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Neuroscience

Ventana lateral crónica craneal Preparación Activa doi: 10.3791/54701 Published: December 29, 2016

Summary

oclusión quirúrgica de una rama distal de la arteria cerebral media (MCAO) es un modelo frecuentemente usado en investigación del accidente cerebrovascular experimental. Este manuscrito describe la técnica básica de la MCAO permanente, combinado con la inserción de una ventana craneal lateral, que ofrece la oportunidad para microscopía intravital longitudinal en ratones.

Abstract

Isquemia cerebral focal (es decir, accidente cerebrovascular isquémico) puede causar lesión cerebral importante, lo que lleva a una pérdida grave de la función neuronal y por lo tanto a un anfitrión de motor y discapacidades cognitivas. Su alta prevalencia supone una grave carga para la salud, como accidente cerebrovascular es una de las principales causas de discapacidad a largo plazo y la muerte en todo el mundo 1. Recuperación de la función neuronal es, en la mayoría de los casos, sólo parcial. Hasta ahora, las opciones de tratamiento son muy limitadas, en particular, debido a la estrecha ventana de tiempo para la trombólisis 2,3. La determinación de métodos para acelerar la recuperación del accidente cerebrovascular sigue siendo un objetivo primordial médica; sin embargo, esto se ha visto obstaculizada por la insuficiencia de conocimientos mecánicos en el proceso de recuperación. investigadores ictus experimentales emplean con frecuencia modelos de roedores de isquemia cerebral focal. Más allá de la fase aguda, investigación del accidente cerebrovascular se centra cada vez más en la fase subaguda y crónica después de una isquemia cerebral. La mayoría de investigadores aplican ictus permanente o tranoclusión de la MCA sient en ratones o ratas. En los pacientes, las oclusiones de la MCA se encuentran entre las causas más frecuentes de accidente cerebrovascular isquémico 4. Además de la oclusión proximal de la MCA mediante el modelo de filamento, oclusión quirúrgica de la MCA distal es probablemente el modelo más utilizado en la investigación del accidente cerebrovascular experimental 5. La oclusión de una distal (a la ramificación de las arterias lenticulo-estriados) rama MCA normalmente detiene el cuerpo estriado y afecta principalmente a la neocorteza. oclusión de los vasos puede ser permanente o transitoria. Alta reproducibilidad del volumen de la lesión y muy bajas tasas de mortalidad con respecto a los resultados a largo plazo son las principales ventajas de este modelo. Aquí, demostramos cómo llevar a cabo una preparación lateral crónica ventana del cráneo (CW) al seno sagital, y después cómo quirúrgicamente inducir un accidente cerebrovascular distal debajo de la ventana usando un enfoque craneotomía. Este enfoque se puede aplicar para la imagen secuencial de los cambios agudos y crónicos después de la isquemia a través deepi-iluminación, láser confocal de barrido, y de dos fotones microscopía intravital.

Protocol

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DECLARACIÓN DE ÉTICA: Los experimentos con seres animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín, Alemania (G0298 / 13) y los criterios llegar, según sea el caso. Para este estudio, de 10 a 12 semanas de edad, machos C57BL / 6J fueron utilizados.

