Abstract
Суточный часы функционируют во всех светочувствительных организмов, что обеспечивает адаптацию к внешнему миру, предвосхищая ежедневные изменения окружающей среды. Значительный прогресс в понимании тесной связи между циркадных часов и большинство аспектов физиологии было сделано в области за последнее десятилетие. Тем не менее, распутывая молекулярную основу, лежащую в основе функции циркадного осциллятора в организме человека остается высшей технической задачей. Здесь мы приводим подробное описание экспериментального подхода для долгосрочного (2-5 дней) записи биолюминесценции и сбора Отток среды в культивируемых первичных клеток человека. С этой целью мы трансдуцированных первичных клеток с лентивирусов люциферазы, который находится под контролем промотора гена тактовой, что позволяет параллельной оценки секреции гормонов и циркадного биолюминесценции. Кроме того, мы опишем условия для нарушения циркадных часов в прimary человеческие клетки путем трансфекции миРНК таргетирования часами. Наши результаты на циркадный регуляции секреции инсулина поджелудочной железы человека, и myokine секрецию скелетных мышечных клеток человека, которые представлены здесь, чтобы проиллюстрировать применение этой методологии. Эти параметры могут быть использованы для изучения молекулярной состав периферических часов человека и проанализировать их функциональное воздействие на первичные клетки в физиологических или патофизиологических условиях.
Introduction
Циркадная система синхронизации (от латинского "Circa Diem") возникла во всех светочувствительных организмов, как адаптивный механизм с вращением Земли. У млекопитающих, она организована по иерархическому принципу, охватывая центральный синхронизатор, который находится в ядре супрахиазматического вентральной гипоталамусе, и периферической (или ведомый) осцилляторы, которые действуют в различных органах. Кроме того, эти клеточные автономные хозрасчетные осцилляторы функционируют почти в каждой клетке тела 1. Световые сигналы представляют собой доминирующую синхронизирующий кий (Zeitgeber) для нейронов SCN, в то время как нервные и гуморальные сигналы , исходящие от SCN сброса периферийных часов. В ритмах отдых-активность : сложение, что диск в свою очередь кормления натощак циклов, являются дополнительными синхронизаторы для периферийных часов 2. Согласно нашему современному пониманию, молекулярный состав ядра процессора основан на транскрипционный и translaные петли обратной связи, которые являются консервативными между организмами. Это включает транскрипционные активаторы BMAL1 и часы, которые вместе активируют транскрипцию генов отрицательных тактовая PER и крика. Высокие уровни PER и кричи белков будет препятствовать их собственную транскрипцию путем ингибирования / ЧАСЫ комплекса BMAL1. Вспомогательный контур состоит из ядерных рецепторов REV-Erbs и калах, которые также регулируют транскрипцию BMAL1 и ЧАСЫ. Кроме того, посттрансляционные события , включая фосфорилирование, SUMOylation, ацетилирование, O-GlcNAcylation, деградации и ядерной записи частоте ядра белки представляют собой дополнительный слой важную регуляторную при установлении 24 - часовом цикле колебаний 3.
Накопленные данные проистекает из исследований в моделях на грызунах и подчеркивает важнейшую роль циркадного системы в координации метаболических и эндокринных функций 4-5. Ряд LARGэлектронной шкалы анализ транскриптом предполагают , что кормление - голодание циклы играют центральную роль в синхронизации периферических осцилляторов 6-8. В согласии с этими исследованиями, метаболомики и липидомных анализ у грызунов и человека показали , что большое количество метаболитов осциллируют в ткани, плазмы и слюны в циркадных образом 9-11. Важно отметить, что большинство гормонов демонстрируют циркадные ритмы в 5,12-13 крови. Кроме того, циркадные часы из соответствующего гормонпродуцирующих периферических тканей может регулировать секрецию гормонов на местном уровне. Клеточно-автономным циркадные осцилляторы были описаны в грызунах и островковых клеток поджелудочной железы человека 14-16. Эти осцилляторы играют существенную роль в регуляции островков поджелудочной железы транскриптом и функции 15,17-18. Кроме того, myokine секрецию скелетных мышечных трубочек человека было недавно продемонстрировано, демонстрируют циркадный паттерн, который регулируется клеточно-автономным oscillatoRS оперативные в этих клетках 19.
