Introduction
Dictyostelium discoideum er ensomme jord levende amøber, der lever af bakterier og andre mikroorganismer, som tages op af fagocytose. Det har en unik og bemærkelsesværdig livscyklus, der har været et stort forskningsområde siden sin opdagelse 1. Den tidlige interesse i multicellulære udvikling 2 og den molekylære basis for kemotaksi 3 blev snart suppleret af undersøgelser, der fokuserer på cellemotilitet, cellepolaritet, medfødte immunitet. Desuden D. discoideum blev indført som et modelsystem til biomedicinsk forskning 4,5.
For nylig etablerede vi D. discoideum som et nyt system til at studere protein kvalitetskontrol (PQC) systemet 6,7. Dens proteomanalyse er beriget i sammenlægning-tilbøjelige prion-lignende proteiner, som udgør en udfordring til protein kvalitetskontrol 8. For at undersøge om D. discoideum har udviklet særlige molekylære mekanismer til at styre sit meget agmenighed-tilbøjelige proteom, vi studerede adfærd sammenlægning-tilbøjelige markørproteiner både under normale vækstbetingelser og under stress. Stressbetingelser såsom varmestress, kan anvendes til at øge hastigheden af protein misfoldning 9. Derfor søgte vi et system, hvor vi kunne fremkalde temperaturændringer og samtidig følge adfærd markørproteiner. Til dette formål har vi kombinerede live-cell imaging med Peltier-kontrolleret opvarmning ved anvendelse af et termisk trin indsats (kølekammer). Denne metode tillod os at opretholde en konstant og ensartet temperatur samt til at inducere en hurtig, men alligevel præcis temperaturændring.
Live-cell imaging benyttes til at undersøge en række biologiske processer i D. discoideum. Men denne tilgang står over for to store begrænsninger. Først cellerne udviser høj motilitet og har tendens til at migrere ud af synsfeltet, således sporing af individuelle celler kræver ofte billeddannelse af et stort område. Cellen mobilitet kannedsættes med Agar overlay 10, men disse betingelser er ikke egnede til langvarig billeddannelse på grund af et fald i levedygtighed. Sekund, D. discoideum-celler udviser en særlig høj følsomhed for foto-toksicitet, hvilket resulterer i celleafrunding og mitosestandsning 11. Tidligere protokoller behandlet dette spørgsmål ved tilsætning af ascorbat som radikaler og reduktion af eksponering gange 12. Sidstnævnte kan være kritisk, hvis proteinet af interesse udtrykkes ved lave niveauer og viser en svag fluorescens-signal. Forfatterne foreslår også at give en konstant temperatur på 21 ° C, enten ved billedbehandling i et airconditioneret rum eller ved at bruge temperaturstyrede inkubation kasser, som dækker det objektive og mikroskopbordet 12.
Her beskriver vi en fremgangsmåde med forbedret temperaturkontrol ved hjælp af en kølekammer indstillet ved 23 ° C. Under billeddannelse vores set-up forøger markant modstand til foto-toksicitet. Dettillader brugen af højere eksponeringstider og højere excitations- lysintensiteter. Dette er særlig vigtigt i løbet af time-lapse billeddannelse, da tidsintervallerne skal være nøje afbalanceret forhold til antallet af positioner afbildet og behandlingstid brugt. Muligheden for at øge antallet af afbildede positioner tillader også dækning af et bredere billedområde og letter sporing af individuelle celler over en længere periode.
Protocol
1. Cell Fremstilling
- voksende celler
- Grow D. discoideum-celler i AX medium ved 23 ° C under lys i vævskulturplader. Undgå at holde celler ved høje tætheder over 75% sammenflydning.
BEMÆRK: For optimal respons på varmestress, celler skal være i den eksponentielle vækstfase, og burde ikke have nået stationær fase. - Dagen før billedbehandling, split celler i lav fluorescens medium (LFM) til 1 x 10 4 celler / ml.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at reducere baggrundsfluorescens forårsaget af AX medium. Inkubationstiden kan reduceres til et minimum på 2 timer. Dog kan vesikler taget op i AX medium stadig generere nogle baggrund signal efter 2 timer.
- Grow D. discoideum-celler i AX medium ved 23 ° C under lys i vævskulturplader. Undgå at holde celler ved høje tætheder over 75% sammenflydning.
