Abstract
relógios circadianos são funcionais em todos os organismos sensíveis à luz, permitindo uma adaptação ao mundo externo, antecipando mudanças ambientais diárias. progressos consideráveis na nossa compreensão da estreita ligação entre o relógio circadiano e a maioria dos aspectos da fisiologia tem sido feito no campo ao longo da última década. Entretanto, desfazendo a base molecular que está na base da função do oscilador circadiano em humanos permanece mais elevada do desafio técnico. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de uma abordagem experimental para o longo prazo (2-5 dias) de gravação bioluminescência e coleta médio saída em células primárias humanas cultivadas. Para este fim, temos transduzidas células primárias com um repórter de luciferase de lentivírus que está sob o controle de um promotor do gene do núcleo do relógio, o que permite a avaliação paralela de secreção hormonal e bioluminescência circadiano. Além disso, descrevemos as condições para interromper o relógio circadiano no prcélulas humanas imary por transfecção siRNA CLOCK segmentação. Nossos resultados sobre a regulação circadiana da secreção de insulina pelas ilhotas pancreáticas humanas e Myokine secreção pelas células de músculo esquelético humano, são aqui apresentados para ilustrar a aplicação desta metodologia. Essas configurações podem ser usadas para estudar a composição molecular de relógios periféricos humanos e analisar o seu impacto funcional em células primárias em condições fisiológicas ou fisiopatológicas.
Introduction
O sistema de temporização circadiano (do latim "Circa diem") surgiu em todos os organismos sensíveis à luz, como um mecanismo adaptativo à rotação da Terra. Nos mamíferos, ele é organizado de uma maneira hierárquica, englobando o relógio central, que está situado no núcleo supraquiasmático do hipotálamo ventral e periférica (ou secundário) osciladores que se encontram em vigor nos diferentes órgãos. Além disso, estes osciladores autónomos auto-sustentadas de células são funcionais em quase todas as células do corpo 1. Sinais fóticas representam uma sugestão de sincronização dominante (Zeitgeber) para os neurônios SCN, enquanto que os sinais neurais e humorais que emanam do SCN repor os relógios periféricos. Em ritmos de repouso-atividade de adição, que dirigem em ciclos de alimentação-jejum, por sua vez, são outros sincronizadores para relógios periféricos 2. De acordo com o nosso conhecimento actual, a composição molecular do clock do núcleo é baseada na transcrição e translaçãoloops de feedback adicionais, que são conservadas entre organismos. Esta inclui os activadores de transcrição BMAL1 e CLOCK, que juntos ativam a transcrição dos genes negativos núcleo de clock por e chorar. Altos níveis de PER e proteínas Cry vai inibir a sua própria transcrição através da inibição do complexo / CLOCK BMAL1. Um circuito auxiliar consiste nos receptores nucleares REV-ERBs e Rors, que também regulam a transcrição de BMAL1 e CLOCK. Além disso, os eventos pós-translacionais, incluindo a fosforilação, sumoylation, acetilação, O-GlcNAcylation, a degradação ea entrada nuclear das proteínas do núcleo do relógio representam uma camada de regulamentação adicional importante no estabelecimento do 24 hr ciclo de oscilação 3.
Evidências acumuladas resulta de estudos em modelos de roedores e destaca o papel crítico do sistema circadiano na coordenação das funções metabólicas e endócrinas 4-5. Um número de large-escala transcriptoma análise sugerem que a alimentação - ciclos jejum desempenhar um papel central na sincronização dos osciladores periféricos 6-8. Num acordo com estes estudos, a análise metabolômico e lipidomas em roedores e seres humanos revelaram que um grande número de metabolitos oscilar em tecidos, plasma, saliva e de um modo circadiano 9-11. É importante ressaltar que a maioria dos hormônios apresentam ritmos circadianos em 5,12-13 sangue. Além disso, relógios circadianos do hormônio correspondente produzindo tecidos periféricos pode regular a secreção hormonal localmente. Osciladores circadianos Cell-autónoma foram descritos em roedores e células de ilhéus pancreáticos humanos 14-16. Estes osciladores desempenham um papel essencial na regulação do transcriptoma de ilhotas pancreáticas e função 15,17-18. Além disso, Myokine secreção por miotubos esqueléticos humanos tem sido recentemente demonstrada a exibir um padrão circadiano, que é regulada por osciladores de células-autônomaRS operatórias nestas células 19.