Существует несколько подходов к изучению циркадных ритмов в организме человека в естественных условиях широко используются. Например, плазменный мелатонин или уровень кортизола в крови, а также грудные температура поверхности кожи (обзор в ссылках 3,20) были изучены для оценки эндогенных циркадных часов. Хотя эти методы позволяют изучать системные циркадные колебания в естественных условиях, они далеки от обеспечения надежной оценки обгонной автономных циркадных ритмов в различных органах и тканях. Тем не менее, такое рассечение от системного регулирования станет незаменимым инструментом для понимания специфического действия внутриклеточных молекулярных часов на функции этих клеток. Таким образом, значительные усилия были предприняты для разработки надежных подходов для изучения человеческих часов в иммортализованных или первичных культивированных клеток синхронизированных в пробирке. Важно то, что было показано, чтоЧасы характеристики , измеренные в культивируемых клетках первичных фибробластов кожи точно отражают индивидуальные тактовые свойства всего организма 21. Развитие флуоресцентных и биолюминесценции циркадных репортеров значительно продвинулся вперед этот подход 22-27. Кроме того, изучая первичные часы клеток, которые получают из различных периферических органов позволяет для исследования свойств молекул тканесецифического часы человека 3,5,16,19-20,28. Таким образом, оценка циркадных часов в пробирке в синхронизированных первичных эксплантов или клетки, с помощью биолюминесцентного репортеров, представляет собой весьма полезный метод для изучения молекулярной состав периферических часов человека и их влияние на функции органа.
В этой статье мы представим подробные протоколы для оценки циркадных экспрессии генов в первичных островковых и скелетных мышечных клеток человека синхронизированных в пробирке, а также влияния автономных клеточных часовСрыв на секреторную функцию этих клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Манипуляции , включенные в этот протокол был одобрен Комитетом по этике больницы Женевского университета и по этическим комитетом SUD EST IV (Соглашение 12/111) 19. Человеческие островки выделяли из панкреатических мозга умерших доноров полиорганной в трансплантологии Центра Островок в госпитале Университета Женевы (Швейцария) , как описано нами в ссылках 16,18, или получены из коммерческих источников.
1. Получение первичной клеточной культуры
- Человек панкреатическими островками Изоляция, диссоциация и культура
Примечание: Смазать каждую трубу, пластиковый наконечник или пипеткой с Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) среды с целью предотвращения островки или островковые клетки от прилипания к пластиковой поверхности, что может привести к значительной потере клеточного материала.- За один день до островковых клеток диссоциации добавляют 1 мл ламинина-5-богатых внеклеточного матрикса (на основе 804G клеток как descriКровать в ссылке 29) на 3,5 см чашку. Перед металлизированный клетки, аспирация матрицу и мыть блюдо 3 раза стерильной би-дистиллированной воды. Дайте высохнуть блюдо под шкаф с ламинарным потоком в течение 5 мин.
- Внутри шкафа с ламинарным потоком воздуха, распределяют полученные островки с CMRL среды в 15 мл пробирку (ы). Центрифуга при 272 мкг в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант, а затем ресуспендируют осадок в 1 мл фосфатно-буферного солевого раствора стерильного Дульбекко (DPBS), предварительно нагретый до 37 ° С без кальция и магния. Центрифуга при 272 мкг в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл ДЗФР.
- Для того, чтобы подсчитать общее число островков, пипеткой 10 мкл из островковой суспензии, 1 мл в новый 3,5 см чашку. Подсчитайте число островков в капле 10 мкл под микроскопом и из этого рассчитать общее количество островками в островковой суспензией 1 мл. Добавьте 14 мл ДЗФР и центрифугирование клеточной суспензии еще одинВремя работы при 272 мкг в течение 5 мин.
- Для клеточной диссоциации островковых клеток поджелудочной железы, аспирация супернатант и прибавляют 1 мл раствора открепления клеток в течение максимум 1000 островковых эквивалентов (IEQ). Поместите пробирку в водяную баню при температуре 37 ° С и осторожно перемешать островки пипетированием вверх и вниз несколько раз Ежеминутно во время 6-10 мин,
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки качества пищеварения, пипеткой каплю 2 мкл суспензии на предметное стекло и проверить под микроскопом, что все клетки хорошо разделены, и что никакие дублеты или клеточные скопления не осталось. - Остановить реакцию добавлением 14 мл холодной CMRL с добавками (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% пенициллина-стрептомицина (P / S), 1% гентамицина, 1 % пирувата натрия). Центрифуга при 425 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и добавляют 15 мл CMRL среды к осадку клеток.
- Ресуспендируют осадок в небольшом объеме CMRL с добавками. Подсчитайте количество клеток под микроскопом с помощью hemocytoметр, регулировать громкость CMRL, чтобы получить концентрацию клеток ~ 650, 000 клеток / мл.
- Пипеткой 3 разделенных капель 100 мкл каждого из дисперсной суспензии клеток, полученной на стадии 1.1.8 в 3,5 см чашку, предварительно покрытые ламинин.
Примечание: Клетки прикрепить к чашке примерно 24 ч. - Инкубируйте клетки (рис 1А) в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С во влажной камере. Изменение носителя ячейки капель через каждые 2-3 дня аспирацией по 100 мкл из каждой капли, и заменить его с тем же объемом свежей среды.
