Abstract
Sirkadiyen saatler günlük çevresel değişimleri öngörerek dış dünyaya bir uyum sağlayarak, tüm ışığa duyarlı organizmalarda işlevseldir. sirkadiyen saat ve fizyoloji çoğu yönleri arasında sıkı bir bağlantı anlayışımızda önemli ilerleme son on yılda bu alanda yapılmıştır. Ancak, insanlarda sirkadiyen osilatör işlevini temelini moleküler temelini çözülüyor yüksek teknik meydan kalır. Burada, kültürlü insan primer hücrelerinde uzun süreli (2-5 gün) biyolüminesans kayıt ve çıkış ortamı koleksiyonu için deneysel bir yaklaşım ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu amaçla, hormon sekresyonu ve sirkadiyen biyolüminesans paralel değerlendirmeye olanak sağlayan bir çekirdek saat gen promotörünün kontrolü altında bir lentiviral lusiferaz raportör ile birincil hücreler transdüksiyona var. Ayrıca, pr sirkadiyen saat bozan koşullarını tarifsiRNA hedef SAAT transfekte edilmesiyle imary insan hücreleri. insan pankreatik adacıkların insülin salgılanmasının sirkadiyen düzenleme ile ilgili sonuçlar, insan iskelet kası hücreleri tarafından myokine salgılanması, bu yöntemin uygulanmasını göstermek için sunulmaktadır. Bu ayarlar, insan periferal saatler moleküler makyaj çalışma ve fizyolojik veya patofizyolojik koşullarda primer hücrelerde fonksiyonel etkisini analiz etmek için kullanılabilir.
Introduction
(Latince "Circa diem" dan) sirkadiyen zamanlama sistemi Dünya'nın dönüşüne adaptif mekanizma olarak, tüm ışığa duyarlı organizmalarda ortaya çıkmıştır. Memelilerde, bu ventral hipotalamusun suprakiazmatik çekirdeğinde yer alan merkezi saat, kapsayan, hiyerarşik bir şekilde organize edilir ve periferik (veya köle) farklı organlarda ameliyat olan osilatörler. Ayrıca, bu hücre bağımsız kendini sürdüren osilatörler gövdesinin 1 neredeyse her hücrede işlevseldir. SCN kaynaklanan sinirsel ve humoral sinyaller periferik saatler reset ise photic sinyaller, SCN nöronlar için baskın bir senkronizasyon ipucu (Zeitgeber) temsil eder. Dönüş besleme-açlık döngüleri sürücü ekleme dinlenme-faaliyet ritimleri, içinde, çevresel saatler 2 hakkında daha fazla synchronizers vardır. Mevcut anlayışa göre, çekirdek saati moleküler makyaj transkripsiyon ve abancı dayanmaktadırorganizmalar arasında muhafaza edilir tional geri besleme döngüleri. Bu arada negatif çekirdek saat PER ve CRY genlerin transkripsiyonunu aktive transkripsiyonel aktivatörleri BMAL1 ve SAAT içerir. PER ve Cry proteinlerinin yüksek seviyede BMAL1 / SAAT kompleksinin inhibisyonu yoluyla kendi transkripsiyonunu inhibe edecektir. Yardımcı bir halka da BMAL1 ve saat transkripsiyonu düzenleyen nükleer reseptörler REV-Erbs ve Oto- oluşur. Ayrıca, fosforilasyon, sumoylation, asetilasyon, O-GlcNAcylation, bozulması ve çekirdek saat proteinlerinin nükleer girişi de dahil olmak üzere posttranslasyonel olaylar 24 saat salınım döngüsü 3 kurulmasında bir ek önemli düzenleyici katmanı temsil etmektedir.
Biriken deliller kemirgen modellerinde çalışmalardan kaynaklanmaktadır ve metabolik ve endokrin fonksiyonların 4-5 koordinasyonunda sirkadiyen sistemin kritik rolünü vurgulamaktadır. larg bir sayıaçlık döngüleri periferik osilatörler 6-8 senkronizasyonu merkezi bir rol oynar - e-ölçekli transcriptome analizi besleme öneririz. Bu çalışmaların bir uyumlu olarak, kemirgenlerde ve insanlarda metabolomic ve lipidomic analizi metabolitlerin çok sayıda sirkadiyen şekilde 9-11 doku, plazma ve tükürük salınım olduğunu ortaya koymuştur. Önemlisi, çoğu hormonlar kan 5,12-13 sirkadiyen ritimleri gösterirler. Ayrıca, periferik doku üreten karşılık gelen hormonun sirkadiyen saatler yerel hormon salgılanmasını düzenleyen olabilir. Hücre özerk sirkadiyen osilatörler kemirgen ve insan pankreas adacık hücresi 14-16 de tarif edilmiştir. Bu osilatörler pankreas adacık transcriptome düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir ve 15,17-18 çalışır. Bundan başka, insan iskelet miyotüplerinin göre myokine salınımı en son hücre özerk oscillato düzenlenmiş olan bir sirkadyen desen sergilediği gösterilmiştirBu hücrelerde 19 ameliyat rs.