1. lateral crónica craneal Ventana Preparación

  1. Realizar la anestesia con una inyección subcutánea de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Prueba para la sedación adecuada con un estímulo doloroso.
  2. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y campo quirúrgico con 70% de etanol.
  3. Quitar el pelo del cuero cabelludo del cuello a los ojos usando una máquina de afeitar de roedores.
  4. Fijar la cabeza en un marco estereotáxico.
  5. Utilice dexpantenol pomada ocular en ambos ojos para evitar la deshidratación.
  6. Limpiar el área quirúrgica para eliminar todos los pelos y esterilizarlo con 3 capas de 74,1% de etanol y 10% de 2-propanolol.
  7. Realizar una línea mediaincisión desde el cuello hasta los ojos utilizando un bisturí.
  8. Abarcar el colgajo de piel con 4 puntos de sutura tenting.
  9. Retire cuidadosamente el periostio en el hemisferio izquierdo raspando con un escalpelo hasta el punto donde comienza el músculo temporal.
    NOTA: Esta preparación también sirve para crear una buena zona de adhesión para que el pegamento dental, que fija la cubierta de vidrio.
  10. Realizar una craneotomía fronto-parietal con un diámetro de 4 mm por el adelgazamiento del cráneo en el borde del colgajo óseo utilizando un microtaladro. Aplicar una solución salina durante la perforación para evitar lesiones por calor.
  11. Elevar el colgajo óseo con cánulas y quitarlo usando microforceps.
  12. Lávense cuidadosamente y extensamente con solución salina.
  13. Mezclar el pegamento dental hasta que tenga la consistencia adecuada y no es fluido (es decir, el pegamento no debe producir hilos más). Lo coloca en el hueso alrededor de la craneotomía.
  14. Coloque una cubierta de vidrio con un diámetro de 6 mm en la cola preparada y fijarlo con THe resto del pegamento dental. Asegúrese de que es a prueba de agua. Espere hasta que el pegamento se seca y dura probándola con fórceps.
    NOTA: Un riego adicional acelera el proceso de curado.
  15. Retire las suturas tenting y cerrar la herida con suturas de la piel.
  16. Tire hacia arriba de la piel del costado del ratón. Insertar una aguja por vía subcutánea y sustituir suavemente por vía subcutánea 0,5 ml de solución salina estéril para mantener el equilibrio de líquidos.
  17. Después de la cirugía, mantener a los animales en la jaula de recuperación se calienta durante 90 minutos. Espere hasta que los animales son completamente despierto antes de dejarlos sin vigilancia. Espere hasta que los animales se recuperaron por completo antes de devolverlos a una jaula con otros animales.
  18. Repetir la sustitución volumen de solución salina por vía subcutánea después de aproximadamente 12 horas, como se describe en el paso 1.16.
  19. Siempre aplique analgesia a través de sonda o directamente en la cavidad oral después de la cirugía (por ejemplo, paracetamol (10 mg / ml) u otros fármacos anti-inflamatorios no esteroideos).
  20. Comprobar el estado de los animales todos los días después de la cirugía, y siempre ofrecen puré de alimentos de origen animal en el suelo en una placa de Petri para que una alimentación sencilla y para evitar la pérdida de peso crítico después de la cirugía.
    NOTA: La microscopía intravital se puede realizar en el primer día después de la preparación ventana del cráneo.
  21. Aplicar la anestesia con isoflurano y fijar el animal en un soporte de cabeza. Abra la sutura de la piel y limpiar la ventana con bastoncillos de algodón y una solución salina estéril. Después de 24 horas, la ventana del cráneo debe estar lleno de líquido cefalorraquídeo por ese punto en el tiempo, lo que permite obtener imágenes. Realizar las imágenes mediante el uso de protocolos de microscopía establecidos 18.

2. distal MCAO

NOTA: El procedimiento MCAO debe realizarse aproximadamente 5 d después de la preparación de CW. Esto reduce al mínimo la interferencia de la reacción inmune causada por la preparación CW con la reacción inmune inducida por apoplejía.

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Figura 1. Visión general de la MCAO distal. A. Esta es una buena visión general sobre los vasos antes de la operación. B. Los vasos después del primer contacto bipolar. C. Los vasos después de la segunda contacto bipolar. D. La visión general acerca de los buques, que ahora están completamente cerrados. E. resumen final con menor aumento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Anestesiar a los ratones usando una máscara de anestesia y un régimen anestésico apropiado, en consulta con el personal veterinario (por ejemplo, la inducción con 1,5 - 2%, isoflurano y mantenimiento con 1,0 - 1,5% isoflurano en 2/3 N 2 O y 1/3 O 2 a través un vaporizador).
  2. Afeitarse y quitar el pelo y la desinfección de la piel y el pelo que rodea con un agente apropiado (por ejemplo, el 70% de alcohol etílico), y secarlo después.
  3. Mantener la temperatura corporal de los ratones a 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante la cirugía. Una almohadilla térmica controlada retroalimentación, calentado según la temperatura rectal del ratón, es muy recomendable.
  4. Colocar el animal en la posición lateral. Fijar la nariz de la máscara de anestesia y ajustar la concentración de isoflurano al 1,0 - 1,5%.
  5. Aplique un ungüento húmedo (dexpantenol) para ambos ojos.
  6. Utilice la incisión de la piel hecha para la preparación de CW.
  7. separar suavemente la piel e identificar el músculo temporal por debajo.
  8. Ajustar la energía del generador de alta frecuencia (5-7 W) y utilizar el modo bipolar.
  9. Utilice las pinzas de electrocoagulación y retirar con cuidado el músculo temporal del cráneo, la creación de un colgajo de músculo, sin eliminar totalmente el músculo.
  10. Identificar la MCA por debajo del cráneo transparente en la parte rostral del área temporal, dorsal a la retro-orbital sinusal. Si la bifurcación MCA no se puede identificar, tratar de identificar el buque más rostral.
  11. Delgada del cráneo por encima de la rama de MCA con un microtaladro mientras continua el riego para evitar el daño por calor.
  12. Levantar el hueso con cánulas y quitarlo con microforceps.
  13. Disminuir la energía del generador de alta frecuencia a 3-5 W.
  14. El enfoque de la arteria desde arriba y suavemente tocarlo con las pinzas bipolares en ambos lados sin levantar el vaso.
  15. Coagular la arteria proximal y distal a la bifurcación del vaso.
  16. Espere durante 30 segundos, y luego tocar la arteria suavemente para asegurar que el flujo sanguíneo se interrumpe de forma permanente. Repetir la electrocoagulación si se observa una recanalización.
  17. Fijar el músculo temporal con 1 o 2 puntos de sutura en la inserción del músculo para cubrir el defecto óseo, si es posible.
  18. Suturar la herida y colocar al animal en el cuadro de recuperación climatizada. En general, la recuperación de los animales rápidamente después anest volátileshesia.
  19. Para la sustitución de volumen, se aplican por vía subcutánea 0,5 ml de solución salina estéril, como se describe en el paso 1,16.
  20. Después de la cirugía, permitir que los animales permanecen en la jaula de recuperación se calienta durante 90 minutos. Espere hasta que los animales son conscientes antes de dejarlos sin vigilancia. Sólo devolverlos a una jaula con otros animales cuando están completamente recuperados.
  21. Repetir la sustitución de volumen, como se explica en el paso 1.16, después de 12 horas.
  22. Aplicar la analgesia postoperatoria través del agua potable (por ejemplo, paracetamol (10 mg / ml) u otros fármacos anti-inflamatorios no esteroideos).
  23. Compruebe el estado de salud de los animales todos los días después de la cirugía. Proporcionar alimentos animales puré en una placa de Petri en el suelo para simplificar el comer y para reducir al mínimo la pérdida de peso postoperatorio.

