Introduction
Dictyostelium discoideum är ensam jorden levande amöbor som livnär sig på bakterier och andra mikroorganismer, som tas upp genom fagocytos. Den har en unik och märklig livscykel som har varit ett stort forskningsområde sedan dess upptäckt en. Den tidiga intresset för flercellig utveckling 2 och den molekylära grunden för kemotaxi 3 snart kompletteras med studier som fokuserar på cellrörlighet, cell polaritet, medfödd immunitet. Dessutom, D. ideum infördes som ett modellsystem för biomedicinsk forskning 4,5.
Nyligen har vi etablerat D. ideum som ett nytt system för att studera protein kvalitetskontroll (PQC) systemet 6,7. Dess proteom anrikas i aggregering benägna prionliknande proteiner, vilka utgör en utmaning för protein kvalitetskontroll 8. För att undersöka huruvida D. ideum har utvecklat speciella molekylära mekanismer för att kontrollera dess mycket agförsamlingens benägna proteom, studerade vi beteendet hos aggregering benägna markörproteiner både under normala tillväxtbetingelser och under stress. Stressbetingelser, såsom värmestress, kan användas för att öka hastigheten av protein misfolding 9. Därför sökte vi ett system där vi kunde förmå temperaturförändringar och samtidigt följa beteendet hos markörproteiner. För detta ändamål, kombinerade vi live-cell imaging med Peltier-kontrollerad uppvärmning användning av en termisk stadium insats (kylkammare). Denna metod tillät oss att upprätthålla en konstant och jämn temperatur samt för att inducera en snabb men ändå exakt temperaturändring.
Live-cell imaging används för att studera en mängd olika biologiska processer i D. discoideum. Emellertid inför denna metod två stora begränsningar. Först, cellerna uppvisar en hög motilitet och tenderar att migrera ut ur synfältet, vilket således spårning av individuella celler kräver ofta avbildning av ett stort område. Cell rörlighet kanminskas med agar 10, men dessa förhållanden är inte lämpliga för långtids avbildning på grund av en nedgång i lönsamheten. För det andra, D. discoideum-celler visar en särskilt hög känslighet till foto-toxicitet, vilket resulterar i cell avrundning och mitotiska gripande 11. Tidigare protokoll upp denna fråga genom tillsats av askorbat som en radikal renhållare och begränsning av exponering gånger 12. Den senare kan vara kritisk om proteinet av intresse uttrycks vid låga nivåer och visar en svag fluorescenssignal. Författarna föreslår också att ge en konstant temperatur på 21 ° C, antingen genom avbildning i ett luftkonditionerat rum eller genom att använda temperaturreglerade inkubation lådor, som täcker målet och mikroskop scenen 12.
Här beskriver vi en metod med förbättrad temperaturkontroll genom att använda en kylnings kammare inställd på 23 ° C. Under avbildning vår set-up avsevärt förbättrar motståndet mot fototoxicitet. Detmöjliggör användningen av högre gånger exponering och högre excitation ljusintensiteter. Detta är särskilt viktigt under time-lapse avbildning, eftersom tidsintervall måste vara väl avvägd mot antalet positioner avbildas och exponeringstiden som används. Möjligheten att öka antalet avbildade positioner tillåter också täckning av ett större bildyta och underlättar spårning av individuella celler under en längre tidsperiod.
Protocol
1. Cellberedning
- växande celler
- Växer D. discoideum-celler i AX-medium vid 23 ° C under lätt i vävnadsodlingsplattor. Undvik att hålla celler vid höga densiteter över 75% konfluens.
OBS: För ett optimalt svar på värmestress, celler behöver vara i den exponentiella tillväxtfasen, och bör inte har nått stationär fas. - Dagen före avbildning, dela upp cellerna i låg fluorescens medium (LFM) till 1 x 10 4 celler / ml.
OBS: Detta steg är nödvändigt för att reducera bakgrundsfluorescens som orsakas av AX mediet. Inkubationstiden kan reduceras till ett minimum av två timmar. Men blåsor tas upp i AX mediet kan fortfarande generera en del bakgrundssignal efter två timmar.