Várias abordagens para estudar ritmos circadianos em humanos in vivo têm sido amplamente utilizados. Por exemplo, a melatonina plasma ou níveis de cortisol, bem como a temperatura da superfície da pele torácica (revisto em referências 3,20) foram estudados para avaliar relógios circadianos endógenos. Embora estes métodos permitem estudar oscilações circadiano sistêmicos in vivo, eles estão longe de fornecer uma avaliação fiável dos ritmos circadianos autónomas free-running em diferentes órgãos e tecidos. No entanto, como dissecção da regulação sistêmica seria uma ferramenta indispensável para compreender o efeito específico de relógios moleculares intracelulares sobre a função destas células. Portanto, um esforço substancial tem sido empreendido para desenvolver abordagens confiáveis para estudar relógios humanos em cultura de células imortalizadas ou primárias sincronizados in vitro. Mais importante, foi demonstrado quecaracterísticas relógio medidos em células de fibroblastos da pele primária cultivadas reflecte fielmente as propriedades de clock individuais de todo o organismo 21. O desenvolvimento de repórteres circadianos fluorescentes e bioluminescentes avançou fortemente esta abordagem 22-27. Além disso, os relógios que estudam células primárias que são derivadas de diferentes órgãos periféricos permite a investigação das propriedades moleculares de relógios específicos de tecidos humanos 3,5,16,19-20,28. Assim, a avaliação dos relógios circadianos in vitro explantes ou células primárias sincronizados, usando repórteres bioluminescentes, representa um método muito útil para estudar a composição molecular de relógios periféricos humanos e seu impacto na função do órgão.
Neste artigo, vamos apresentar protocolos detalhados para avaliar a expressão do gene circadiano nas células das ilhotas primário e músculo-esquelético humano sincronizados in vitro, bem como o impacto do relógio celular autónomaperturbações da função secretora destas células.
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Protocol
Declaração de ética: Manipulações incluídos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê do Hospital Universitário de Genebra de Ética e pela Comissão de Ética SUD EST IV (Acordo 12/111) 19. Ilhotas humanas foram isoladas de pâncreas de doadores de múltiplos órgãos com morte cerebral na Transplantation Centro Ilhota no Hospital Universitário de Genebra (Suíça), conforme descrito por nós em referências 16,18, ou obtidos de uma fonte comercial.
1. Preparação da cultura de células primárias
- Isolamento Islet humana Pancreatic, dissociação e Cultura
NOTA: Revestimento cada tubo, a ponta de plástico ou com pipeta Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) médio, a fim de evitar ilhéus ou células dos ilhéus se colem à superfície do plástico, o que pode levar a uma perda significativa de material celular.- Um dia antes da ilhota de dissociação de células adicionar 1 ml de matriz extracelular rica laminina-5-(derivados de células como descri 804Gcama na referência 29) para 3,5 cm de placa. Antes do plaqueamento de células, a matriz aspirar e lavar o prato 3 vezes com água bi-destilada estéril. Colocar a placa de a secar sob a câmara de fluxo laminar durante 5 min.
- Dentro da câmara de fluxo laminar, distribuir as ilhotas obtidas com meio CMRL em 15 de tubo (s) ml. Centrifugar a 272 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante, e em seguida ressuspender o sedimento em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril de Dulbecco (DPBS) pré-aquecido a 37 ° C sem cálcio e magnésio. Centrifugar a 272 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de DPBS.
- Para contar o número total de ilhéus, de pipeta 10 ul da suspensão de ilhotas de 1 ml para um novo prato de 3,5 centímetros. Contar o número de ilhotas na gota de 10 ul sob o microscópio e a partir deste cálculo do número total de ilhéus na suspensão de ilhotas de 1 ml. Adicionar 14 ml de DPBS e centrifugar a suspensão de células uma maistempo em 272 xg durante 5 min.
- Para a dissociação de células ilhotas, aspirar o sobrenadante e adicionar 1 ml de solução de separação celular para um máximo de 1.000 equivalentes de ilhotas (IEQ). Colocar o tubo em banho-maria a 37 ° C e misturar suavemente as ilhotas por pipetagem para cima e para baixo várias vezes por minuto, durante 6-10 min.
NOTA: Para verificar a qualidade da digestão, pipetar uma gota 2 ul de suspensão sobre uma lâmina de vidro e verifique sob o microscópio que todas as células são bem separados, e que não doublets ou aglomerados de células permaneceram. - Parar a reacção por adição de 14 ml de CMRL frio com suplementos (soro de bovino fetal a 10% (FBS), 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S), 1% de gentamicina, 1 % de piruvato de sódio). Centrifugar a 425 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 15 ml de meio CMRL ao sedimento celular.
- Ressuspender o sedimento num pequeno volume de CMRL com suplementos. Contar o número de células ao microscópio usando uma hemocytometros, ajustar o volume CMRL, a fim de se obter uma concentração celular de ~ 650, 000 células / ml.
- Pipetar 3 separados gotas de 100 ul cada da suspensão de células dispersas, obtido no passo 1.1.8 em um 3,5 cm de placa pré-revestida com laminina.
NOTA: As células anexar ao prato em cerca de 24 horas. - Incubar as células (Figura 1A) numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C numa câmara húmida. Alterar a forma da célula de gotas a cada 2-3 dias por aspiração de 100 ul de cada gota e substituindo-o com o mesmo volume de meio fresco.