3. Tratamiento Sham

  1. Realizar todos los procedimientos de forma idéntica a los pasos 1 y 2 descritos anteriormente, incluyendo CW-preparación-excepto que no coagular el ar cerebral media expuestabatería.

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Representative Results

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La línea de tiempo y los resultados representativos se muestran en las figuras 2 y 3. La preparación de ventana del cráneo, con una pequeña ventana lateral craneal al seno sagital superior (Figura 2 B, C, D) se traduce en una tasa de mortalidad y morbilidad muy baja cuando se lleva a cabo por un cirujano experimentado. Todos los 10 animales sobrevivieron, y todos CW crónica se podría utilizar para obtener imágenes de alta calidad, incluso 28 días después de la cirugía. No había ningún problema con infecciones de la herida u otras complicaciones.

Debido a la corta exposición a la anestesia volátil y sólo daño cerebral menor, aproximadamente el 10 - 15 min después de la MCAO distal y traslado a la jaula de recuperación climatizada, todos los animales estaban despiertos, moviéndose libremente en la jaula de recuperación, y la interacción con sus compañeros de camada. En general, la mortalidad del modelo de MCAO distal es menos de 5% y principalmente se produce como resultado de i vascularnjury y posterior hemorragia durante la cirugía MCAO. La mortalidad durante el período de observación de 28 días después de la MCAO distal se produce sólo en muy raras ocasiones. Morfológicamente, la lesión puede evaluarse usando histología o resonancia magnética (Figura 3 A, B). Además, las mediciones de resonancia magnética ofrecen la oportunidad de evaluar el volumen de la lesión y la progresión de una manera longitudinal. Una resonancia magnética realizó 24 horas después de la isquemia representa claramente la lesión isquémica situado debajo del CW crónica, mientras que después de la cirugía simulada, no tejido cortical lesionadas se encontró (Figura 3A). Los resultados de MRI muestran claramente la restricción estricta de la lesión a la corteza, evitando así el cuerpo estriado, en contraste con el modelo MCAO filamentosa (Figura 3B). La preparación CW crónica lateral permite la visualización a largo plazo de la vasculatura cortical y la microcirculación por microscopía de epi-fluorescencia (Figura 3C, parte superior) y de áreas subcorticales por microscopía de dos fotones (Figure 3C, parte inferior). Además, es posible vías moleculares de la imagen y de las interacciones de célula a célula con células marcadas con fluorescencia o mediciones de autofluorescencia, como las imágenes de vida de fluorescencia. Como se muestra en la figura 3D, el modelo MCAO distal causa lesiones isquémicas altamente reproducibles. En cuanto al volumen de infarto, esperamos una desviación estándar por debajo del 15% en un solo conjunto de cirugías. Como se mencionó anteriormente, en contraste con los modelos de MCAO proximal, las tasas de mortalidad son más bien baja para el modelo distal 5. El uso de MRI secuencial, lesión, el volumen, y la progresión de edema después de una isquemia cerebral focal se puede evaluar. La resonancia magnética a las 24 horas y 96 horas después de la MCAO permanente distal mostró ninguna progresión significativa de hiperintensidades T2.