- Växer D. discoideum-celler i AX-medium vid 23 ° C under lätt i vävnadsodlingsplattor. Undvik att hålla celler vid höga densiteter över 75% konfluens.
- Förbereder celler för mikroskopi
- Innan avbildning, skörd celler från vävnads plattan i LFM och överföra ett tillräckligt antal celler i glasbotten rätter.
OBS: Vanligtvis1 x 10 5 celler / ml är tillräcklig; Men om den experimentuppställning kräver långa avbildningstider (längre än 8 timmar), cellantal måste justeras noggrant, som D. discoideum celler kommer övergången till utvecklingscykeln och börja strömma och aggregat om cellantal är höga medan näringsämnen är låg. - Tillåta cellerna att sedimentera i 20 min. Ta bort icke-avvecklade celler genom att noggrant ersätter det använda mediet med färskt medium.
- Innan avbildning, skörd celler från vävnads plattan i LFM och överföra ett tillräckligt antal celler i glasbotten rätter.
2. Imaging
OBS: Protokollet kan användas på bred-fält system, samt i konfokalmikroskopi uppställningar. Användningen av en temperaturstyrd inkubation box täcker målen och mikroskop scenen är bra, men inte nödvändigt för temperaturreglering. Temperaturen av inkuberingen rutan är inställd på den högsta temperaturen som används i experimentet, till exempel, till 40 ° C om värmestress utförs. Annars är temperaturen inställd på 256; C. temperaturförändringar bör göras i förväg för att göra det möjligt för systemet att anpassa sig, eftersom förändringar i temperatur under avbildning kan påverka fokus.
OBS! Under avbildning, regleras temperaturen med hjälp av en kylkammare. Standardtemperaturen för avbildning icke stressade celler är 23 ° C. För värmestressbetingelser, ökas temperaturen i enlighet med detta till den önskade nivån. Piezoelementet i kylkammaren kan svara mycket snabbt på temperaturförändringen. Emellertid kommer i fokus för de bilder som ändras något (den kan avvika till upp till 20 | im beroende på temperaturväxling). manuell fokusering Således krävs inom de första minuterna av bildtagning, såvida inte den använda mikroskopet är utrustad med en hårdvaru autofokus.
- Bildtagning under icke-stressförhållanden
- Bild celler under icke-betonade förhållanden vid 23 ° C, förvärva minst 6 synfält (FOVs).
OBS: Icke-spänningstillstånd kan vara visualized antingen genom att spela in en kort time-lapse (5-30 min) eller förvärv av representativa stillbilder. För varje tillstånd eller cellinje förvärva minst 6 synfält (FOVs).
OBS: Vid enskilda celler är av intresse, positionera de respektive cellerna i mitten av FOV och spela in en 3 x 3 kakel serie med FOV innehåller cellerna av intresse i mitten D.. discoideum celler är rörliga och kan migrera ut ur FOV. Ökar emellertid 3 x 3 kakel serie området potentiellt utforskas av cellen av intresse och det återstår spårbar för tidsförlopp perioder ~ 6 tim. - Förvärva z-staplar av maximalt 7 ^ m i 1-0.25 um steg för att fånga hela volymen av cellen.
- Förvärva en referens ljust fält bild för att bedöma det totala antalet celler.
- Bild celler under icke-betonade förhållanden vid 23 ° C, förvärva minst 6 synfält (FOVs).
- Bild förvärv för värmestress
- Justera temperaturen hos kylningskammaren till 30 ° C enligt tillverkarens instruktioner. </ Li>
- Efter temperaturdisplayen har nått det önskade värdet, fokusera manuellt i ljusa fält kanal och kontrollera alla inspelade FOVs innan time-lapse.
- Starta en tidsförlopp under 4 h för värmepåfrestning med ett tidsintervall av 5-10 minuter mellan tidpunkterna. Kontrollera om korrekt fokusering vid förvärvet av de två första tidpunkter.