- Человек Первичная миобластов Культура и Дифференцировка в мышечных трубках
- Тканевой биопсии, выделение сателлитных клеток и миобластов культуры
Примечание: биопсию мышц были получены из группы Этьена Lefai (INSERM, Лион, Франция) 19.- Очищают первичных скелетных миобластов в соответствии с ранее описанной процедурой 30.
- Дифференцируя рrimary человека миобластов в мышечные трубки
- Возьмем один флакон (1 х 10 6 клеток) человека миобластов хранили в жидком азоте и быстро оттаивают клетки, поместив флакон в течение 30 сек до 1 мин на водяной бане при 37 ° С при перемешивании.
- Клетки Внесите (1 мл) в 24 мл ростовой среды, состоящих из ХАМ F-10 с добавлением 20% FBS, 1% P / S, 0,5% гентамицина и 0,2% амфотерицином В.
- Центрифуга 5 мин при 150 х г.
- Удалить супернатант и ресуспендирования клеток с 15 мл свежей среды для роста на 2,5 × 10 5 клеток.
- Пластина по меньшей мере , 2,5 × 10 5 клеток на F75 клейкого колбу. Держите миобластов в клетке инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- После того как клетки достигают 60-80% слитности, диссоциируют клеток с помощью трипсина-EDTA 0,05% в течение 1-2 мин и пластины их в 2 мл среды для выращивания на прилипшие блюда 3,5 см Петри.
- После достижения слияния, удаления среды роста.
- Начало дифференцировки протоCol человеческих миобластов Into мышечные трубки культивированием их в 2 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 1 г / л глюкозы, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% гентамицина и 0,2% амфотерицин В (дифференцировка среда) в инкубаторе клеток при 37 ° с и 5% CO 2. Изменение среды каждые 2 до 3 дней.
Примечание: мышечные трубки, как правило, формируются в течение 7-10 дней. - Проверка дифференцировки клеток мышц под микроскопом (рис 2А), наблюдая слияние миобластов в многоядерный мышечных трубочек 19.
- Тканевой биопсии, выделение сателлитных клеток и миобластов культуры
2. малых интерферирующих РНК (миРНК) Трансфекция
- миРНК Трансфекция человеческих островковых клеток
Примечание: Протокол трансфекцию осуществляют в каплях 100 мкл на следующий день после диссоциации клеток (этапы 1.1.1-1.1.10).- Отберите 100 мкл CMRL среды из каждой капли, и заменить его таким же объемом не содержащей сыворотки минимальной необходимой среде (MEM), 2 чдо трансфекции пипеткой.
- Подготовить MEM смесь на основе реагента трансфекции и 50 нМ миРНК - мишени (SICLOCK) или 50 нМ ненацеливании siControl в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Для одного блюда с 3 капли готовят две 1,5 мл пробирки с 200 мкл MEM каждого.
- Добавить в одной из этих трубок 4 мкл реагента для трансфекции.
- Добавьте ко второй трубке 1 мкл соответствующего миРНК исходного раствора (20 мкМ).
- Перемешайте эти две трубки медленно на орбитальном шейкере в течение 5 мин, а затем смешать содержимое пробирок вместе и перемешивают еще в течение 20 мин.
- Вытяжку 100 мкл MEM из каждой капли и заменить его таким же объемом смеси, полученной трансфекции в предыдущем шаге пипеткой.
- Заменить трансфекционного раствора CMRL среды после 4 ч инкубации при 37 ° С. Повторите шаги 2.1.1-2.1.3 на следующий день для клеток повторной трансфекции.
- миРНК Трансфекция человека мышечных трубочек
- Перед трансфекцией замените носитель (этап 1.2.2.8) с 2 мл свежей среды для дифференцировки на 3,5 см блюдо Петри.
- В стерильном 1,5 мл пробирку, приготовить смесь из 20 нМ миРНК (siControl или SICLOCK), что соответствует 2,4 мкл раствора 20 мкМ миРНК, а также 12 мкл реагента для трансфекции разведенных в 100 мкл среды для дифференцировки. Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 15 мин при осторожном перемешивании.
- Трансфекцию клетки с 114,4 мкл смеси миРНК на 3,5 см чашку Петри и место клеток в инкубаторе для тканевых культур при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 ч.
3. Непрерывный Долгосрочный циркадного Биолюминесценция Запись выполняется параллельно с оценкой Гормон Секреция в живых человеческих первичных клеток
- Представляя циркадных биолюминесценции Репортеры в человека Первичные клетки путемлентивирусов Трансдукция
Примечание: Все процедуры с использованием лентивирусов частиц должны быть выполнены в биологической безопасности 2-го уровня объекта принять дополнительные меры предосторожности при работе с агентами, представляющими умеренную потенциальную опасность для персонала и окружающей среды.- Подготовить частицы репортер лентивирусов путем совместного трансфекцию вектора интереса pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / BMAL1-Luc или pLV156-Per2-dLuc ( так называемый BMAL1-Luc и Per2-Luc, соответственно) плазмиду 31 с лентивирусов векторов pMD2G и psPAX в клетки 293Т с использованием метода полиэтиленимина (для детальной процедуры см ссылку 16).