In vivo olarak, insanlarda sirkadiyen ritimler incelemek için çeşitli yaklaşımlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, (referanslar 3,20 gözden) plazma melatonin veya kortizol seviyeleri yanı sıra göğüs deri yüzeyi sıcaklığı endojen sirkadiyen saatler değerlendirmek için çalışılmıştır. Bu yöntemler, in vivo sistemik sirkadiyen salınımlar okuyan izin rağmen, çok farklı organ ve dokularda serbest çalışan özerk sirkadiyen ritim güvenilir bir değerlendirme sağlayarak vardır. Bununla birlikte, sistemik yönetmelik böyle diseksiyon bu hücrelerin fonksiyonu hücre içi moleküler saatlerin belirli etkisini anlamak için vazgeçilmez bir araç olacaktır. Bu nedenle, önemli bir çaba in vitro senkronize immortal veya primer kültür hücrelerinde insan saatler çalışmak için güvenilir yaklaşımlar geliştirmeye taahhüt edilmiştir. Daha da önemlisi, bu gösterilmiştirkültürlü birincil deri fibroblast hücreleri ölçülen saat özellikleri yakından tüm organizmanın 21 bireysel saat özelliklerini yansıtmaktadır. Floresan ve bioluminescent sirkadiyen gazetecilere gelişimi büyük ölçüde bu yaklaşımı 22-27 ilerlemiştir. Ayrıca, farklı çevresel organlar türetilir okuyan birincil hücre saatler insan dokusuna-özgü saatler 3,5,16,19-20,28 moleküler özelliklerinin araştırılması için izin verir. Bu nedenle, in vitro olarak senkronize primer eksplantlar ya da hücrelerde gündelik saatler değerlendirilmesi biyolüminesens muhabir kullanılarak, molekül insan periferik saatlerin makyaj ve organ fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için oldukça yararlı bir yöntemi temsil eder.
Bu yazıda, özerk hücresel saatin etkisi yanı sıra in vitro senkronize insan primer adacık ve iskelet kası hücrelerinde sirkadiyen gen ifadesini değerlendirmek için ayrıntılı protokoller sunacakBu hücrelerin salgı fonksiyonu bozulması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik bildirimi: Bu protokolde yer manipülasyonlar Cenevre Üniversitesi Hastanesi Etik Komitesi tarafından ve Etik Kurulu SUD EST IV (Anlaşma 12/111) 19 tarafından onaylanmıştır. Ticari bir kaynaktan referans 16,18 bize tarif ya da elde edilen insan adacıklar Cenevre Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi (İsviçre) Adacık Transplantasyonu Merkezi'nde beyin ölümü çoklu organ donörlerin pankreaslarından izole edilmiştir.
Primer Hücre Kültürü 1. Hazırlık
- İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu, Ayrışma ve Kültür
Not: kat Connaught Tıbbi Araştırma Laboratuarları (CMRL) hücre malzemenin önemli bir kayba neden olabilir plastik yüzeye, yapışmasını adacıkları veya doku adacığı hücre önlemek amacıyla orta her tüp, plastik uç veya pipet.- hücre ayrışma laminin-5-zengin hücre dışı matriks 1 ml ekleyin adacık bir gün önce (descri olarak 804G hücrelerinden elde edilen3.5 cm çanak başına referans 29) yatak. hücreleri kaplama önce, matris aspire ve steril bi-distile su ile çanak 3 kere yıkayın. çanak, 5 dakika boyunca laminer akış kabini altında kurumaya bırakın.
- Laminer akış kabini içinde, 15 ml tüp (lar) içine CMRL ortamında elde edilen adacıklar dağıtın. 5 dakika boyunca 272 x g'de santrifüjleyin.
- kalsiyum ve magnezyum olmadan 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış süpernatanı havalandırın, ve daha sonra steril Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml (DPBS) içinde pelletini. 5 dakika boyunca 272 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatant aspire ve DPBS 1 ml hücre pelletini.
- Yeni 3.5 cm çanak içine adacıklar, pipet, 1 ml adacık süspansiyonu 10 ul toplam sayısını saymak için. mikroskop altında 10 ul damla adacıklar sayısını ve bu 1 ml adacık süspansiyon içinde adacıklar toplam sayısını hesaplayın. DPBS 14 ml ekleyin ve hücre süspansiyonu santrifüj bir daha5 dakika boyunca 272 x g'de saat.
- Adacık hücre ayrışma için, süpernatant aspirat ve 1000 adacık eşdeğerleri (IEQ) maksimum hücre dekolmanı solüsyonu 1 ml ekleyin. 37 ° C'de su banyosunda tüp yerleştirin ve yavaşça 6-10 dakika boyunca, her dakika kadar pipetleme ve birkaç kez aşağı adacıklar karıştırın.
NOT: Bir bardak slayt süspansiyon 2 ul damla pipetlemeyin ve tüm hücreleri de ayrılır mikroskop altında kontrol sindirim kalitesini kontrol etmek ve hiçbir çiftlerin ya da hücre kümeleri kaldığını. - takviyeleri (% 10 fetal bovin serumu (FBS),% 1 soğuk CMRL 14 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 penisilin-streptomisin (P / S),% 1 gentamisin, 1 % sodyum piruvat). 5 dakika boyunca 425 xg'de santrifüj. Süpernatant aspire ve hücre pelletine CMRL ortamında 15 ml ekleyin.
- takviyeleri CMRL küçük hacimde pelletini. Bir hemocyto kullanarak mikroskop altında hücrelerin sayısınımetre, ~ 650, 000 hücre / ml'lik bir hücre konsantrasyonunu elde etmek amacıyla CMRL ses seviyesini ayarlamak.
- Pipet 3 3,5 cm tabak laminin ile önceden kaplanmış aşama 1.1.8 'de elde edilen dağılmış hücre süspansiyonundan 100 ul her bir damla ayrıldı.
NOT: Hücreler yaklaşık 24 saat içinde çanak eklemek. - Nemli bir oda içinde, 37 ° C'de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, hücreler (Şekil 1A) inkübe edin. Her bir damla 100 ul aspirasyon ve taze ortam ile aynı hacmi ile değiştirerek hücre ortamı, her 2-3 günde damla değiştirin.