- Mioblasto cultura primária humana e diferenciação em Miotubos
- biópsia de tecido, isolamento das células e cultura de mioblastos satélite
Nota: As biópsias musculares foram obtidos a partir do grupo de Etienne Lefai (INSERM, Lyon, França) 19.- Purificar mioblastos esqueléticos primários de acordo com o procedimento previamente descrito 30.
- diferenciando pmioblastos humanos rimary em miotubos
- Tomar um frasco (1 x 10 6 células) de mioblastos humanos armazenados em azoto líquido e descongelar células rapidamente, colocando o frasco durante 30 segundos a 1 min num banho de água a 37 ° C com agitação.
- células de pipeta (1 ml) em 24 ml de meio de crescimento, composto de Ham F-10 suplementado com 20% FBS, 1% de P / S, 0,5% de gentamicina e 0,2% de anfotericina B.
- Centrifugar 5 min a 150 x g.
- Remover as células sobrenadante e ressuspender com 15 ml de meio de crescimento fresco por 2,5 x 10 5 células.
- Placa, pelo menos, 2,5 x 10 5 células por balão F75 aderente. Manter os mioblastos em uma incubadora celular a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Uma vez que as células atingem 60-80% de confluência, dissociar as células com tripsina-EDTA a 0,05%, durante 1-2 min e placa-los em 2 ml de meio de crescimento sobre aderentes 3,5 cm pratos de petri.
- Depois de atingir a confluência, remover o meio de crescimento.
- Inicie o proto diferenciaçãoCol de mioblastos humanos em miotubos através da sua cultura em 2 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo 1 g / L de glucose, 2% de FBS, 1% de P / S, 0,5% de gentamicina e 0,2% de anfotericina B (meio de diferenciação) numa incubadora celular a 37 ° C e 5% de CO 2. Mudar o meio cada 2 a 3 dias.
NOTA: Miotubos são geralmente formadas dentro de 7-10 dias. - Verifique a diferenciação de células de músculo sob o microscópio (Figura 2A) através da observação da fusão de mioblastos em miotubos polynucleated 19.
- biópsia de tecido, isolamento das células e cultura de mioblastos satélite
2. pequeno ARN interferente (siRNA) Transfecção
- siRNA Transfecção de células de ilhéus humanos
NOTA: O protocolo de transfecção é realizada em gotas de 100 ul no dia seguinte, depois de dissociação de células (passos 1.1.1-1.1.10).- Aspirar 100 ul de meio CMRL de cada gota e substituí-la com o mesmo volume de soro livre de Meio Essencial Mínimo (MEM), 2 hrantes da transfecção por pipetagem.
- Prepara-se uma mistura à base de MEM de reagente de transfecção e 50 nM de alvo ARNsi (siClock) ou 50 nM de não-siControl segmentação de acordo com as instruções do fabricante.
- Para um prato com 3 gotas preparar dois tubos de 1,5 ml com 200 ul de MEM cada.
- Adicionar a um destes tubos de 4 ul de reagente de transfecção.
- Adicionar ao segundo tubo 1 ul da solução de estoque de siRNA apropriado (20 pM).
- Agita-se estes dois tubos lentamente no agitador orbital durante 5 minutos e, em seguida, misturar o conteúdo dos tubos em conjunto e agitar por mais 20 min.
- Aspirar 100 ul de MEM de cada gota e substituí-lo com o mesmo volume de mistura de transfecção obtido na etapa anterior por pipetagem.
- Substituir a solução de transfecção com meio CMRL após 4 h de incubação a 37 ° C. Repita os passos 2.1.1-2.1.3 no dia seguinte para a célula re-transfecção.
- Transfection siRNA de Miotubos Humanos
- Antes da transfecção, substituir o meio (ver passo 1.2.2.8) com 2 ml de meio fresco diferenciação por 3,5 centímetros prato de petri.
- Em um tubo esterilizado de 1,5 mL, preparar uma mistura de 20 nM de ARNsi (siControl ou siClock), o que corresponde a 2,4 mL de uma solução 20 uM de siRNA, e 12 ul de reagente de transfecção diluído em 100 ul de meio de diferenciação. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 15 min com agitação suave.
- Transfectar células com 114,4 ul da mistura de ARNsi por 3,5 cm de petri de células de prato e colocar num incubador de cultura de tecido a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.