- Titrate полученные лентивирусов частиц (подробнее о титрования можно получить в http://lentilab.unige.ch/). Для дальнейших экспериментов, использовать лентивирусов с титрами в диапазоне 10 4 до 10 5 преобразующих единиц [ТУ / мкл].
- Место блюда с клетками человека островковых или человека миобластов (на 30-50% сплошности) внутри кабины ламинарного потокаЕТ и замените носитель с 2 мл свежей среды, дополненной CMRL (этап 1.1.7) или ростовую среду (этап 1.2.2.2), соответственно.
- Вычислить множественности заражения (MOI) (т.е. инфекционные частицы (преобразовательного единиц) / количество ячеек).
- Трансдукции первичной культуры клеток с помощью пипетки лентивирус раствора на блюдо , с тем , чтобы получить MOI = 3 (например, для 65000 прикрепленные клетки добавляют 3 мкл раствора вируса с титром 6,5 х 10 4 до 100 мкл среды капли).
- Выдержите в течение ночи в инкубаторе тканевых культур. Изменение среднего на следующий день.
Примечание: трансдукции островковых клеток человека, по крайней мере за 4 дня до записи биолюминесценции для достижения достаточной экспрессии репортерной конструкции. Миобластов трансдуцируют во время фазы расширения, а затем выращивали до слияния, а затем дифференцировались в мышечные трубки.
- Экстракорпоральное Синхронизация человека первичных клеток
- <li> Добавьте 10 мкМ аденилатциклазы активатора в 2 мл среды на 3,5 см чашку Петри, содержащую первичные клетки предварительно трансдуцированных на этапе 3.1.5.
- Инкубировать в течение 60 мин при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
- Изменение среды, содержащей циклазным активатор аденилин с 2,5 мл носителя записи, содержащего 100 мкМ люциферин.
Примечание: В случае клеток островков Лангерганса человека используют CMRL с добавлением 10% FBS, 1% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% P / S, 1% гентамицина; для человека мышечные трубки используют фенол красный - свободный DMEM с 1 г / л глюкозы, дополненной 2% FBS, 2% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% P / S, 0,5% гентамицина и 0,2% амфотерицина В.
4. Параллельный оценка циркадного биолюминесценции записи и гормональная секреция Профили в синхронном человеческого Секреторное Первичные клетки
- Настройка Долгосрочно константы Perifusion и биолюминесценции записи для первичных клеток человека.
Примечание: При работе выходовIde шкаф ламинарный поток, очистите все контактные поверхности и ограничить воздействие культур или среды с воздухом, чтобы избежать загрязнения.- Для приготовления perifusion среды, добавляют 100 мкМ люциферин к среде.
Примечание: В случае клеток островков Лангерганса человека используют CMRL с добавлением 10% FBS, 1% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% P / S, 1% гентамицина; для человека мышечные трубки используют фенол красный - свободный DMEM с 1 г / л глюкозы, дополненной 2% FBS, 2% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% P / S, 0,5% гентамицина и 0,2% амфотерицина В. - Внутри шкафа с ламинарным потоком воздуха, откройте 3,5 см чашках, содержащих трансдуцированных, трансфицированные и синхронизированные первичных клеточных культур (островковых клеток или мышечных трубках), как описано выше. Вставьте стерильные металлические колпачки (разработанные в доме) (рис 1B2) в см чашки 3,5, которые снабжены силиконовым наплыв / эффлюксных соединительные трубки (рис 1B1 / B5).
- Поместите посуду на измерительной платформе в 37 ° C лIGHT непроницаемого инкубатор. Закрепить блюда на платформу с помощью привинчивающаяся адаптера (рисунок 1B3). Вставьте наплывом / эффлюксных трубы системы perifusion в соответствующие силиконовые трубки колпачка (рис 1B1 / B5) и установить скорость насоса при скорости потока ~ 0,5 мл среды на 1 час.
- Откройте в доме разработанный Капельное-biolumicorder программное обеспечение, которое записывает сигналы от ФЭУ (ФЭУ) детектора. Выберите каталог, в котором будут храниться данные и начать непрерывную запись биолюминесценции от каждого блюда, нажав на значок "Пуск".
Примечание: В качестве альтернативы к программному обеспечению Капельное-biolumicorder, другие программы (например , LumiCycle), могут быть использованы для записи сигналов от детектора ФЭУ. - Поместите стерильные 6-луночные планшеты для тканевых культур в травосборник на льду.
