablera kontakter med angränsande celler. Detta uppnås genom utstrykning av celler i små droppar av en liten volym. Viktigare, är celldöd högre i låg densitet islet cellkulturer. Observera att medel ersättning bör utföras snabbt för att undvika cell torkning.
Myoblaster bör passe företrädesvis vid 60% konfluens, eftersom en högre densitet kan inducera myoblast differentiering. Efter trypsinering, bör myoblaster noggrant suspenderas och sprids för att undvika cellkluster.
Bakteriell eller svampkontaminering av primära celler bör uteslutas mikroskopiskt innan perifusion analysen. Odlingsmedium kan kompletteras med svampdödande ämnen. Dessutom bör perifusion slangen sköljas av alkohol jod desinfektion / sterilt vatten och de metalliska lock bör steriliseras genom autoklavering. Dessa steg rekommenderas mellan varje eXperiment.
För effektiv bioluminescens inspelning, bör kvaliteten av reporter lentivirus beredningen bestämmas genom intensiteten hos den bioluminescerande signalen. Detaljerna i lentivirus produktion inklusive felsökning kan hittas på http://lentilab.unige.ch/. Före plasmid transfektion för lentivirus produktion bör 293T celler ströks ut vid 30-50% konfluens. Det rekommenderas att utföra en kontroll av transfektionseffektiviteten i en parallell maträtt, till exempel med hjälp av CMV-GFP eller ett alternativt fluorescerande lentivector. För varje viruspreparat bör fastställas viruset titer.
Som de beskrivna experimenten vanligtvis långvariga (48 timmar eller mer), är det viktigt att ha en stabil tysta under denna tidsperiod. Koncentrationen av siRNA bör optimeras såväl som cellsammanflytning i enlighet med siRNA reagensprotokoll. Effektivitet av geners uttryck måste testas i slutet av experiment av RT-qPCR eller genom Western blotting.
Under perifusion, bestämmer flödeshastigheten den tid som behövs för att fullständigt byta ut mediet i skålen men har också en mekanisk påverkan på den primära cellkulturen. Faktum är att sätta upp flödet vid en hastighet, som är för låg, kommer inte att möjliggöra en fullständigt utbyte av medium i skålen, och kommer att minska känsligheten för metoden. Tvärtom kan en flödeshastighet höghastighets skada cellerna. I våra händer, gjorde det optimala varvtalet för båda celltyperna tillåter att samla in 0,5 ml av utflödet medium per 1 timme.
Viktigare, för att erhålla en mätbar koncentration av ämnen i utflödet mediet, bör ett tillräckligt antal utsöndrande celler vara närvarande i den perifused skålen. Uppföljningen metod för detektion av det utsöndrade ämnet (ELISA eller andra) bör vara tillräckligt känslig, särskilt för ämnen som utsöndras i mycket låga koncentrationer. Högre celldensitet kan rekommenderas för att övervinnadetta problem när det är möjligt. Alternativt, kan utflödet mediet koncentreras genom dialys eller med centrifugalfilter, som beskrivits av oss i detalj i referens 19.
Sammantaget våra experiment i humana bukspottcellöar och i primära myotuber ger för första gången övertygande bevis för att dessa mänskliga celler har hög amplitud cellautonoma dygnsklockan 18-19. Användning av den här beskrivna perifusion kombinerat med en luminometer enhet (Figur 1B) har vi visat att dessa klockor spelar en viktig roll i den cirkadiska regleringen av basala insulinutsöndring genom bukspottcellöar (figur 1D), och av basal IL6 utsöndring av skelett myotuber (figur 2C). Dessutom, genom att knacka ner den klockfrekvens genen klocka i både experimentella system, visar vi att en funktionell dygnsrytm oscillator krävs för korrekt rytmisk insulin och IL-6-utsöndringav mänsklig islet och skelettmuskelceller, respektive (figurerna 1C, D och 2B, C). Våra resultat tyder på en avgörande roll för den mänskliga ö klockan för korrekt insulinutsöndring, och är i god överensstämmelse med verk utförda i gnagare genetiska modeller 15,17. Med tanke på den viktiga roll som den dygnsrytm klocka att låta organismer att förutse dagliga miljöförändringar snarare än att reagera på dem, kan dygnsrytm reglering av basinsulin och myokine sekre representera en sådan föregripande mekanism som samordnar pankreasö och skelettmuskulaturen sekretoriska verksamhet till rest- aktivitet cykel av hela kroppen.