3. contínuo a longo prazo circadiano Bioluminescência Gravação realizados em paralelo com a avaliação da hormona secreção em células vivas humanas primárias
- Apresentando circadianos Bioluminescência repórteres em células primárias humanas porTransdução Lentivirus
NOTA: Todos os procedimentos com partículas lentivirais deve ser realizada em um Nível de Biossegurança 2 facilidade para tomar precauções adicionais para o trabalho com agentes que representam um perigo potencial moderado a funcionários e ao ambiente.- Prepare partículas repórter lentivirais por co-transfecção do vector de interesse pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-Luc ou com 31 plasmídeo vectores lentivirais pMD2G pLV156-Per2-dLuc (chamado Bmal1-Luc e Per2-Luc, respectivamente,) e psPAX em células 293T utilizando o método de polietilenimina (por procedimento detalhado ver referência 16).
- Titula-se as partículas obtidas lentivirais (detalhes sobre a titulação pode ser obtido em http://lentilab.unige.ch/). Para outras experiências, usar lentivírus com títulos variando de 10 4 a 10 5 unidades de transdução [TU / mL].
- Coloque a loiça com células das ilhotas humanos ou mioblastos humanos (em 30-50% de confluência) no interior da cabine de fluxo laminaret e substituir o meio com 2 ml de meio CMRL suplementado fresco (veja o passo 1.1.7) ou meio de crescimento (veja o passo 1.2.2.2), respectivamente.
- Calcula-se a multiplicidade de infecção (MOI) (isto é, partículas infecciosas (unidades de transdução) / número de células).
- Transduzir a cultura de células primárias por pipetagem solução lentivírus para o prato, a fim de obter um MOI = 3 (por exemplo, para 65000 células ligadas adicionar 3 mL da solução de vírus com o título de 6,5 x 10 4-100 gota forma ul).
- Incubar durante a noite numa incubadora de cultura de tecidos. Alterar meio do dia seguinte.
NOTA: transduzir células de ilhéus humanos, pelo menos, 4 dias antes da gravação bioluminescência, a fim de atingir uma expressão suficiente da construção repórter. Os mioblastos são transduzidas durante a fase de expansão, depois deixadas crescer até à confluência, e subsequentemente diferenciados em miotubos.
- In Vitro sincronização de células humanas primárias
- <li> Adiciona-se 10 uM de adenilil ciclase activador em 2 ml de meio por 3,5 centímetros prato de petri contendo as células primárias transduzidas anteriormente no passo 3.1.5.
- Incubar durante 60 minutos a 37 ° C numa incubadora de cultura de células.
- Mudar o meio contendo o activador de adenilciclase com 2,5 ml do meio de gravação contendo 100 | iM de luciferina.
NOTA: Para as células de ilhéus humanos usar CMRL suplementado com 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de P / S, 1% de gentamicina; para miotubos humanos usar vermelho de fenol - DMEM livre com 1 g / L de glicose, suplementado com 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de P / S, 0,5% de gentamicina e 0,2% de anfotericina B.
4. Avaliação paralela de circadiano Bioluminescência Gravação e hormonal Secreção Perfis em células sincronizadas Humano secretora primárias
- Configurando a longo prazo perifusão constante e bioluminescência Gravação de células primárias humanas.
NOTA: saídas Ao trabalharide a câmara de fluxo laminar, limpar todas as superfícies de contato e limitar a exposição de culturas ou meio para o ar para evitar a contaminação.- Para preparar o meio perifusão, adicionar 100? M de luciferina ao meio.
NOTA: Para as células de ilhéus humanos usar CMRL suplementado com 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de P / S, 1% de gentamicina; para miotubos humanos usar vermelho de fenol - DMEM livre com 1 g / L de glicose, suplementado com 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de P / S, 0,5% de gentamicina e 0,2% de anfotericina B. - No interior da câmara de fluxo laminar, abrir os 3,5 cm placas contendo as culturas transduzidas, transfectadas e sincronizados primárias de células (células dos ilhéus ou miotubos) como descrito acima. Insira tampas metálicas estéreis (desenvolvidos em casa) (Figura 1B2) nos cm pratos de 3,5, que estão equipados com silicone influxo / efluxo tubos de ligação (Figura 1B1 / B5).
- Coloque os pratos na plataforma de medição no 37 ° C light estanque incubadora. Corrigir os pratos para a plataforma usando um adaptador screwable (Figura 1B3). Inserir os tubos de influxo / efluxo de o sistema de perifusão para os tubos de silicone apropriadas da tampa (Figura 1B1 / B5) e ajustar a velocidade da bomba a uma taxa de fluxo de ~ 0,5 mL de meio por 1 h.
- Abra o software Drip-biolumicorder desenvolvido in-house que registra os sinais do tubo fotomultiplicador (PMT) detector. Escolheu o diretório onde os dados serão armazenados e começar a bioluminescência contínua gravação de cada prato, clicando no ícone "Iniciar".
NOTA: Como alternativa ao software Drip-biolumicorder, outros programas (por exemplo LumiCycle), pode ser usado para gravar sinais de detector PMT. - Colocar as placas de cultura de tecidos de 6 poços estéreis na caixa de recolha em gelo.