- Forberedelse celler til mikroskopi
- Før billedbehandling, høst celler fra vævet plade i LFM og overføre et tilstrækkeligt antal celler i glasbund retter.
BEMÆRK: Normalt,1 x 10 5 celler / ml er tilstrækkelig; men hvis den eksperimentelle opsætning kræver lange imaging perioder (mere end 8 timer), skal justeres omhyggeligt, som D. celletal discoideum celler vil overgå til den udviklingsmæssige cyklus og begynde at streame og aggregat, hvis celle tal er høje, mens næringsstoffer er lav. - Lad cellerne til at nøjes med 20 min. Fjerne ikke-afviklede celler ved omhyggeligt at erstatte den brugte medium med frisk medium.
- Før billedbehandling, høst celler fra vævet plade i LFM og overføre et tilstrækkeligt antal celler i glasbund retter.
2. Imaging
BEMÆRK: protokol kan bruges på wide-field-systemer samt i konfokale mikroskopi opsætninger. Brugen af en temperaturstyret inkubation kasse dækker de mål og objektbordet er nyttige, men ikke væsentlige for temperaturkontrol. Temperaturen af inkubationen boksen er indstillet til den højeste temperatur, der anvendes i forsøget, f.eks til 40 ° C, hvis varmestress udføres. Ellers er temperaturen indstillet til 256; C. bør temperaturændringer på forhånd at lade systemet tilpasse sig, da ændringer i temperaturen under billeddannelse kan påvirke fokus.
BEMÆRK: Under billedbehandling, er temperaturen styres ved anvendelse af et kølekammer. Standard temperatur billeddannelse ikke-stressede celler er 23 ° C. For udsættes for varmestress temperaturen øges tilsvarende til det ønskede niveau. Piezoelementet i kølekammeret kan reagere meget hurtigt til den temperatur skift. fokus for billederne, vil imidlertid ændre sig lidt (det kan afvige op til 20 um afhængigt af temperaturen shift). Således kræves manuel fokusering inden for de første minutter af erhvervelse billedet, medmindre det anvendte mikroskop er udstyret med en hardware autofokus.
- Billede erhvervelse under ikke-stressede vilkår
- Billede celler under ikke-stressede forhold ved 23 ° C, erhverve mindst 6 synsfelter (FOVs).
BEMÆRK: Ikke-stress tilstand kan være visualized enten ved at optage en kort time-lapse (5-30 min) eller erhvervelse af repræsentative stillbilleder. For hver tilstand eller cellelinie erhverve mindst 6 synsfelter (FOVs).
BEMÆRK: I tilfælde individuelle celler er af interesse, anbringe de respektive celler i midten af FOV og optage en 3 x 3 flise serie med FOV indeholdende cellerne af interesse i midten D.. discoideum-celler er bevægelige og kan migrere ud af FOV'et. Men den 3 x 3 flise serie øger området potentielt udforsket af cellen af interesse, og det er stadig spores til tidsforskudte perioder ~ 6 timer. - Erhverve z-stakke af højst 7 um i 1-0.25 um trin til at fange hele volumenet af cellen.
- Erhverve en referencefelt lyse billede for at vurdere det totale antal celler.
- Billede celler under ikke-stressede forhold ved 23 ° C, erhverve mindst 6 synsfelter (FOVs).
- Erhvervelse Billede for varmestress
- Juster temperaturen af kølekammeret til 30 ° C ifølge producentens anvisninger. </ Li>
- Efter at temperaturen displayet har nået den ønskede værdi, koncentrere manuelt i lyse felt kanal og find ud af alle optagne FOVs før du starter time-lapse.
- Start en tidsforskudt i 4 timer af varmestress med et tidsinterval på 5-10 min mellem tidspunkter. Kontroller den korrekte fokusering under købet af de to første tidspunkter.
- Erhvervelse Billede under restitution
- Efter varmestress, reducere temperaturen tilbage til 23 ° C, vent til temperaturen display til at justere og målrette manuelt.
- Optag time-lapse film i opsvingsfasen for 8-10 timer i 10-20 min tidsintervaller. Kontroller den korrekte fokusering under købet af det første tidspunkt.