Den här föreslagna metoden kan lätt modifieras för att studera ytterligare hormon från samma vävnader. Vi har redan analyserat ytterligare stor panel av myokines utsöndras av skelettmuskelceller, med hjälp av multiplex mänskliga myokine arrayer 19, och vi är i färd med att utvärderaing glukagonsekretionen av humana ö-celler med hjälp av Glukagon ELISA-kit (data visas ej). Dessutom kan dessa experimentella betingelser optimeras för andra celltyper, t ex primära adipocyter, för att studera adipocytokiner sekretion, primära thyrocytes för att studera sköldkörtelhormon sekretion, primära enterocyter för att studera inkretiner sekretion, etc. En ytterligare viktig tillämpning av detta system skulle kunna vara att undersöka effekterna av fysiologiska och / eller farmakologiska föreningar på cell dygnsrytm klockfunktion och utsöndring. Föreningen av intresse kan tillämpas kontinuerligt under hela experimentet (till exempel studera insulinutsöndring av humana ö-celler i närvaro av hög glukos eller olika nivåer av fria fettsyror), eller föreningen kan tillsättas vid en vald fas av den cirkadiska cykel.
Denna teknik har begränsningarna hos en in vitro-studie och representerar inte komplexiteten i dygnsrytm förordning på en hela kroppen nivå. Samtidigt hjälper det att urskilja rollen som en autonom klocka på cellulär metabolism under kontrollerade förhållanden. För närvarande tillgängliga metoder är baserade på ögonblicksmätningar av sekretionsaktivitet i cellerna eller explantat följande i synkronisering vitro 17. Protokollet som beskrivs här är en unik metod som tillåter en samstämmig och kontinuerlig analys av dygnsrytmen och sekretorisk aktivitet inom samma cellkultur. Alternativt kan denna metod användas för att studera kinetiken av icke-dygnssjälvlysande reportrar i samband med cellutsöndring, liksom för att detektera effekterna av olika ämnen som tillsätts till perifusion medium på cellfunktion. De kritiska stegen i protokollet är: 1) effektiv lentivirus förberedelse, 2) effektiv cell transfektion med siRNA och reporter vektorer överföring; 3) konstant medel utflöde insamling och 4) att se till att ett tillräckligt antal cells används för att erhålla mätbara nivåer av hormoner eller cytokiner i den uppsamlade utflödet medium (se felsöknings ovan).
Med tanke på de senaste bevis på kopplingen mellan dygnsrytm klocka störningar och metabola sjukdomar och cancer hos människor 3-4,28,34-35, studerar perifera klock egenskaper mänskliga i primärkulturer kan utgöra en viktig och unik metod för att förstå den potentiella klock anslutning till dessa sjukdomar. Således vår upptäckt av att det finns kopplingar mellan funktionell human pankreas holme och skelettmuskulaturen klocka och basal utsöndring av insulin och myokines kan bära eventuella konsekvenser för förståelsen av utvecklingen av kroniska sjukdomar, såsom fetma och typ 2-diabetes 18-19 och kommer att innebära nya möjligheter för behandling av dessa sjukdomar. Viktigare, på grund av den etablerade korrelationen mellan in vitro bedömda oscillator egenskaper och in vivo 36, innebörden av dygnsrytm klocka egenskaper mänskliga som ett kännetecken för sjukdomar, är av högsta och omedelbar klinisk relevans 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för våra kollegor från University of Geneva: Jacques Philippe för konstruktiva synpunkter på detta arbete, Ueli Schibler för ovärderlig hjälp med utvecklingen av perifusion systemet och för vetenskaplig inspiration, André Liani för att ha tänkt konstruktion, tillverkning och driftsättning av perfusionssystemet, Lesa-Technology Ltd bolag för stöd i perifusion systemet och Dropps biolumicorder mjukvaruutveckling, George Severi för hjälp med perifusion experiment Ursula Loizides-Mangold för kritiskt läsa manuskriptet, och Anne-Marie Makhlouf för lentivirus preparat ; till Etienne Lefai, Stéphanie Chanon och Hubert Vidal (INSERM, Lyon) för framställning av humana primära myoblaster; och Domenico Bosco och Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Geneva Universitetssjukhuset) för att ge humana öar. Detta arbete har finansierats av Swiss National Science Foundation Grant No. 31003A_146475 / 1, Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur diabete, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny, och Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al.
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H.
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A.
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E.
- Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