- Abra o software de controlo que controla a temporização do interruptor automático, entre os poços de captação. Configurar o tempo window da recolha de meio (s). Iniciar a coleta do meio de saída a cada 4 horas (14.400 seg; ~ 2 ml por ponto de tempo), clicando no ícone "run".
- Transferir e medir o meio de saída de cada coleção bem em estéreis tubos de 2 ml por pipetagem. Manter os tubos em um congelador a -20 ° C antes de iniciar o próximo passo. Repita os passos 4.1.5-4.1.6 a cada 24 horas.
- Parar a gravação bioluminescência eo fluxo médio, clicando no ícone "parar" no software correspondente. Retire as tampas metálicas e aspirar o meio residual dos pratos.
- A fim de normalizar os valores de proteínas secretadas obtidas em diferentes experiências, quer extrair ADN (normalização por conteúdo de DNA genómico para miotubos 19), ou adicionar 1 ml de tampão de lise de ácido-etanol (normalização pelo teor total de hormona de células das ilhotas 18) para o pratos.
- Para preparar o meio perifusão, adicionar 100? M de luciferina ao meio.
5. medição dos níveis de Ilhota hormonais e Myokine na saídaMédio Obtido por perifusão contínua de células endócrinas humanas primárias
- Insulina
- Quantificar os níveis basais de insulina no meio de saída de pontos de tempo recolhidos utilizando um ensaio imunoabsorvente (ELISA) kit ligado a enzima insulina humana seguindo as instruções do fabricante.
- Normalizar os dados para o volume absoluto do meio recolhido em cada poço e para o teor total de insulina, extraída a partir de células tratadas com ácido-etanol, no final da experiência (passo 4.1.9) 18.
- A interleucina-6 (IL-6)
- Quantificar basal IL-6 níveis no meio de saída de tempos em pontos coletados usando um IL-6 kit ELISA humana seguindo as instruções do fabricante.
- Normalizar os dados para o volume absoluto do meio recolhido em cada poço e para o conteúdo de ADN genómico no final da experiência (passo 4.1.9).
6. Análise de Conjunto de Dados circadianos para Bioluminescência e hormonal Secreção Profiles
- Análise bioluminescência
- Analisar o perfil de bioluminescência usando o software fornecido 19.
- A análise do ciclo JTK
- Analisar os perfis de secreção de hormônios e resultados de gravação bioluminescência usando o algoritmo JTK_CYCLE 32.
- Definir a largura período circadiano a 20-24 h.
NOTA: Se as condições experimentais foram registados em paralelo, uma análise estatística emparelhado pode ser realizado para comparar as experiências.
- Análise CosinorJ
- Alternativamente, analisar a secreção hormonal e perfis bioluminescência circadiano usando o software CosinorJ 28.
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Representative Results
Avaliação da Ilhota Hormone Secreção com Parallel circadiano Bioluminescência Gravar a partir de células Perifused ilhéus humanos
Depois de fornecer uma primeira caracterização molecular do relógio circadiano, operativo em células das ilhotas humanos 16, que teve como objetivo estudar o impacto da interrupção do relógio sobre a função das ilhotas e transcrição 18. Montamos um protocolo eficiente siClock transfecção em células das ilhotas humanos dispersos (ver protocolo para detalhes), o que resultou em mais de 80% knockdown de ARNm relógio e na ablação de relógio eficiente como medido por bioluminescência circadiano profiling 18. a secreção de insulina induzida pela análise de glucose (GSIS) revelou significativamente reduzida secreção basal e estimulada de insulina mediante uma tal perturbação do relógio (não mostrado). Para avaliar a secreção do hormônio pelas células das ilhotas humanos ao redor do relógio, um continsistema de perifusão uous foi ligado a um luminómetro (ilustrada na Figura 1B). Ilhota células humanas, tendo um funcional (siControl) ou disfuncionais oscilador (siClock) foram transduzidas com as partículas lentivirais Bmal1-luc. As células foram subsequentemente sincronizado com um pulso de activador de ciclase de adenililo seguido por análise paralela de bioluminescência circadiano e a secreção de insulina para o meio de saída, durante 48 h (Figura 1C, D 18). Estas experiências sugerem que, sob constante fisiológica concentração de glucose (glucose 5,6 mM), a secreção de insulina in vitro células de ilhéus humanas sincronizadas exibe um perfil circadiano, que é interrompido em amostras com siClock (Figura 1D).