- Bildtagning under återhämtning
- Efter värmestress, sänka temperaturen till 23 ° C, vänta tills temperaturen displayen för att justera och fokusera manuellt.
- Spela time-lapse filmer i återhämtningsfasen efter 8-10 timmar i 10-20 min tidsintervall. Kontrollera om korrekt fokusering vid förvärvet av den första tidpunkten.
3. Bildanalys
NOTERA: För att kvantifiera antalet celler som härbärgerar cytosoliskt foci, bedöma det totala antalet celler och antalet celler med cytosoliskt foci i varje gångram. På grund av svårigheten att segmentera celler från ljusa fält bilder, behöver kvantifiering göras manuellt. I det följande dataanalys som beskrivits för den fria bildbehandlings paket ((http://fiji.sc/Fiji). Det kräver plugin "Cell Counter" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
- Bedöma totala antalet celler
- Fyll den ljusa fältbildstapel (XYT) genom att klicka på "File" och "Open".
- Öppna "Cell Counter" plugin ( "Plugins" - "Cell Counter"). Ladda bildstapel genom att klicka på "Initiera".
- Välj lämplig typ av räknare genom att kryssa i lämplig ruta.
OBS: använd typ 1 som räknare för det totala antalet celler och typ 2 som räknare för celler med cytosoliskt fokus. Räkna alla celler. - Spara markörerna genom att klicka på "Spara Markers".
- Bedömning av antalet celler med cytosoliskt härdar
- <li> Ladda fluorescens bild Hypers (XZYT) ( "File" - "Öppna") och göra en maximal intensitet projektion med hjälp av "Z-projektor" (Bild / Stacks).
- Öppna "Cell Counter" plugin. Fyll den resulterande bilden stacken (XYT) genom att klicka på "Initiera".
- Ladda markörerna genom att klicka på "Last Markers".
VARNING: filnamn referensbilden och fluorescensbunten måste vara identiska. Om det behövs, byta namn följaktligen innan initiering av bildstapel. - Välj lämplig markör typ (se 3.1.3) och räkna celler med cytosoliskt fokus. De befintliga markörer kan användas som vägledning för positionen av enskilda celler.
- Hämta antalet pulser per skiva genom att klicka på "Resultat" och spara räknas någon annanstans för ytterligare beräkningar.
Representative Results
Den beskrivna bildprotokoll kan användas för att analysera beteendet hos aggregering benägna prionliknande proteiner i amöba D. discoideum under värmestress. Figur 1 visar fördelningen av GFP-märkta polyglutamine protein Q103 i celler under normala odlingsbetingelser (Figur 1A), efter 2 timmars värmepåfrestning vid 30 ° C (Figur 1B) och efter 6 timmar av stress återhämtning och tillväxt vid normala odlingsbetingelser (Figur 1C). Vid temperaturökning från 23 ° C till 30 ° C, sammansmälter den Q103-GFP markör från en diffus distribution till punktat konstruktioner. Vid stress release och tillväxt vid normal temperatur, dessa strukturer upplöses. Omfördelningen av Q103-GFP och bildning av värme stressinducerad cytosoliska fokus kan kvantifieras med hjälp av bildanalys. Figur 2A visar analys av enskilda FOVs hjälp Fiji och plugin "Cell räknare ". Figur 2B visar kvantifieringen av värmestressrespons. Detta visar att den cytosoliska Q103-GFP foci ökning av antalet med fortsatt värmestress. Under värmestress, är överväldigad, sålunda aggregation- proteinet kvalitetskontroll (PQC) -system utsatta proteiner såsom prionliknande protein Q103 inte kan upprätthållas i ett lösligt tillstånd och allt aggregat i cytosoliska fokus. cellerna visar också en karakteristisk avrundning, som visas i figur 1B. föreslår minskningen av cytosoliska härdar efter spännings bort att den aggregerade proteiner är upplösta.