Figura 2
Figura 2: Preparación de ventana craneal crónica. (A) Calendario indicativo. <strong> (B) Marcado el área donde la craneotomía se lleva a cabo, lateral al músculo temporal, medial al seno sagital superior y dorsal a bregma. (C) la superficie del cerebro después de una craneotomía, con una capa dura intacta y el cristal de la cubierta en su lugar; el círculo muestra la ubicación de la zona isquémica después de MCAO distal. (D) ventana del cráneo crónica Acabado con cubierta de vidrio fijo, listo para la imagen repetitiva durante varias semanas (b = bregma, tm = músculo temporal, SSS = seno sagital superior, Si = superficie de la isquemia). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Combinación de la cirugía CW y distal MCAO o Sham crónica lateral. (A) La resonancia magnética realizada 24 horas después de la HMam cirugía no muestra cualquier tejido cortical lesionadas. (B) La MRI realizó 24 horas después de la isquemia representa claramente la lesión isquémica (*) situado debajo de la CW crónica. Proyección de imagen (C) intravital epifluorescencia (parte superior) y de dos fotones (parte inferior) de la vasculatura cortical. Volumen (D) del infarto evaluó a través de resonancia magnética a las 24 horas y 96 horas después de la isquemia muestra un volumen de lesión media de 13.16 2,3 mm 3 a las 24 horas y un 12,2 1,9 mm 3 a las 96 horas. Cada punto representa un animal individual (n = 10 animales por grupo, media ± SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Accidente cerebrovascular es una de las principales causas de discapacidad a largo plazo y la muerte en todo el mundo 1. Más allá de tratamiento agudo, la investigación de nuevos enfoques y mecanismos para acelerar y mejorar la recuperación después del accidente cerebrovascular sigue siendo un objetivo primordial médica 7. investigadores ictus experimentales emplean con frecuencia modelos de roedores de isquemia cerebral focal. De hecho, los modelos que inducen transitoria o permanente MCAO imitan uno de los tipos más comunes de isquemia cerebral focal en los pacientes 4. Además de la oclusión proximal de la MCA, el modelo de filamento para la oclusión quirúrgica de la MCAO distal es probablemente el modelo más utilizado en la investigación experimental de 5,19 accidente cerebrovascular. A continuación, describimos la técnica básica de MCAO permanente distal combina con un CW lateral, que ofrece la oportunidad para microscopía intravital longitudinal en ratones. Alta reproducibilidad del volumen de la lesión, así como muy bajas tasas de mortalidad, en particular con respecto al estudio de resultados a largo plazo, ARe las principales ventajas de este modelo murino. En este modelo de carrera cortical, los vasos sanguíneos en el área de derrame cerebral y la región peri-infarto se pueden visualizar a través de la CW crónica. El uso de un sistema de epifluorescencia videomicroscopic multi-fluorescencia, la dinámica del flujo de sangre y el reclutamiento dinámica de células circulantes puede ser visualizado. Los vasos sanguíneos se visualizan a través de la utilización de macromoléculas marcadas con fluorescencia, como dextranos o albúmina. Las células pueden ser etiquetados, ya sea por tintes fluorescentes o por modelos genéticos, tales como quimeras de médula ósea con animales GFP-positivas. Además, para estudiar las interacciones de célula a célula y la dinámica de las células extravasculares, un escaneo láser confocal microscopio de dos fotones se puede aplicar. Imaging hasta 250 micras debajo de la superficie cortical se puede realizar. Una vez más, los vasos sanguíneos se tiñeron utilizando macromoléculas marcadas con fluorescencia, y las células se marcan genéticamente (por ejemplo, utilizando el ratón GFP-nestina transgénico).