Estudar Myokine Secreção por esquelético humano Miotubos Synchronized in vitro na presença ou ausência de Relógio Funcional
33, que teve como objetivo caracterizar ritmos circadianos em esquelético humano primário miotubos e investigar seu papel na função de miotubos 19. Para este fim, a interrupção do relógio circadiano em miotubos esqueléticas foi conseguida por transfecção de siRNA CLOCK segmentação. Circadianos ensaios de repórter de bioluminescência com Bmal1-Luc e repórteres Per2-luc revelou que miotubos esqueléticos humanos, sincronizados in vitro, exibem um ritmo circadiano auto-sustentado, o qual foi adicionalmente confirmada por expressão do núcleo relógio transcrição endógena (Figura 2B; 19). Este relógio endógeno foi interrompido de forma eficiente na presença de siRNA alvejando CLOCK (Figura 2B). Além disso, a secreção basal de IL-6 (Figura 2C), interleucina-8 (IL-8)e proteína quimiotáctica de monócitos 1 (MCP-1) (não mostrado) por miotubos esqueléticos sincronizados, avaliados pelo sistema de perifusão aqui descrito (Figura 1B) e subsequente Myokine grande escala análise multiplex (não mostrado), exibe um perfil circadiano, que é fortemente desregulada mediante interrupção do relógio (Figura 2C 19).
Figura 1: Avaliação da Hormona Secreção com Parallel circadiano Bioluminescência Gravar a partir de células Perifused ilhéus humanos (A) imagem representativa das células das ilhotas humanos ligados um dia após a dissociação das ilhotas.. (B) Representação esquemática do sistema de perifusão caseiro que inclui um frasco com a forma perifusão, uma bomba, uma plataforma de medição equipado com um tubo fotomultiplicador (PMT) no interior da incubadora à prova de luz, Um dispositivo de luminómetro, controlada pelo software de gravação e um coletor de amostra semi-automática. Inserção: tubo (B1) Afluxo de ligação; (B2) tampão metálico para a placa de Petri de 3,5 cm; (B3) adaptador screwable que liga a tampa para a plataforma de medição (B4); tubo (B5) efluxo de ligação; (B6), controlada automaticamente distribuidor médio. (C) células das ilhotas humanas foram transfectadas com siRNA quer mexidos (siControl) ou siRNA segmentação relógio (siClock) e transduzidas com o repórter Bmal1-luc. As células foram constantemente perifused com meio de cultura contendo glucose 5,6 mM. bioluminescência circadiano foi gravado na sequência de sincronização por um pulso ativador da adenilciclase. (D) Os níveis de insulina foram avaliadas por ELISA em amostras de escoamento coletadas a cada 4 horas durante 48 horas. Aplicação do algoritmo JTK_CYCLE 32 confirmou que no pRESENÇA de um relógio funcional (siControl), o perfil médio de insulina secretada foi circadiano dentro de 48 horas, com uma duração do período de 24,19 ± 0,89 hr (** p = 0,009; n = 7 doadores). Este perfil circadiano foi perdido após a interrupção do relógio (siClock). Os dados são apresentados como% do hormônio secretado a partir do conteúdo total de hormona (média ± SEM) para n = 7 doadores (uma réplica para cada doador) .Este valor foi modificado de referência 18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Basal IL-6 Secreção por esqueléticos Miotubos Humanos é fortemente inibida na ausência de um relógio circadiano Funcional mioblastos foram transduzidas com as partículas lentiviraiscontendo o transgene Bmal1-Luc, em miotubos diferenciadas, e transfectadas com siControl ou siClock siARN. 24 h após a transfecção, os miotubos foram sincronizadas com um pulso de activador de ciclase de adenililo e submetido a perifusão contínua com a gravação de bioluminescência paralelo. (A) representativos imagens foram tiradas no dia 0 (D0) e D7 seguindo o interruptor de 20% a 2% de FBS contendo meio de diferenciação para induzir miotubos. Durante o processo de diferenciação, mioblastos humanos são reorientadas, tornar-se alongado e fundem-se para formar um sincício plurinuclated. (B) perfis bioluminescência Bmal1-luc de siControl -transfected miotubos (linha preta) e siClock -transfected miotubos (linha cinza). Perfis de oscilação Bmal1-luc foram registrados em três experimentos independentes (um doador por experiência). (C) basal representativas a secreção de IL-6Perfil na presença ou ausência de um relógio funcional. O meio de perifusão de saída foi recolhido em intervalos de 4 h durante 48 h (0-4 corresponde à acumulação de IL-6 entre 0 h e 4 h). IL-6 no meio foram avaliadas por ELISA em dois duplicados técnicas de três experiências independentes. Os resultados representam basais de IL-6 níveis normalizados para o teor total de ADN. a secreção de IL-6 foi reduzida em média de 69,30 ± 10,61% após a interrupção do relógio circadiano (média ± SEM, n = 3; * P <0,05, teste t emparelhado). Esta figura foi modificado a partir da referência 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As configurações experimentais aqui descritos são compostos de fornecimento de lentivírus de repórteres bioluminescência circadianos em células primárias humanas cultivadas, seguido por sincronização subsequente in vitro e gravação contínua de bioluminescência durante vários dias, e a análise paralela de secreção da hormona pelas mesmas células. Eles representam uma abordagem eficiente para explorar os mecanismos moleculares e aspectos funcionais dos relógios circadianos em células primárias humanas.