- Myotubes İnsan İlköğretim Miyoblast Kültür ve Farklılaşma
- Doku biyopsisi, uydu hücre izolasyonu ve myoblast kültürü
Not: Kas biyopsileri Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Fransa) 19 grubu elde edilmiştir.- Daha önce tarif edilen prosedüre 30'a göre primer iskelet miyoblastlar saflaştınlır.
- Farklılaşan pmyotubes rimary insan miyoblastlar
- Sıvı azot içinde saklanır, insan iskelet hücreleri bir vial (1 x 10 6 hücre) almak ve çalkalama ile 37 ° C'de bir su banyosu içinde 30 saniye ile 1 dakika için flakon koyarak hücrelerin hızlı bir şekilde eritin.
- oluşan büyüme ortamı 24 ml pipetleyin hücreleri (1 mi) HAM F-10,% 20 FBS,% 1 P / S,% 0.5 gentamisin ve% 0.2 amfoterisin B ile desteklenmiş
- 150 x g'de santrifüje 5 dak.
- 2.5 x 10 5 hücre başına taze büyüme ortamına 15 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
- F75 yapışık şişesi ortalama plaka en az 2.5 x 10 5 hücre. CO2 37 ° C'de bir hücre kuluçka makinesi içinde miyoblastlar tutmak ve% 5.
- Hücreler% 60-80 konfluense ulaştıktan sonra, 1-2 dakika boyunca tripsin-EDTA% 0.05 hücreleri ayırmak ve yapışkan 3,5 cm petri çanakları üzerine büyüme ortamına 2 ml bunları plaka.
- kaynaşmaya eriştikten sonra, büyüme ortamı çıkarın.
- farklılaşma proto başlatkültürlenerek myotubes insan miyoblastların sütun 2, 1 g / L glükoz,% 2 FBS,% 1 P / S,% 0.5 gentamisin ve% 0.2 amfoterisin B (farklılaşma ortamı) ihtiva eden Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde mi 37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde bir hücre kuluçka makinesi içinde. her 2 ila 3 gün orta değiştirin.
NOT: myotubes genellikle 7-10 gün içinde oluşur. - -Çekirdekli miyotüplerinden 19 içine miyoblastların füzyon gözlemleyerek mikroskobu (Şekil 2A) altında kas hücre farklılaşması kontrol edin.
- Doku biyopsisi, uydu hücre izolasyonu ve myoblast kültürü
2. Küçük müdahale edici RNA (siRNA) Transfeksiyon
- İnsan adacık hücresi siRNA Transfeksiyon
Not: transfeksiyon protokolü hücre ayrılma sonraki gün 100 ul (1.1.1-1.1.10 adım) damla damla gerçekleştirilir.- Her açılan CMRL ortamında aspire 100 ul serumsuz minimum temel ortam (MEM), 2 saat aynı hacimde ile değiştirinpipetleme transfeksiyondan önce.
- Bir MEM bazlı transfeksiyon ayıracı karışımı ve hedef siRNA (siClock) ya da 50 nM, 50 nM Hazırlama üreticinin talimatlarına göre siControl olmayan hedefleme.
- 3 damla bir tabak için MEM, her biri 200 ul olan iki 1.5 ml tüpler hazırlanır.
- Bu tüplerin transfeksiyon reaktifi 4 ul birine eklemek.
- Uygun siRNA stok solüsyonu (20 mM) ikinci tüp 1 ul ekleyin.
- 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde yavaş bu iki boruyu karıştırın ve daha sonra birlikte tüplerin içerikleri karıştırmak ve 20 dakika daha çalkalayın.
- Aspire 100 her damlasında MEM ul ve pipetleme önceki adımda elde edilen transfeksiyon karışımı aynı hacimde ile değiştirin.
- 37 ° C'de inkübasyon 4 saat sonra CMRL ortamında transfeksiyon solüsyonu değiştirin. Adımları tekrarlayın 2.1.1-2.1.3 hücre yeniden transfeksiyon için ertesi gün.
- İnsan miyotüplerinin siRNA transfeksiyonu
- Transfeksiyondan önce, 3.5 santimetrelik bir petri tabağı başına taze farklılaştırma ortamının 2 ml ortam (adım 1.2.2.8 bakınız) değiştirin.
- Steril 1.5 ml'lik bir tüp içinde, 20 uM siRNA çözeltisi 2.4 ul ve farklılaştırma ortamının 100 ul seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi 12 ul karşılık gelen 20 nM siRNA (siControl ya siClock) 'in bir karışımı hazırlayın. Hafifçe çalkalama ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti inkübe edin.
- 37 ° C 'de, bir doku kültür inkübatörü içine 3.5 cm petri ve yeri hücre başına siRNA karışımı 114.4 ul% 5 24 saat boyunca CO2 ile transfekt hücre.
3. Sürekli Uzun vadeli Sirkadiyen Biyoparlaklık Kayıt Yaşayan İnsan İlköğretim Hücreleri Hormon salgısını Değerlendirilmesi ile paralel olarak gerçekleştirilen
- İnsan Primer Hücre içine Sirkadiyen Biyolüminesans Gazeteciler Tanıtımılentiviral İletimi
NOT: lentiviral parçacıkları ile tüm işlemler personeline ve çevreye ılımlı bir potansiyel tehlikesi ajanlar ile çalışmak için ek önlemler almak için biyogüvenlik düzeyi 2 tesis yapılmalıdır.- Tarafından muhabir lentiviral parçacıkları hazırlayın eş transfecting faiz pLenti6.4 vektörü / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc veya pLV156-Per2-dluc (sırasıyla denilen Bmal1-luc ve Per2-luc,) lentiviral vektörler pMD2G ile plazmid 31 ve polietilenimin yöntemi kullanılarak 293T hücrelerine psPAX (ayrıntılı prosedür için referans 16).