- Откройте программу управления, которая управляет временем автоматического переключения между скважинами сбора. Настройка времени шindow средней коллекции (сек). Начать сбор оттока среды каждые 4 ч (14,400 сек; ~ 2 мл на временной точке), нажав на значок "Выполнить".
- Передача и измерить отток среды из каждой коллекции и в стерильные 2 мл пробирки с помощью пипетки. Хранить пробирки в -20 ° C морозильнике перед началом следующего шага. Повторите шаги 4.1.5-4.1.6 каждые 24 часа в сутки.
- Остановить запись биолюминесценции и потока среды, нажав на значок "стоп" на соответствующее программное обеспечение. Удалите металлические колпачки и аспирация остаточной среды из блюд.
- Для того , чтобы нормализовать секретируемые значения белка , полученные в различных экспериментах, либо извлечь ДНК (нормализацию геномной содержания ДНК для мышечных трубках 19), или добавить 1 мл буфера для лизиса кислотно-этанол (нормализация суммарным содержанием гормонов для островковых клеток 18) к блюда.
- Для приготовления perifusion среды, добавляют 100 мкМ люциферин к среде.
5. Измерение Островок Гормональные и Myokine Уровни в оттокеСредняя получены при непрерывной Perifusion из человеческого первичного эндокринных клеток
- инсулином
- Количественно базальный уровень инсулина в оттоке среды из собранных временных точках с помощью инсулина иммуноферментного анализа (ИФА) набор человека в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Нормализация данных по абсолютному объему собранной среды в каждую лунку , и к общему содержанию инсулина, извлеченного из кислотно-этанольных обработанных клеток в конце эксперимента (этап 4.1.9) 18.
- Интерлейкин-6 (ИЛ-6)
- Количественная базальная IL-6 уровней в оттоке среды из собранных временных точках с помощью человеческого IL-6 ELISA комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Нормализация данных по абсолютному объему собранной среды в каждую лунку, и к геномного содержание ДНК в конце эксперимента (этап 4.1.9).
6. Суточный датасетов Анализы для Bioluminesценция и гормональная секреция Профили
- Биолюминесценция Анализ
- Анализ профиля биолюминесценции с помощью прилагаемого программного обеспечения 19.
- Анализ JTK цикла
- Анализ профилей секреции гормонов и записи результатов биолюминесценции с помощью алгоритма 32 JTK_CYCLE.
- Установите ширину циркадного периода в 20-24 ч.
Примечание: В случае, если условия эксперимента были записаны параллельно, сопряженное статистический анализ может быть проведен для сравнения экспериментов.
- Анализ CosinorJ
- В качестве альтернативы, анализировать секрецию гормона и циркадные профили биолюминесценции с помощью программного обеспечения CosinorJ 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка Островок Гормон Секреция с параллельными циркадного биолюминесценции Запись с Perifused Человека островковых клеток
После предоставления первую молекулярную характеристику циркадных часов, действуют в клетках 16 островковых человека, мы направлены на изучение влияния часов на нарушения функции островковых клеток и транскрипции 18. Мы создали эффективный протокол SICLOCK трансфекции в дисперсных клетках островков человека (см протокол для подробностей), что привело к более чем на 80% нокдаун мРНК CLOCK, а также в эффективной тактовой абляции как измерено циркадный биолюминесценции профилирования 18. Глюкоза секрецию инсулина индуцированных (СБИС) анализ показал значительно снижается базальную и стимулированную секрецию инсулина после такого нарушения синхронизации (не показан). Для оценки секреции гормона клетками человека островковых вокруг-часы, ContinСистема perifusion рывна была связана с фотометре (изображен на рисунке 1В). Человеческие клетки, островками , несущие функциональную (siControl) или дисфункциональных (SICLOCK) осциллятора были трансдуцированных с BMAL1-Luc лентивирусов частиц. Клетки были затем синхронизирована с импульсом аденилатциклазы активатора с последующим параллельным анализом циркадного биолюминесценции и секреции инсулина в выпускную среды в течение 48 ч (рис 1C, D 18). Эти эксперименты показывают , что при постоянной физиологической концентрации глюкозы (5,6 мМ глюкозы), секреции инсулина в пробирке синхронизированных клеток островка человека проявляет циркадный профиль, который нарушается в SICLOCK несущих образцах (рис 1D).