A qualidade do material dador é uma questão importante para a preparação de culturas de tecidos primários viáveis. A qualidade de ilhéus humanos devem ser avaliados de cada vez antes de começar a experiência. Ilhotas com pureza estimada e / ou viabilidade inferior a 70% não são recomendados para estes experimentos. ilhota células tendem a restabelecer contatos em culturas dissociadas, que desempenha um papel importante na sua sobrevivência e função. Uma vez que as células dos ilhéus não proliferam em CuLTURE, devem ser colocadas em placas a uma densidade elevada, que permite que as células para estabelecer contactos com células vizinhas. Isto é conseguido através do plaqueamento de células nas gotículas de um pequeno volume. Importante, a morte celular é mais elevada em culturas de células de ilhota de baixa densidade. Note-se que a substituição médio deve ser realizada prontamente, a fim de evitar a secagem da célula.
Os mioblastos devem ser passadas de um modo preferido a 60% de confluência, uma vez que uma densidade mais elevada pode induzir a diferenciação de mioblastos. Após tripsinização, mioblastos deve ser cuidadosamente ressuspenso e disperso para evitar aglomerados de células.
A contaminação bacteriana ou fúngica de pilhas devem ser excluídos microscopicamente antes de iniciar o ensaio perifusão. O meio de cultura pode ser suplementado com substâncias antifúngicas. Além disso, o tubo de perifusão deve ser lavado por álcool iodo desinfecção / água estéril e as tampas metálicas deve ser esterilizada por autoclavagem. Estes passos são recomendados entre cada eXperiment.
Para a gravação de bioluminescência eficiente, a qualidade da preparação lentivírus repórter deve ser determinada pela intensidade do sinal bioluminescente. Os detalhes da produção de lentivírus, incluindo solução de problemas pode ser encontrada em http://lentilab.unige.ch/. Antes da transfecção plasmídeo para a produção de lentivírus, células 293T devem ser colocadas em placas a 30-50% de confluência. É altamente recomendável para realizar um controlo da eficiência de transfecção em um prato paralelo, por exemplo utilizando CMV-GFP ou um lentivector fluorescente alternativa. Para cada preparação de vírus deve ser estabelecido o título do vírus.
Como as experiências descritas são tipicamente de longa duração (48 horas ou mais), é crucial ter silenciamento estável durante esse intervalo de tempo. A concentração de ARNip devem ser optimizado assim como a confluência celular de acordo com o protocolo de reagente de siRNA. Eficiência de silenciamento de gene devem ser testados no final do experimeNT por RT-qPCR ou por Western blotting.
Durante perifusão, a taxa de fluxo determina o tempo necessário para trocar completamente o meio no prato, mas também tem um impacto mecânico sobre a cultura celular primária. Na verdade, a configuração do fluxo a uma velocidade, que é demasiado baixo, não irá permitir uma troca completa de meio no prato, e irá diminuir a sensibilidade do método. Ao contrário uma taxa de fluxo a alta de velocidade pode danificar as células. Nas nossas mãos, a velocidade óptima para ambos os tipos de células que permitem a recolha de 0,5 ml do meio de saída por 1 h.
Importante, para se obter uma concentração mensurável de substâncias no meio de saída, um número suficiente de células que segregam deve estar presente no prato perifused. O método de seguimento para a detecção da substância segregada (ELISA ou outro) deve ser suficientemente sensível, especialmente no caso das substâncias segregadas em concentrações muito baixas. Maior densidade celular pode ser recomendado para superareste problema quando possível. Em alternativa, o meio de saída pode ser concentrada por diálise ou com filtros centrífugos, como descrito por nós em detalhes em referência 19.
Tomados em conjunto nossos experimentos em células pancreáticas humanas e em miotubos primários prever a primeira evidência convincente vez que estas células humanos possuem relógios circadianos de células-autônoma de alta amplitude 18-19. Empregando o sistema de perifusão aqui descrito combinado com um dispositivo de luminómetro (Figura 1B) que demonstraram que estes relógios de desempenhar um papel importante na regulação circadiano da secreção basal de insulina pelas células dos ilhéus pancreáticos (Figura 1D), e da secreção de IL-6 basal em miotubos esqueléticos (Figura 2C). Além disso, ao derrubar o gene do relógio do relógio do núcleo em ambos os sistemas experimentais, mostra-se que um oscilador circadiano funcional é requerida para a insulina rítmica adequado e secreção de IL-6por ilhéu humano e células do músculo esquelético, respectivamente (Figuras 1C, D e 2B, C). Nossos resultados indicam um papel crítico do relógio ilhéu humano para a boa secreção de insulina, e estão de acordo com trabalhos realizados em modelos genéticos de roedores 15,17. Dado o importante papel do relógio circadiano em permitir que os organismos de antecipar as mudanças ambientais diárias, em vez de reagir a elas, regulação circadiana de insulina basal e secreção Myokine pode representar um mecanismo tal antecipatória que coordena ilhotas pancreáticas e no músculo esquelético atividades secretoras ao descanso- ciclo de actividade de todo o corpo.