3. Image Analysis
BEMÆRK: For at kvantificere antallet af celler, der huser cytosolisk foci, vurdere det totale antal celler og antallet af celler med cytosolisk foci i hver gangramme. På grund af vanskeligheden ved at segmentere celler fra lyse felt billeder, der skal gøres manuelt kvantificering. I det følgende er dataanalyse beskrevet for gratis billedbehandling pakke ((http://fiji.sc/Fiji). Det kræver plugin "Cell Counter" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
- Vurdering totale antal celler
- Læg den lyse felt billedstak (XYT) ved at klikke på "File" og "Open".
- Åbn "Cell Counter" plugin ( "Plugins" - "Cell Counter"). Læg stakken billedet ved at klikke på "Initialiser".
- Vælg den rigtige type tællere ved at sætte kryds i den relevante rubrik.
BEMÆRK: brug type 1 som tæller for samlet antal celler og type 2 som tæller for celler med cytosolisk foci. Tælle alle celler. - Spar markørerne ved at klikke på "Gem Markers".
- Vurdering af antallet af celler med cytosolisk foci
- <li> Indlæs fluorescens billedet hyperstack (XZYT) ( "File" - "Open") og lave en maksimal intensitet fremskrivning ved hjælp af "Z-projektor" (Billede / Stakke).
- Åbn "Cell Counter" plugin. Læg det resulterende billede stack (XYT) ved at klikke "Initialiser".
- Læg markørerne ved at klikke på "Load Markers".
ADVARSEL: De filnavnene på reference image og fluorescens stakken skal være identisk. Hvis det er nødvendigt, omdøbe tilsvarende før initialisering stak billedet. - Vælg den relevante markør type (se 3.1.3) og tælle celler med cytosolisk foci. De eksisterende markører kan anvendes som vejledning for positionen af de enkelte celler.
- Hent antal tællinger pr skive ved at klikke på "Results" og gemme tæller andetsteds til yderligere beregninger.
Representative Results
Den beskrevne imaging protokol kan bruges til at analysere adfærden af aggregering-tilbøjelige prion-lignende proteiner i amøbe D. discoideum under varmepåvirkning. Figur 1 viser fordelingen af GFP-mærkede polyglutamine protein Q103 i celler under normale vækstbetingelser (figur 1A), efter 2 timers varmestress ved 30 ° C (figur 1B), og efter 6 timers stress nyttiggørelse og vækst ved normale vækstbetingelser (Figur 1C). Ved temperaturstigning fra 23 ° C til 30 ° C, den Q103-GFP markør coalesces fra en diffus distribution til punktformet strukturer. Ved stress frigivelse og vækst ved normal temperatur, disse strukturer opløses. Omfordelingen af Q103-GFP og dannelse af varmestress-induceret cytosol foci kan kvantificeres ved hjælp af billedanalyse. Figur 2A viser analysen af de enkelte FOVs hjælp Fiji og plugin "Cell tæller ". Figur 2B viser kvantificering af varmen stress respons. Dette viser, at den cytosoliske Q103-GFP foci stigning i antallet med fortsat varmestress. Under varmestress, proteinet kvalitetskontrol (PQC) system er overvældet, således aggregation- tilbøjelige proteiner, såsom den prion-lignende protein Q103 kan ikke opretholdes i en opløselig tilstand og i stigende grad aggregat i cytosolisk foci. cellerne viser også en karakteristisk afrunding, som vist i figur 1B. reduktionen af cytosolisk foci efter stress fjernelse antyder, at det aggregerede proteiner opløses.
Den billedkvalitet er følsomt over for den oprindelige celledensitet. Figur 3 viser et eksempel på celler efter stress nyttiggørelse, sammenligne passende indledende celledensitet (figur 3A) og høj initial celledensitet (figur 3B). Hvis den første celledensitet var for høj, celler stjerneTed at danne strømme som afbildet i figur 3b. Dette som pålægger vanskeligheder på den efterfølgende kvantificering som cellerne er flyttet ud af fokusplanet.
Den beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til at overvåge temperatur-inducerede ændringer som beskrevet ovenfor. Den kan også anvendes til at reducere foto-toksicitet, når billeddannelse ved fysiologisk temperatur vækst. Figur 4 viser en sammenligning af celle afbildet ved 23 ° C i et kølekammer (figur 4A), og celler afbildet uden temperaturkontrol i en aircondition værelse, sæt til 25 ° C (figur 4B). Ved konstant udsættelse for excitationslyset, celler runde op, når de ikke afbildet under temperaturkontrol. Denne ændring i celleform indikerer stress.