- (Titrasyon ile ilgili detaylar http://lentilab.unige.ch/ elde edilebilir) elde lentiviral parçacıkları titre edilir. Daha fazla deneyler için, titreleri 10 5 nakleden birimlerine [TU / ul] olarak 10 4 arasında değişen lentiviruses kullanın.
- laminar flow kabin içinde insan adacık hücreleri veya (% 30-50 confluency), insan iskelet hücreleri ile yer yemeklerive taze katkılı CMRL ortamında 2 ml orta yerine, sırasıyla, ya da büyüme ortamı (adım 1.2.2.2 bakınız) (adım 1.1.7 bakınız).
- Enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) (birimleri transducing yani bulaşıcı parçacıklar () hücre / sayı) hesaplayın.
- MOI = 3 elde etmek üzere çanak lentivirüs çözelti pipetleme birincil hücre kültürü transdüksiyonu (örneğin, 65,000 ekli hücreler 6.5 x 10 4 100 ul ortam damla titreye sahip bir virüs çözeltisi 3 ul).
- bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün orta değiştirin.
Not: raportör yapısının yeterli ekspresyonunu elde etmek için, en az 4 gün önce biyoışıldama kayıt insan doku adacığı hücreleri nakletmek. Miyoblastlar sonra izdiham büyüdü, genleşme aşamasında transduced ve daha sonra myotubes ayrılır.
- İnsan İlköğretim hücrelerin Vitro eşitleme
- <li>, daha önce adım 3.1.5 transdüksiyona birincil hücreler içeren 3.5 santimetrelik bir petri tabağı başına ortam, 2 ml 10 uM adenilil siklaz aktivatörü ekleyin.
- bir hücre kültür inkübatörü içinde 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
- 100 mcM luciferase içeren kayıt ortamının 2.5 ml adenilat siklaz aktivatörü içeren orta değiştirin.
Not: İnsan adacık hücresi kullanmak için CMRL% 10 ile takviye edilmiş FBS,% 1 L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 P / S,% 1 gentamisin; İnsan miyotüpleri, kırmızı fenol kullanım için - 1 g içermeyen DMEM / L glikoz,% 2 FBS ile takviye% 2 L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 P / S,% 0.5 gentamisin ve% 0.2 amfoterisin B
Senkronize İnsan Salgı İlköğretim Hücrelerinde Sirkadiyen Biyoparlaklık Kayıt ve Hormon salgılanması Profilleri 4. Paralel Değerlendirme
- İnsan Primer Hücreleri Uzun vadeli sabit perifüzyon ve Biyoparlaklık Kayıt Kurma.
NOT: Çalışma çıkışlarılaminar flow kabini, temiz, tüm temas yüzeylerini ide ve kontaminasyonu önlemek için havaya kültürleri ya da orta maruz kalma sınırı.- , Perifüzyon orta hazırlamak ortama lusiferinin 100 mcM eklemek için.
Not: İnsan adacık hücresi kullanmak için CMRL% 10 ile takviye edilmiş FBS,% 1 L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 P / S,% 1 gentamisin; İnsan miyotüpleri, kırmızı fenol kullanım için - 1 g içermeyen DMEM / L glikoz,% 2 FBS ile takviye% 2 L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 P / S,% 0.5 gentamisin ve% 0.2 amfoterisin B - Laminer akış kabini içinde, yukarıda tarif edildiği gibi, transduse transfekte edilmiş ve senkronize primer hücre kültürleri (islet hücreleri ya miyotüpleri) ihtiva eden 3.5 cm yemekler açın. Silikon akını / akış bağlantı boruları (Şekil 1B1 / B5) ile donatılmıştır 3,5 cm yemeklerin içine (evde geliştirilen) steril metalik kapaklar (Şekil 1B2) yerleştirin.
- 37 ° C l ölçüm platformu üzerinde yemekleri yerleştirinight geçirmez inkübatör. Bir vidalanabilir adaptörü (Şekil 1B3) kullanarak platforma yemekleri sabitleyin. Kapak (Şekil 1B1 / B5) uygun bir silikon tüp içine perifüzyon sisteminin akını / akış tüpleri yerleştirin ve ~ bir akış oranında 1 saat başına 0.5 ml ortamda pompa hızını ayarlayın.
- photomultiplier tüp (PMT) detektörü gelen sinyalleri kaydeder in-house geliştirilen Damla-biolumicorder yazılımını açın. veriler saklanır ve "start" ikonuna tıklayarak her yemeğin kayıt sürekli biyoparlaklık başlayacaktır dizini seçti.
NOT: Alternatif Damla biolumicorder yazılımı, diğer programlar (örn LumiCycle), PMT detektörü gelen sinyalleri kaydetmek için kullanılabilir. - Buz üzerinde toplama kutusu steril 6 oyuklu doku kültür plakaları yerleştirin.
- toplama kuyuları arasında otomatik şalter zamanlamasını kontrol eden kontrol yazılımı açın. zaman w kurmakorta koleksiyonu (sn) Doq. çıkış ortamının her 4 saatte (14,400 saniye; zaman noktası başına ~ 2 ml) koleksiyonu Başlat "run" ikonuna tıklayarak.