Изучение Myokine секреция скелетной мышечных трубочек синхронизируются в пробирке в присутствии или отсутствии функционального Clock
33, мы нацелены на циркадные ритмы , характеризующие в первичной человеческого скелета и мышечные трубки при исследовании их роли в функции myotube 19. С этой целью, нарушение циркадных часов в скелетных мышечных трубках было достигнуто путем трансфекции миРНК таргетирования ЧАСЫ. Суточный биолюминесценции репортер анализы с BMAL1-Luc и Per2-Luc репортеров показал , что скелетные мышечные трубки человека, синхронизированные в пробирке, обладают само- стоятельного циркадный ритм, который дополнительно подтверждается эндогенной экспрессии тактовая транскрипта (рис 2B; 19). Этот эндогенный часы были эффективно разрушены в присутствии миРНК ориентации CLOCK (рис 2B). Кроме того, базальная секреция IL-6 (рис 2С), интерлейкин-8 (ИЛ-8)и хемотаксиса моноцитов протеина 1 (МСР-1) (не показан) , с помощью синхронизированных скелетных мышечных трубочек, оценивали с помощью описанной здесь системы perifusion (Фиг.1В) и последующее крупномасштабное myokine мультиплекс анализа (не показан), проявляет циркадный профиль, который сильно дизрегуляции на часы разрушения (рис 2С 19).
Рисунок 1: Оценка Гормон Секреция с параллельными циркадного биолюминесценции Запись с Perifused Человека островковых клеток (A) показательная картина прикрепленных клеток островка человека в один прекрасный день после островковой диссоциации.. (Б) Схематическое представление самодельной системы perifusion , которая включает в себя бутылку с perifusion среды, насос, измерительную платформу , снабженную фотоумножителя (ФЭУ) в пределах светонепроницаемый инкубаторе, Люминометра устройство, управляемое программным обеспечением для записи, а также полуавтоматической коллектор образца. Вставка: (B1) Наплыв соединительную трубку; (B2) металлический колпачок для 3,5 см чашки Петри; (B3) привинчивающаяся адаптер , который крепится колпачок на измерительной платформе (B4); (B5) Отток соединительная трубка; (B6) с автоматическим управлением среднего дистрибьютора. (C) клетки человека островковых трансфицировали либо зашифрованным миРНК (siControl) или миРНК ориентации CLOCK (SICLOCK) и трансдуцированных с BMAL1-Luc репортер. Клетки постоянно perifused с культуральной средой, содержащей 5,6 мМ глюкозы. Суточный биолюминесценции была записана следующая синхронизация активатором импульса аденилатциклазы. (D) Уровни инсулина оценивали с помощью ELISA в пробах отток собирают каждые 4 ч в течение 48 ч. Применение алгоритма 32 JTK_CYCLE подтвердил , что в рresence функционального часы (siControl), средний профиль секретируемого инсулина был циркадный в течение 48 часов, с длиной периода 24,19 ± 0,89 ч (** р = 0,009; п = 7 доноров). Этот циркадный профиль был потерян на часы нарушения (SICLOCK). Данные представлены в виде% от секретируемого гормона от общего содержания гормонов (среднее ± SEM) при п = 7 доноров (один для каждого повторностей донора) .Этот цифра была модифицирована из ссылки 18. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого цифра.
Рис . 2: Базальные IL-6 секреция скелетной мышечных трубочек человека является сильно тормозил в отсутствие функциональной циркадных часов миобласты трансдуцированных лентивирусов частицсодержащий BMAL1-Luc трансген, дифференцированных в мышечных трубках, и трансфицировали либо siControl или SICLOCK миРНК. 24 ч после трансфекции, мышечных трубках были синхронизированы с активатором импульсом аденилатциклазы и подвергали непрерывному perifusion с параллельной записи биолюминесценции. (A) Репрезентативные фотографии были сделаны в день 0 (D0) и D7 после переключения с 20% до 2% FBS , содержащие среду для индукции дифференцировки мышечных трубок. В процессе дифференцировки, человеческие миобласты переориентированы, вытягиваются и сплавить вместе, чтобы сформировать plurinuclated синцитий. (B) BMAL1-Luc биолюминесценции профили siControl -transfected мышечных трубочек (черная линия) и SICLOCK -transfected мышечных трубочек (серая линия). BMAL1-Luc профили колебаний были зафиксированы в трех независимых экспериментах (один донор на эксперимент). (C) представитель базально Секреция ИЛ-6профиль в присутствии или в отсутствие функционального часов. Отток perifusion среду собирали через 4 ч интервалами в течение 48 ч (0-4 соответствует накоплению IL-6 от 0 ч и 4 ч). ИЛ-6 уровней в среде оценивали с помощью ELISA в двух технических дублей из трех независимых экспериментов. Результаты представляют собой базальные уровни IL-6 нормированные к общему содержанию ДНК. секрецию IL-6 была снижена в среднем на 69.30 ± 10.61% при циркадного нарушения синхронизации (среднее значение ± SEM, п = 3; * Р <0,05, парные т тест). Эта цифра была изменена со ссылкой 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экспериментальные установки , описанные здесь , состоят из лентивирусов доставки циркадных репортеров биолюминесценции в культивируемых первичных клеток человека, с последующей синхронизацией в пробирке и непрерывной записи биолюминесценции в течение нескольких дней, и параллельный анализ секреции гормонов одними и теми же клетками. Они представляют собой эффективный подход для изучения молекулярных механизмов и функциональных аспектов циркадных часов в первичных клетках человека.