A metodologia aqui proposto pode ser facilmente modificado de forma a estudar a secreção de hormona adicional a partir dos mesmos tecidos. Já analisamos um grande painel adicional de miocinas secretadas por células do músculo esquelético, usando matrizes Myokine humanos multiplex 19, e estamos no processo de avaliarção da secreção de glucagon por células de ilhéus humanos utilizando o kit de ELISA de glucagon (dados não mostrados). Além disso, estas condições experimentais pode ser optimizado para os outros tipos de células, por exemplo adipócitos primários, para o estudo da secreção adipocina, tireócitos primário para estudar a secreção de hormona da tiróide, enterócitos primário para estudar a secreção de incretinas, etc. Uma aplicação adicional importante desse sistema poderia ser a explorar o impacto de compostos fisiológicos e / ou farmacológico na função relógio circadiano celular e secreção. O composto de interesse pode ser aplicado de forma contínua ao longo de toda a experiência (por exemplo, estudando a secreção de insulina pelas células de ilhéus humanos na presença de diferentes níveis de ácidos gordos livres elevado teor de glucose ou), ou o composto pode ser adicionado a uma fase escolhida do circadiano ciclo.
Esta técnica tem as limitações de um estudo in vitro e não representa a complexidade da regularidade do ritmo circadianomento a nível de todo o corpo. Ao mesmo tempo, ele ajuda a distinguir o papel de um relógio autónomo sobre o metabolismo celular sob condições controladas. Actualmente os métodos disponíveis são baseados em medições instantâneo da atividade de secreção nas células ou explantes seguintes na sincronização vitro 17. O protocolo aqui descrito representa um método único, que permita uma análise concordante e contínua do ritmo circadiano e actividade secretora dentro da mesma cultura de células. Alternativamente, esta metodologia pode ser aplicado para estudar a cinética de repórteres bioluminescentes não circadianos, em conjunto com a secreção de células, bem como para detectar os efeitos das diferentes substâncias adicionadas ao meio de perifusão sobre a função celular. As etapas críticas do protocolo são: 1) eficiente preparação lentivírus, 2) transfecção de células eficiente, com siRNA e repórter vectores de transdução; 3) recolha constante meio de saída e 4) certificando-se que um número suficiente de ceLLS é utilizado, a fim de obter níveis mensuráveis de hormonas ou citocinas no meio de saída recolhido (ver a solução de problemas acima).
Em vista das recentes evidências sobre a ligação entre perturbações relógio circadiano e doenças metabólicas e câncer em humanos 3-4,28,34-35, estudando as propriedades de relógio periférico humano em culturas primárias podem representar uma abordagem importante e única para a compreensão da conexão relógio potencial a estas doenças. Assim, a nossa descoberta da existência de ligações entre ilhotas funcional humana pâncreas e relógio de músculo esquelético e secreção basal de insulina e miocinas, pode ter consequências potenciais para a compreensão do desenvolvimento de doenças crônicas, como diabetes 18-19 obesidade e tipo 2 e trará novos caminhos para o tratamento destas doenças. Importante, devido à correlação estabelecida entre as características in vitro oscilador avaliados e in vivo 36, implicação de propriedades relógio circadiano humanos como uma característica das doenças, é da mais alta e relevância clínica imediata 20.
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Acknowledgments
Somos gratos aos nossos colegas da Universidade de Genebra: Jacques Philippe para comentários construtivos sobre este trabalho, Ueli Schibler para ajuda inestimável com o desenvolvimento do sistema perifusão e de inspiração científica, André Liani para o ter concebido o projeto, fabricação e comissionamento de o sistema de perfusão, empresa Lesa-Technology LTD para a assistência no sistema perifusão e desenvolvimento de software Drip-biolumicorder, George Severi para assistência com os experimentos perifusão, Ursula Loizides-Mangold pela leitura crítica do manuscrito, e Anne-Marie Makhlouf para preparações lentivírus ; de Etienne Lefai, Stéphanie Chanon e Hubert Vidal (INSERM, Lyon) para a preparação de mioblastos primários humanos; e Domenico Bosco e Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Hospital Universitário de Genebra) para a prestação de ilhotas humanas. Este trabalho foi financiado pelo No. Swiss National Science Foundation Grant 31003A_146475 / 1, o Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation pour la Recherche Romande sur Diabète, Bo Hjelt Foundation, Fundação Ernst et Lucie Schmidheiny e Sociedade Acadêmica de Genebra (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
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