- pipetle steril 2 ml tüpler içine her bir koleksiyonundan çıkış ortamı aktarın ve ölçün. Bir sonraki adımı başlamadan önce bir -20 ° C derin dondurucuda tüpler tutun. Adımları tekrarlayın 4.1.5-4.1.6 her 24 saat.
- biyolüminesans kayıt ve ilgili yazılım üzerinde "dur" ikonuna tıklayarak, orta akışını durdurun. metalik kapaklarını çıkarın ve yemekleri artık orta aspire.
- Farklı deneylerde elde edilen salgılanmış protein değerlerini normalize ya özü DNA (miyotüplerinin 19 genomik DNA içeriği ile normalleştirme), ya da (adacık hücresi 18 için toplam hormon muhtevası ile normalizasyonu) liziz asit-etanol 1 ml tampon eklemek için yemekler.
- , Perifüzyon orta hazırlamak ortama lusiferinin 100 mcM eklemek için.
Çıkışlar 5. Ölçüm Adacık Hormon ve Myokine DüzeyleriOrta İnsan İlköğretim Endokrin Hücrelerinin Sürekli perifüzyon tarafından elde
- ensülin
- üreticinin talimatlarına göre bir insan insülini, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti kullanılarak toplandı zaman noktalarından dışarı akış ortam içinde temel insülin düzeylerini ölçmek.
- Deneme (aşama 4.1.9) 18 sonunda asit-etanol ile muamele edilmiş hücreler elde her bir ve toplam insülin içeriği toplandı ve ortamın mutlak hacmi verileri normalize.
- İnterlökin-6 (IL-6)
- ölçmek Bazal, IL-6, üretici talimatlarına göre, bir insan IL-6 ELISA kit ile toplandı zaman noktalarından dışarı akış ortamında seviyeleri.
- Her kuyudaki ve deney (aşama 4.1.9) sonunda genomik DNA içeriği toplandı ve ortamın mutlak hacmi verileri normalize.
Biolumines 6. Sirkadyan Veri kümesi Analizleriartmasına neden olmuştur ve Hormon Salgı Profilleri
- biyoparlaklık Analizi
- Sağlanan yazılımı 19 kullanarak biyoparlaklık profilini analiz.
- JTK döngüsü analizi
- JTK_CYCLE algoritması 32 ile hormon salgılanması profilleri ve biyolüminesans kayıt sonuçlarını analiz.
- 20-24 saat sonra sirkadiyen dönem genişliğini ayarlayın.
Not: Deney koşulları paralel kaydedilmiştir durumda, çifterli istatistiki analiz deneyleri karşılaştırma yapılabilir.
- CosinorJ Analizi
- Alternatif olarak, hormon salgılanması ve CosinorJ yazılımı 28 ile sirkadiyen biyoparlaklık profillerini analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
^ Ayılacağmı İnsan Adacık Hücreleri Paralel Sirkadiyen Biyoparlaklık Kayıt ile Adacık Hormon salgısını Değerlendirilmesi
Sirkadiyen saat bir ilk moleküler karakterizasyonu sağladıktan sonra, insan adacık hücresi 16 ameliyat, biz adacık fonksiyonu ve transkripsiyon 18 saat bozulma etkisini incelemeyi amaçladık. Sirkadiyen biyoparlaklık profil 18 ile ölçülen gibi etkin bir siClock transfeksiyon SAAT mRNA% 80'den fazla demonte sonuçlandı dağınık insan adacık hücrelerinde protokolü (detaylar için Protokolü bakınız), ve verimli saat ablasyon kurmak. Glukoz kaynaklı insülin salgısı (GSIS) analizi, önemli ölçüde, bazal indirgenmiş ve saat bozulması sonucunda insülin salgılanmasını stimüle gösterdi (gösterilmemiştir). , Yaklaşık dört saat insan adacık hücreleri tarafından bir CONTIN hormonu salgılanmasını değerlendirmek içinuous perifüzyon sistemi (Şekil 1B de gösterilen) bir lüminometre bağlanmıştır. Fonksiyonel (siControl) ya da işlevsiz (siClock) osilatör taşıyan insan adacık hücreleri, Bmal1-luc lentiviral parçacıkları ile transduced. Hücreler daha sonra 48 saat (Şekil 1C, D 18) boyunca dışarı akış ortamına sirkadiyen biyolüminesans ve insülin salgılanmasının paralel analizi ile takip adenilil siklaz aktifleştirici bir darbe ile senkronize edildi. Bu deneyler, sabit bir fizyolojik glukoz konsantrasyonu (5.6 mM glükoz), in vitro olarak senkronize insan doku adacığı hücrelerinden insülin sekresyonunun altında siClock taşıyan numune (Şekil 1D) bozulur bir biyolojik profili sergilediğini göstermektedir.
Fonksiyonel Saat varlığında ya da yokluğunda in vitro olarak insan iskelet miyotüpleri Senkronize göre Myokine salgılanmasına incelenmesi
33 glukoz metabolizmasının düzenlenmesinde iskelet kası saatinin potansiyel rolü ışığında tutmak-together.within sayfa = "1">, birincil insan iskelet sirkadiyen ritimleri karakterize amaçlayan myotubes ve mihotüp fonksiyonu 19 rollerini incelemeyi. Bu amaçla, iskelet miyotüplerinin sirkadiyen saat bozulması siRNA hedef SAAT transfekte edilmesi suretiyle elde edildi. Bmal1-luc ve Per2-luc gazetecilere sirkadiyen biyolüminesans raportör testleri in vitro senkronize insan iskelet myotubes, ayrıca (; 19 Şekil 2B) endojen çekirdek saat transkript ifadesi ile teyit edildi kendinden sürekli sirkadiyen ritim, gösterdikleri tespit edilmiştir. Bu endojen saat etkin siRNA hedef SAAT mevcudiyetinde (Şekil 2B) bozulmuştur. Bundan başka, IL-6 (Şekil 2C) bazal salgılama, interlökin-8 (IL-8)ve monosit kemotaktik protein 1 (MCP-1), (gösterilmemiş olan) burada açıklanan perifüzyon sistemi (Şekil 1 b) ve daha sonra büyük ölçekli bir myokine çoklu analizi (gösterilmemiştir) ile değerlendirilmiştir senkronize iskelet miyotüplerinin ile olan bir biyolojik profil sergiler kuvvetle saat bozulması (Şekil 2C 19) üzerine düzensiz.