Figur 1:
Figur 2: Kvantificering af varme-induceret cytosolisk foci dannelse (A) Analyse af celler ved hjælp af den gratis billedbehandling pakke Fiji og plugin "Cell Counter".. Den totale mængde af celler (type 1, blå counter markører) bestemmes i den lyse billedfeltet. Markørerne er lagt i GFP-kanal, og antallet af celler med cytosolisk foci (type 2, røde counter markører) bestemmes. (B) Kvantificering af foci efter 3 hr af varmestress ved 30 ° C og 3 timer af stress inddrivelse ved 23 ° C (n = 4 synsfelter, fejl bar = SD). Klik her for at se en større version af denne figur.
.jpg "/>
Figur 4:. Virkning af temperaturkontrol på fototoksiske virkninger (A) Celler afbildet i 10 minutter med temperaturstyring ved 23 ° C: 6 synsfelter, z-stabel (afstand 0,5 uM, prøvetykkelse 8 uM), tid lapse (total tid 10 min, lapse 1 min), GFP kanal (0,07 msek eksponeringstid, 10% laser intensitet), RFP kanal (0,1 msek eksponeringstid, 10% laser intensitet). Celler viser ingen tegn på de karakteristiske morfologiske ændringer forbundet med fototoksisk stress. (B) Celler afbildet i 10 min uden temperaturkontrol (samme betingelser som i A). Celler udviser tegn på fototoksisk induceret afrunding, hvilket indikerer stress. Scale bar = 10 um. Cellerne blev afbildet på et system baseret på et mikroskop med en 100x / 1,4 numerisk åbning (NA) mål. Billederne blev indsamlet med et CCD-kamera som 1.024 x 1.024 pixel filer ved hjælp af 1 x 1 binning.4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Protokollen beskrevet her kan anvendes til at undersøge opførslen af et bestemt protein af interesse i afhængighed af varmeinduceret stress. Temperaturstigning til 30 ° C er blevet rapporteret til at udløse varmestress respons og under disse betingelser levedygtighed D. discoideum er markant reduceret.
Ændringer
Protokollen kan ændres for at sammenligne adfærden af forskellige proteiner under de samme belastningsbetingelser. Til dette, er celler, der udtrykker forskellige proteiner med den samme fluorescerende fragment overført til multi-brønde, såsom fire kammer retter (afsnit 1.3.1). Protokollen kan også anvendes på celler co-ekspression af proteiner med forskellige markører, såsom GFP eller RFP. Dette kan for eksempel anvendes til at overvåge adfærden af forskellige komponenter af proteinet kvalitetskontrol (PQC) system. Celler, der udtrykker GFP-mærket aggregering markør og forskellige RFP-mærkede PCQ komponenter kan observeres ved anvendelse af multi-brønddished til billeddannelse. Dette sikrer de samme stress betingelser (hastighed temperaturstigning / fald, varigheden af temperaturstigningen / fald) og giver mulighed for komparative studier.
Endvidere kan protokollen anvendes til at undersøge indflydelsen af PQC system på varmestress respons. Aktiviteten af komponenterne kan moduleres ved at ændre ekspressionsniveauer anvende genetiske værktøjer såsom knock-out eller overekspression eller ved anvendelse af kommercielt tilgængelige specifikke inhibitorer 6. Proteasomet kan inhiberes ved tilsætning MG132 (100 uM) eller lactacystin (10 uM) til vækstmediet. Chaperonen Hsp90 kan inhiberes ved anvendelse af geldanamycin (6 uM) eller radicicol (10 uM). Den chaperone Hsp70 kan hæmmes med VER-155.088, selvom vi ikke kunne bekræfte effekten af hæmning i vores eksperimentelle indstillinger hidtil. Inhibitorer bør tilføjes en dag før billeddannelse og cellerne inkuberes i 14 timer.
Criti cal Steps i protokollen
Det kritiske trin for vurderingen af varme-induceret perturbation er den tilstand af cellerne forud for imaging eksperiment. Studier i gær viste, at cellerne udvikler resistens over for en række miljømæssige påvirkninger under stationær fase 13. Vi observerede også minimal lydhørhed over for anvendt varmestress hvis D. discoideum celler havde nået stationær fase før billeddannelse. Derfor opretholde et konstant celle nummer <5 x 10 5 celler / ml er kritisk.