La ventana cranealcirugía se realiza a través de una craneotomía sin necesidad de abrir la duramadre. Una gran peligro es para dañar accidentalmente la capa dural y la corteza debajo cuando se abre el cráneo con el microtaladro. Por lo tanto, esta técnica requiere un poco de habilidad técnica con el fin de evitar daños a la duramadre y la corteza, lo que induce una reacción y las influencias de microscopía inmunes resultados. Alternativamente, un modelo potencial-cráneo adelgazado está limitada por la calidad de microscopía menos fiable debido a la cráneo restante, especialmente en el largo plazo. Con frecuencia, repetitivo adelgazamiento cráneo es necesario, mientras que en el modelo CW, la calidad ventana tiene una duración de varios meses, hasta que el nuevo crecimiento cráneo o influencias engrosamiento de la duramadre imágenes de calidad con 14,20. Una adaptación de este modelo con una preparación de cráneo adelgazado sería posible. La capa dural se debe dejar en el cerebro para evitar cualquier lesión o de excitación de la corteza. Sólo si se desea una aplicación directa en el área isquémica en un modelo experimental se puede volver a la duramadremovido, con cuidado y sin herir a ningún venas puente.

En contraste con los modelos que combinan un CW y la inducción de la oclusión del vaso objetivo a través de la irradiación de los fotosensibilizadores circulantes, que conduce a lesiones isquémicas sólo es muy pequeña, la distales MCAO modelo imita la mayoría de los accidentes cerebrovasculares humanos que se encuentran en el territorio de la ACM cortical 13. Para evitar la interferencia con una reacción inflamatoria transitoria debido a la preparación CW, la ventana se debe preparar varios días antes de la cirugía MCAO distal.

Una serie de pruebas para evaluar los aspectos funcionales, así como de comportamiento en los roedores están disponibles (por ejemplo, análisis de la marcha, prueba de cilindro giratorio, prueba de polo, prueba de eliminación de adhesivo, ensayo de la escalera, prueba de campo abierto, y Morris laberinto de agua) 21. En todas estas pruebas, los ratones sometidos a MCAO realizan con menos éxito que los animales control con respecto a los resultados a corto plazo y mediano plazo. Sin embargo, con respecto a la evaluación deresultados a largo plazo, hay que reconocer que la sensibilidad de la prueba funcional es muy limitado en términos de MCAO distal, así como leves proximal MCAO 19,21-23.

Distal MCAO, realizada por cirujanos bien entrenados, puede ser inducida en menos de 20 minutos y puede producir lesiones isquémicas altamente reproducibles. Sin embargo, la reproducibilidad requiere un control exhaustivo de los factores de confusión. Las diferencias en las técnicas quirúrgicas pueden dar lugar a diferencias en el tamaño del infarto 24. Las diferentes cepas de ratón pueden mostrar un resultado de carrera adicional debido a las variaciones en la anatomía vascular cerebral entre las cepas. Además, como la temperatura del cuerpo afecta el daño neuronal y la susceptibilidad a la isquemia, con hipotermia que conduce a lesiones más pequeñas y la hipertermia a los déficit más graves 25,26, control de temperatura y el mantenimiento son muy importantes en este modelo, así como en otros modelos de isquemia 27. En general, los parámetros fisiológicos, tales como sangre pressuRe y gases en sangre, son importantes factores de confusión de los resultados y deben ser controlados para el 28. Además, la elección de la anestesia es muy importante, ya que algunos agentes pueden ejercer efectos neuroprotectores directos o actuar indirectamente a través de propiedades vasoactivas 29. Por lo tanto, la exposición a la anestesia debe ser estandarizado y se mantiene lo más corto posible. Por último, las condiciones de vivienda, al igual que el uso de enriquecimiento, pueden afectar el resultado de carrera así, y por lo tanto deben ser estandarizados y se describe en los informes de la investigación 30. Para producir resultados preclínicos relevantes para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos, normalización, control de calidad y la presentación de informes son de la mayor importancia 31.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular surgical microscope Zeiss Stemi 2000 C
Light source for microscope Zeiss CL 6000 LED
Heating pad with rectal probe FST 21061-10
Stereotactic frame Kopf Model 930
Anaethesia system for isoflurane Draeger
Isoflurane Abott
Dumont forceps #5 FST 11251-10
Dumont forceps #7 FST 11271-30
Bipolar Forceps Erbe 20195-501
Bipolar Forceps  Erbe                              20195-022
Microdrill FST                              18000-17         
Needle holder FST 12010-14
5-0 silk suture Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture Feuerstein, Suprama
Veterinary Recovery Chamber Peco Services V1200

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References

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Ventana lateral crónica craneal Preparación Activa<em&gt; En Vivo</em&gt; Observación Siguiendo distal de la arteria cerebral media oclusión en ratones
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Bayerl, S. H., Nieminen-Kelhä, M., Broggini, T., Vajkoczy, P., Prinz, V. Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (118), e54701, doi:10.3791/54701 (2016).More

Bayerl, S. H., Nieminen-Kelhä, M., Broggini, T., Vajkoczy, P., Prinz, V. Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (118), e54701, doi:10.3791/54701 (2016).

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