Şekil 1: ^ ayılacağmı İnsan Adacık Hücreleri Paralel Sirkadiyen Biyoparlaklık Kayıt ile Hormon salgısını Değerlendirilmesi (A) bir gün adacık ayrılma sonrasında bağlı insan adacık hücrelerinin Temsilcisi resim.. (B) perifüzyon ortamı ile bir şişe, bir pompa, ışık geçirmeyen bir inkübatör içinde foto-çoğaltıcı tüp (PMT) ile donatılmış bir ölçüm platformu içeren ev yapımı perifüzyon sisteminin şematik sunumu, Kayıt yazılımı tarafından kontrol edilen bir luminometre cihazı, ve bir yarı otomatik numune toplayıcı. Takın: (B1) Üfleme bağlayan tüp; (B2) 3,5 cm Petri kabı için metalik kapak; Ölçüm platformu (B4) Kapağı ekler (B3) vidalanabilir adaptörü; (B5) akış bağlantı borusu; (B6) otomatik olarak orta distribütörü kontrollü. (C) İnsan adacık hücreleri ya şifreli siRNA (siControl) veya siRNA hedef SAAT (siClock) ile transfekte ve Bmal1-luc muhabiri transduced. Hücreler sürekli 5.6 mM glukoz ihtiva eden bir kültür ortamı ile ^ ayılacağmı edildi. Sirkadiyen biyoparlaklık bir adenilat siklaz aktivatörü darbe ile senkronizasyon aşağıdaki kaydedildi. (D) insülin değerleri 48 saat boyunca 4 saat toplanan çıkış örneklerinde ELISA ile değerlendirildi. JTK_CYCLE algoritması 32 uygulanması p doğruladıişlevsel saat (siControl), salgılanan insülinin ortalama profilin resence 24.19 ± 0.89 saat arasında bir süre uzunluğu, 48 saat içerisinde sirkadiyen oldu (** p = 0.009, n = 7 donörler). Bu sirkadiyen profil saat bozulması (siClock) üzerine kaybedildi. Veriler toplam hormon içeriğinden salgılanan hormonun% olarak sunulmuştur (ortalama ± SEM) n = 7 donörler (her donör için bir çoğaltma) .Bu rakam referans 18 modifiye edilmiştir. Bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam.
Şekil 2:. İnsan İskelet miyotüplerinden tarafından Bazal IL-6 Salgı Kesinlikle bir Fonksiyonel Sirkadiyen Saat Yokluğunda inhibit olan miyoblastları lentiviral parçacıklar transducedBmal1-luc transgen miyotüplerinin ayrışmıştır ve siControl ya siClock siRNA da transfekte ihtiva etmektedir. 24 saat transfeksiyon izleyen, myotubes bir adenilat siklaz aktivatörü darbe ile senkronize edildi ve paralel biyoparlaklık kaydı ile sürekli perifüzyon tabi. (A), Örnek Resimlerde miyotüpleri değişimi etkilemek için orta içeren% 20 ila% 2 FBS ile ilgili anahtar bir sonraki gün 0 (D0) ve D7 alınmıştır. farklılaşma sürecinde, insan miyoblastlar yönlendirildiği, uzun olmak ve bir plurinuclated Sinsityum oluşturmak için bir araya sigorta. SiControl (B) Bmal1-luc biyoparlaklık profilleri miyotüpler (siyah çizgi) -transfekte ve siClock (gri çizgi) miyotüpler -transfekte. Bmal1-luc salınım profilleri üç bağımsız deneyler (deney başına bir donör) kaydedildi. (C) Temsilcisi bazal IL-6 salgılamafonksiyonel saat varlığında veya yokluğunda profil. perifüzyon çıkış ortamı (0-4 0 saat ve 4 saat arasında IL-6 birikimine karşılık gelir), 48 saat boyunca 4 saat aralıklarla toplanır. ortam içinde IL-6 düzeyleri, üç bağımsız deneyin iki teknik çiftleri ELISA ile değerlendirildi. Sonuçlar toplam DNA içeriği normalize bazal IL-6 seviyeleri temsil etmektedir. IL-6 salgılama sirkadiyen saat bozulması üzerine 69.30 ± 10.61 ortalama% düşürülmüştür (± SEM ortalama n = 3; * P <0.05, eşleştirilmiş t testi). Bu rakam referans 19 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen deney ayarlar daha sonra in vitro olarak senkronizasyonu ve birkaç gün biyolüminesans sürekli kayıt ve aynı hücreler tarafından hormon Paralel analizi takiben, kültürlenmiş insan primer hücrelere sirkadiyen biyoışıldama muhabir lentiviral teslimat oluşmaktadır. Bunlar moleküler mekanizmaları ve insan primer hücrelerinde sirkadiyen saatler fonksiyonel yönlerini keşfetmek için verimli bir yaklaşımı temsil etmektedir.