Качество донорского материала является важным вопросом для подготовки жизнеспособных культур первичных тканей. Качество человеческих островки следует оценивать каждый раз перед началом эксперимента. Островки с предполагаемой чистотой или / и жизнеспособности уступает 70% не рекомендуется для этих экспериментов. Островок клетки, как правило, восстановить контакты в диссоциированных культур, которая играет важную роль в их выживания и функции. Так как островковые клетки не размножаются в у.е.lture, они должны быть покрыты при высокой плотности, что позволяет клеткам устанавливать контакты с соседними клетками. Это достигается путем высева клеток в каплях небольшого объема. Важно отметить, что гибель клеток выше, в культурах островковых клеток с низкой плотностью. Обратите внимание, что среда замена должна быть выполнена быстро, чтобы избежать высыхание клеток.
Миобластов следует пассировать предпочтительно при 60% слияния, так как более высокая плотность может индуцировать дифференцировку миобластов. После того, как трипсином, миобласты следует тщательно ресуспендировали и рассредоточены, чтобы избежать скопления клеток.
Бактериальный или грибковый загрязнение первичных клеток, должны быть исключены микроскопически перед началом анализа perifusion. Питательная среда могут быть дополнены противогрибковых веществ. Кроме того, perifusion трубы должны быть промыты с помощью спирта йода дезинфекции / стерильной воды и металлических крышек должны быть стерилизуют автоклавированием. Рекомендуется Эти шаги между каждым еXperiment.
Для эффективной записи биолюминесценции, качество подготовки репортер лентивирусов должен определяться интенсивностью биолюминесцентного сигнала. Детали лентивирусов производства включая устранение неполадок можно найти на сайте http://lentilab.unige.ch/. Перед получением плазмиды трансфекции для лентивирусов производства, 293T клетки должны быть покрыты на 30-50% слияния. Настоятельно рекомендуется проводить контроль эффективности трансфекции в параллельном блюдо, например, с помощью CMV-GFP или альтернативный флуоресцентный lentivector. Для каждого вирусного препарата должен быть установлен титр вируса.
Поскольку описанные эксперименты, как правило, длительный (48 час или более), то очень важно иметь стабильную глушителей в течение этого промежутка времени. Концентрация миРНК должна быть оптимизирована, а также сотой сплошности в соответствии с протоколом миРНК реагента. Эффективность молчанием генов должна быть проверена в конце experimeнт с помощью ОТ-кПЦР или с помощью Вестерн-блоттинга.
Во время perifusion, скорость потока определяет время, необходимое для полного обмена среды в чашке, но и оказывает механическое воздействие на культуру первичных клеток. Действительно, настройка потока со скоростью, которая является слишком низкой, не позволит для полного обмена среды в чашке, и приведет к снижению чувствительности метода. Напротив, скорость высокоскоростного потока может привести к повреждению клеток. В наших руках, оптимальная скорость для обоих типов клеток даже позволяет собрать 0,5 мл вытекания среды в 1 ч.
Важно отметить, что для получения измеримой концентрации веществ в оттоке среды, достаточное количество клеток, секретирующих должны присутствовать в perifused блюдо. Следить за метод обнаружения секретируемого вещества (ELISA или другие) должны быть достаточно чувствительным, особенно в отношении веществ, секретируемых в очень низких концентрациях. Более высокая плотность клеток может быть рекомендовано, чтобы преодолетьЭта проблема, когда это возможно. В качестве альтернативы, отток среда может быть сконцентрирован путем диализа или с центробежными фильтрами, как описано нами подробно в ссылке 19.
Взятые вместе наши эксперименты в панкреатических островковых клетках человека и в первичных мышечных трубках обеспечивают впервые убедительные доказательства того, что эти человеческие клетки обладают высокой амплитудой клеточно-автономными циркадных часов 18-19. Применяя здесь описанную систему perifusion в сочетании с люминометра устройством (рис 1B) мы показали , что эти часы играют важную роль в циркадных регуляции секреции базального инсулина островковых клеток поджелудочной железы (рис 1D) и базальной секреции IL6 скелетных мышечных трубочек (фиг.2С). К тому же , сбивая ген CLOCK частоты ядра в обеих экспериментальных системах, мы покажем , что функциональный генератор циркадный необходим для правильной ритмической инсулина и секреции IL-6человеческим островком и клетки скелетных мышц, соответственно (рис 1C, D и 2B, C). Наши результаты указывают на критическую роль часов островковых клеток поджелудочной железы человека для надлежащего секреции инсулина, а также находятся в хорошем согласии с работ , выполненных в грызунах генетических моделей 15,17. Учитывая важную роль циркадных часов в позволяя организмы предвидеть ежедневные изменения окружающей среды, а не реагировать на них, циркадные регуляция базального инсулина и myokine секреции может представлять такой упреждающий механизм, который координирует островков поджелудочной железы и скелетных мышц секреторную деятельность по остального мусора активность цикла всего тела.