Endvidere kan høje celletal inducerer overgangen fra den vegetative cyklus af D. discoideum til den udviklingsmæssige cyklus, hvilket udløser sult veje, der kan føre til et andet svar på varmestress. Hvis høje celleantal nås i opsvingsfasen efter varmestress, streaming og aggregere celler kan forstyrre dataanalyse som cellerne flytte ud af fokus (se figur 4).
indhold "> Begrænsning af TeknikTabet af fokus er flaskehalsen af protokollen. Under temperaturændringer, kan brændplanet drastisk skift, der kræver manuel fokusering i en tidsperiode umiddelbart efter at ændre temperaturen. Springet i fokus kan undertiden være for ekstrem til overvindes ved software autofokus, især hvis tiden mellem tidspunkterne er høj. Men hvis den anvendte mikroskop er udstyret med en hardware autofokus, denne flaskehals kan omgås.
Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende metoder
I sammenligning med eksisterende opsætninger såsom brugen af aircondition, temperaturstyrede inkubation kasser omfattende mål og etaperne mikroskop scenen eller temperaturstyrede og objektive kraver, brugen af en kølende kammer giver en mere præcis styring af den omgivende temperatur. Peltier-element i kølekammeret kan opretholde en konstant og ensartet temperatur hele forsøgsopstillingen. I klassiske opsætninger, kan lokale temperaturforskelle føre til forskellige observation resultater. Desuden kan det reagere hurtigt og hurtigt på inducerede ændringer i temperaturen, mens klassiske opsætninger tilpasse meget langsomt til inducerede temperaturændringer, især sænkning af temperaturen. Peltier-element i kølekammeret kan også dække et bredere temperaturområde (15-40 ° C) end klassiske opsætninger, som nåede temperaturer, såsom 15 ° C eller 40 ° C er meget vanskelig.
Dictyostelium discoideum er særligt følsomme over for foto-toksicitet. Tidligere undersøgelser anvendte ascorbat som scavenger til at reducere foto-toksicitet. Men lange billeddiagnostiske perioder kræver ekstra tilskud. Endvidere er anvendelsen af ascorbat begrænset til undersøgelser, hvor mekanismen af interesse ikke er berørt af antioxidant supplement. Vi foreslår, at temperaturstyret billeddannelse kan anvendes som en alternativ ca.oach at minimere foto-toksicitet og kan kombineres med tilsætning af ascorbat til yderligere at reducere toksicitet.
Fototoksisk effekt kan minimeres ved at tilvejebringe en konstant og ensartet temperatur på 23 ° C under anvendelse af et kølekammer. Celler filmede med temperaturstyring viser færre tegn på foto-toksicitet, sådan celle afrunding, for en længere periode. Dette giver også billeddannelse med højere intensiteter, mindre tidsintervaller eller flere synsfelter (FOVs).
Generel anvendelse
Varmestress ved højere temperaturer har vist sig at udløse en anden varme stressrespons 14. Derfor forøgelse af temperaturen til 34 ° C eller 37 ° C kan fremkalde en anden reaktion. Ud over den anvendte temperatur stress, kan varigheden af en bestemt stresstilstand modificeres til at studere den umiddelbare reaktion eller langsigtet tilpasning varmestress.
Generelt kan den beskrevne protokol væreudvidet til en bred vifte af anvendelser. Fordi præcis temperaturstyring reducerer tilgængeligt-toksiske virkninger, kan protokollen anvendes i indstillinger, som kræver høje eksponeringstider og / eller højere excitations- lysintensiteter, fx til visualisering proteiner med et lavt ekspressionsniveau, eller i kombination med korte tidsintervaller mellem billedbehandling, fx under tidsforskudt billeddannelse. Det kan også være fordelagtigt til billeddannelse genstande, der spænder over hele cellen, fx mikrotubuli, da disse indstillinger kræver et højt antal optiske z-sektioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
- Bonner, J. T. Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).
- Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium. Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).
- Williams, J. G. Dictyostelium finds new roles to model. Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).
- Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine. European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).
- Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).
- Malinovska, L., Alberti, S. Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem. Prion. 9 (5), 339-346 (2015).
- Schneider, K., Bertolotti, A. Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms. Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).
- Dobson, C. M. Protein folding and misfolding. Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).
- Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium. Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).
- Herman, P. K. Stationary phase in yeast. Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).
- Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. Heat shock response of Dictyostelium. Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).