Donör malzeme kalitesi canlı birincil doku kültürleri hazırlanması için önemli bir konudur. İnsan adacıklar kalite deney başlamadan önce her zaman değerlendirilmelidir. Tahmini saflık ve / veya% 70 daha aşağı canlılığı adacık Bu deneyler için tavsiye edilmez. Adacık hücrelerinin hayatta kalma ve fonksiyonunda önemli bir rol oynar ayrışmış kültürlerinde temas yeniden tesis eğilimindedir. adacık hücreleri Cu çoğalmadıkları yanalture, onlar hücrelerin komşu hücreler ile temas kurmak için izin veren bir yüksek yoğunluklu, en kaplama olmalıdır. Bu küçük bir hacme damlacıkları hücreleri kaplama ile elde edilir. Önemli bir şekilde, hücre ölümü, düşük yoğunluklu, adacık hücre kültürlerinde daha yüksektir. orta yerine hücre kurumayı önlemek için derhal yapılması gerektiğini unutmayın.
Daha yüksek yoğunluklu myoblast farklılaşmasına neden olabilir çünkü miyoblastlar,% 60 izdiham tercihen pasajlandı edilmelidir. tripsinizasyon sonra miyoblastlar dikkatle yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve hücre kümeleri bilmek dağılmalıdırlar.
primer hücre bakteriyel veya fungal kontaminasyon perifüzyon tahlil başlamadan önce mikroskobik ekarte edilmelidir. Kültür ortamı, antifungal maddeler ile takviye edilebilir. Buna ek olarak, perifüzyon boru alkol iyot dezenfeksiyon / steril su ve metal kapakları ile durulanmalıdır otoklav ile sterilize edilmelidir. Bu adımlar her e arasına tavsiye edilirXperiment.
verimli biyoparlaklık kayıt için, muhabir lentivirüs hazırlık kalitesi bioluminescent sinyal yoğunluğu ile tespit edilmelidir. sorun giderme de dahil olmak üzere lentivirüs üretim ayrıntıları http://lentilab.unige.ch/ bulunabilir. lentivirüs üretimi için transfeksiyon plazmid önce 293T hücreleri% 30-50 izdiham kaplama olmalıdır. Son derece CMV GFP veya alternatif bir flüoresan Lentivector kullanarak, örneğin bir paralel tabak transfeksiyon randımanının bir kontrol yapılması tavsiye edilir. Her virüs hazırlanması için, virüs titresi kurulmalıdır.
açıklanan deneyler genellikle (48 saat veya daha fazla) uzun ömürlü olduğu için, zaman dilimi boyunca sabit susturulması için çok önemlidir. siRNA konsantrasyonu siRNA reaktifi protokolüne göre, hücre konfluent gibi optimize edilmelidir. gen susturma etkinliği experime sonunda test edilmelidirnt RT-qPCR veya Western blotting ile.
perifüzyon sırasında, akış hızı tamamen çanak orta alışverişi için gerekli zamanı belirler, aynı zamanda primer hücre kültürü üzerinde mekanik bir etkiye sahiptir. Gerçekten de, çok düşük bir oranda, akış ayarlama, kabındaki ortam tam bir değişimi için izin vermez, ve yöntemin hassasiyeti azalacaktır. Aksine, yüksek hızlı akış hızı hücrelerine zarar verebilir. Bizim ellerde, her iki hücre tipleri için optimal hız 1 saat başına çıkış ortamı 0.5 ml toplamak için izin vermedi.
Önemli olarak, çıkış ortamı içinde maddelerin ölçülebilir konsantrasyon elde etmek için, salgılayan hücrelerin yeterli sayıda ^ ayılacağmı çanak içinde mevcut olması gerekir. salgılanan maddenin tespiti için takip yöntemi (ELISA ya da diğer), özellikle çok düşük konsantrasyonlarda salgılanan maddeler için, yeterince hassas olması gerekir. Yüksek hücre yoğunluğu aşmak için tavsiye olabilirBu sorun olduğunda mümkün. Referans 19 de ayrıntılı olarak tarafımızdan tarif edildiği gibi alternatif olarak, çıkış aracı, dializ sureti ile veya santrifüj filtre ile konsantre edilebilir.
Insan pankreatik adacık hücrelerinde ve primer miyotüplerinden birlikte bizim deneyler Alınan bu insan hücreleri yüksek genlik hücre özerk sirkadiyen saatler 18-19 sahip ilk kez zorlayıcı kanıt sağlamaktadır. Bir luminometre cihazı bu saatler, pankreas adacık hücrelerinin bazal insülin salgılanmasının sirkadiyen düzenleme (Şekil 1D) önemli bir rol oynadığını göstermiştir (Şekil 1B), ve kemik miyotüplerinin bazal IL-6 salgılamasının bir araya burada açıklanan perifüzyon sisteminin kullanılması (Şekil 2C). Ayrıca, her iki deneysel sistemlerde çekirdek saat gen SAAT aşağı vurma, biz fonksiyonel sirkadiyen osilatör uygun ritmik insülin ve IL-6 salgılanması için gerekli olduğunu gösteriyorinsan adacık ve iskelet kas hücreleri, sırasıyla (Şekil 1C, D ve 2B, C). Bizim sonuçlarımız uygun insülin salgılanması için insan adacık saat kritik bir rol oynadığını göstermektedir, ve kemirgen genetik modeller 15,17 yapılan çalışmalar ile iyi bir uyum içindedir. organizmalar günlük çevresel değişiklikleri tahmin etmek yerine onlara tepki izin sirkadiyen saat önemli rol göz önüne alındığında, bazal insülin ve myokine salgısının sirkadiyen düzenleme, -diğer pankreas adacık ve iskelet kası salgı faaliyetlerini koordine böyle bir beklenti mekanizmayı temsil edebilir tüm vücut aktivite döngüsü.