Здесь Предложенная методика может быть легко модифицирована с целью изучения дополнительной секреции гормона из тех же тканей. Мы уже проанализировали дополнительную большую панель myokines , выделяемыми скелетных мышечных клеток, используя мультиплекс массивы 19 myokine человека, и мы находимся в процессе оценкиИнг секрецию глюкагона клетками островков человека с использованием набора Глюкагон ELISA (данные не показаны). Более того, эти экспериментальные условия могут быть оптимизированы для других типов клеток, например первичных адипоцитов, для изучения секреции адипокин, первичный тиреоцитах для изучения секреции гормонов щитовидной железы, первичный энтероцитов для секреции изучения Инкретины и т.д. Дополнительным важным применение этой системы может быть исследовать влияние физиологических и / или фармакологических соединений на клеточном циркадного функции часов и секреции. Соединение интерес может применяться непрерывно в течение всего эксперимента (например, изучение секреции инсулина островковых клеток человека в присутствии высоких концентраций глюкозы или различных уровней свободных жирных кислот), или соединение может быть добавлено в выбранной фазе циркадный цикл.
Этот метод имеет ограничения на исследования в пробирке и не представляет сложности циркадный ритм регулинодательство на уровне всего тела. В то же время, это помогает отличить роль автономных часов на клеточный метаболизм в контролируемых условиях. Имеющиеся в настоящее время методы основаны на измерениях снимков секреции активности в клетках или эксплантов следующих синхронно 17 пробирке. Протокол, описанный здесь, представляет собой уникальный метод, позволяющий Согласованное и непрерывный анализ циркадного ритма и секреторной активности в пределах той же культуры клеток. В качестве альтернативы, эта методика может быть применена для изучения кинетики не-циркадных репортеров биолюминесценции, в сочетании с секрецией клеток, а также для обнаружения воздействия различных веществ, добавляемых в perifusion среды на функции клеток. Критические шаги в протоколе, являются: 1) эффективность лентивирусов подготовка, 2) эффективность трансфекции клеток с миРНК и репортер векторов трансдукции; 3) сбор Отток постоянной среды и 4), убедившись, что достаточное количество керамзитобLLS используется для того, чтобы получить измеримые уровни гормонов или цитокинов в собранном выпускную среде (см выше и устранение неисправностей).
С учетом последних свидетельств о связи между циркадных часов пертурбаций и метаболических заболеваний и рака у человека 3-4,28,34-35, изучая свойства периферические часы человека в первичных культурах могут представлять собой важный и уникальный подход для понимания потенциального подключения часов к этим заболеваниям. Таким образом, наше открытие о существовании связей между функциональной поджелудочной железы человека островок и скелетных мышц и часы базальной секреции инсулина и myokines, может нести потенциальные последствия для понимания развития хронических заболеваний, таких как ожирение и диабет 2 типа 18-19 и принесет новые возможности в лечении этих заболеваний. Важно отметить, что из - за установленной взаимосвязи между ин витро оцениваемых характеристик генератора , и в естественных условиях 36, следствием циркадных свойств часов человека как признак заболеваний, имеет самый высокий и непосредственной клинической значимости 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарны нашим коллегам из Университета Женевы: Жак Филипп за конструктивные замечания по этой работе, Ули Schibler за неоценимую помощь в развитии системы perifusion и для научного вдохновения, Андре Liani для задумав проектирование, изготовление и ввод в эксплуатацию система перфузия, компания Леза-Technology LTD за помощь в системе perifusion и разработки программного обеспечения Капельное-biolumicorder, Джордж Severi за помощь при проведении экспериментов perifusion, Урсула Loizides-Мангольд для критически чтении рукописи, и Анн-Мари Маклуф для лентивирус препаратов ; Этьену Lefai, Stéphanie Chanon и Hubert Видал (INSERM, Лион) для подготовки первичных миобластов человека; и Доменико Боско и Тьерри Berney (Островок центра трансплантации человека, Женева Больница университета) для обеспечения человека островки. Эта работа была профинансирована N: Швейцарский национальный научный фонд Грант 31003A_146475 / 1, Sinergia Швейцарский национальный научный фонд грант № CRSII3-154405, Fondation Romande пур ля Recherche сюр Diabète, Бо Hjelt Foundation, Fondation Ernst Et Lucie Шмидхайни и Société Académique De Geneve (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