Burada önerilen metodoloji kolayca aynı dokulardan ek hormon salgısını incelemek için modifiye edilebilir. Biz zaten multipleks insan myokine dizileri 19 kullanılarak, iskelet kas hücreleri tarafından salgılanan myokines ek bir büyük paneli analiz ettik ve biz değerlendirmek sürecinde bulunmaktadırGlukagon ELISA kiti kullanılarak insan adacık hücreleri tarafından glukagon sekresyonunu ing (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, bu deneysel koşullar adipokindir salgılanmasını tiroid hormonu salgısını, eğitim inkretinler salgılanması gibi, bu sistemin bir diğer önemli uygulama için olabilir birincil enterositler çalışmak için birinci tirositlerin incelemek için, örneğin, birincil adipositler gibi diğer hücre tipleri için optimize edilebilir hücresel sirkadiyen saat fonksiyonu ve salgılanması üzerindeki fizyolojik ve / veya farmakolojik bileşiklerin etkisini araştırmak. ilgili bileşik (yüksek glukoz ya da serbest yağ asitlerinin farklı düzeylerde mevcudiyetinde, insan doku adacığı hücrelerinden insülin salgılanmasını çalışmak örneğin), tüm deney boyunca sürekli olarak uygulanması olabilir ya da bileşik sirkadiyen seçilmiş bir aşamasında eklenebilir döngüsü.
Bu teknik bir in vitro çalışmanın sınırlamaları vardır ve sirkadiyen ritim dede karmaşıklığını temsil etmiyorbir bütün vücut düzeyinde yon. Aynı zamanda, kontrol edilen koşullar altında hücre metabolizması ile ilgili bir bağımsız saat rolü ayırt etmeye yardımcı olur. Şu anda mevcut yöntemler arasında in vitro senkronizasyon 17 aşağıdaki hücreler veya eksplantlar salgılama aktivitesinin anlık ölçümlerine dayanmaktadır. Burada açıklanan protokol aynı hücre kültürü içinde sirkadyan ritim ve salgı aktivitesinin uyumlu ve sürekli analizine imkan veren özel bir yöntemi temsil eder. Seçenek olarak ise, bu yöntem, hücrenin salgılama ile birlikte, sigara sirkadiyen biyolojik olarak ışık veren muhabir kinetiğini çalışma, hem de hücre fonksiyonu üzerindeki perifüzyon ortamına ilave farklı maddelerin etkilerinin tespit edilmesi için de uygulanabilir. Protokolde kritik adımlar şunlardır: 1) verimli lentivirüs hazırlanması, 2) siRNA ve raportör ile verimli hücre transfeksiyon iletimi vektörleri; 3) sabit orta çıkış toplama ve 4) emin olduğunu ce yeterli sayıdaLLS toplanan çıkış ortamı içinde hormonlar veya sitokin ölçülebilir düzeylerini elde etmek amacıyla kullanılır (yukarıdaki sorun bakınız).
Potansiyel saat bağlantısını anlamak için önemli ve benzersiz bir yaklaşım temsil edebilir primer kültürlerinde insan periferik saat özelliklerini inceleyerek insanlarda 3-4,28,34-35 sirkadiyen saat tedirginlikler ve metabolik hastalıklar ve kanser arasındaki bağlantıyı son delillerin, görünümünde bu hastalıklara. Böylece, fonksiyonel insan pankreas adacık ve iskelet kası saati ve insülin ve myokines bazal sekresyon arasındaki bağların varlığı keşif, obezite ve tip 2 diyabet 18-19 gibi kronik hastalıkların gelişmesi anlaşılması için olası sonuçlarını ayı olabilir ve bu hastalıkların tedavisinde yeni yollar getirecektir. Önemlisi, kurulan in vitro değerlendirilen osilatör özellikleri arasındaki korelasyon ve bağlı in vivo 36, hastalıkların ayırt edici niteliği olarak insan sirkadiyen saat özellikleri ima, en yüksek ve acil klinik önemi 20 olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz Cenevre Üniversitesinden meslektaşlarımıza teşekkür ederiz: Jacques Philippe bu işin üzerinde yapıcı yorumlarda bulunan, Ueli Schibler perifüzyon sisteminin gelişmesiyle birlikte bilimsel ilham paha biçilmez yardım için, tasarım, imalat ve devreye tasavvur ettikleri için André Liani perfüzyon sistemi, perifüzyon sistemi ve Damla biolumicorder yazılım geliştirme konusunda yardım almak için Lesa-Teknoloji LTD şirketi, George Severi perifüzyon deneyler ile yardım için, Ursula LOİZİDES-Mangold için kritik lentivirüs hazırlıkları için el yazması okuma ve Anne-Marie Makhlouf ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon ve Hubert Vidal (İNSERM, Lyon) insan primer miyoblastları hazırlamak için için; ve insan adacıklar sağlamak için Domenico Bosco ve Thierry Berney (İnsan Adacık Nakli Merkezi, Cenevre Üniversitesi Hastanesi) için. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe sayılı tarafından finanse edildi 31003A_146475 / 1, Sinergia İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe No CRSII3-154405, Fondation Romande la Recherche sur diabete, Bo Hjelt Vakfı, Fondation Ernst ve Lucie Schmidheiny ve Société académique de Genève (CD) dökün.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