Avbildningskvalitet är känslig för den initiala celldensiteten. Figur 3 visar ett exempel på celler efter spännings återhämtning, att jämföra lämpligt initiala celldensiteten (figur 3A) och hög initial celldensitet (figur 3B). Om den initiala celldensiteten var för hög, celler stjärnated att bilda strömmar såsom visas i figur 3b. Detta som innebär svårigheter på den efterföljande kvantifieringen som cellerna har flyttat ut ur fokalplanet.
Det beskrivna förfarandet kan användas för att övervaka temperaturframkallade förändringar som beskrivits ovan. Den kan också användas för att minska foto toxicitet vid avbildning vid fysiologiskt tillväxttemperatur. Figur 4 visar en jämförelse av cell avbildas vid 23 ° C i en kylkammare (Figur 4A) och celler avbildas utan temperaturreglering i ett luftkonditionerat rum, ställ till 25 ° C (Figur 4B). Vid konstant exponering för exciteringsljuset, celler runda upp när de inte avbildas i temperaturreglerade förhållanden. Denna förändring i cellform är indikering av stress.
Figur 1:
Figur 2: Kvantifiering av värmeinducerad cytosoliskt härdar bildning (A) Analys av celler genom att använda den fria bildbehandlings paket Fiji och plugin "Cell Counter".. Den totala mängden celler (typ 1, blå motverka markörer) bestäms i den ljusa fält bild. Markörerna lastas i GFP-kanalen och antalet celler med cytosoliskt foci (typ 2, röda motverka markörer) bestäms. (B) Kvantifiering av foci efter tre timmar av värmestress vid 30 ° C och 3 timmar av stress återhämtning vid 23 ° C (n = 4 synfält, felstapel = SD). Klicka här för att se en större version av denna figur.
.jpg "/>
Figur 4:. Effekt av temperaturkontrollen på fototoxiska effekter (A) Celler avbildas under 10 minuter med temperaturkontroll vid 23 ° C: 6 synfält, z-stack (avstånd 0,5 pM, provets tjocklek 8 ^ M), Tidsförlopp (total 10 min förfalla 1 min), GFP kanal (0,07 ms exponeringstid, 10% laserintensiteten), RFP kanal (0,1 ms exponeringstid, 10% laserintensiteten). Celler visar inga tecken på de karakteristiska morfologiska förändringar i samband med fototoxisk stress. (B) Celler avbildas under 10 minuter utan temperaturkontroll (samma villkor som i A). Celler uppvisar tecken på fototoxisk inducerad avrundning, indikering av stress. Skalstreck = 10 | im. Cellerna avbildades på ett system baserat på ett mikroskop med en 100x / 1,4 numerisk bländare (NA) mål. Bilderna togs med en CCD-kamera som 1024 x 1024 pixel filer med 1 x 1 binning.4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet som beskrivs här kan användas för att studera beteendet hos ett speciellt protein av intresse som svar på värmeinducerad påkänning. Temperaturökning till 30 ° C har rapporterats att utlösa värme stressvar och under dessa betingelser livskraft D. ideum minskas markant.
modifieringar
Protokollet kan modifieras för att jämföra beteendet hos olika proteiner under samma spänningsförhållanden. För detta är celler som uttrycker olika proteiner med samma fluorescerande taggen överförs till flera brunnar, såsom fyra kammarrätter (avsnitt 1.3.1). Protokollet kan också appliceras på celler som samuttrycker proteiner med olika markörer, såsom GFP eller RFP. Detta kan vara till exempel användas för att övervaka beteendet hos olika komponenter av protein kvalitetskontroll (PQC) -system. Celler som uttrycker GFP-märkta aggregering markör och olika RFP-märkta PCQ komponenter kan observeras med hjälp av flera brunnarkupade för avbildning. Detta säkerställer samma spänningsförhållanden (hastighet av temperaturökning / minskning, varaktighet temperatur ökning / minskning) och gör det möjligt för jämförande studier.
Dessutom kan protokollet användas för att studera inverkan av PQC systemet på värmestressrespons. Aktiviteten av komponenterna kan moduleras genom att ändra expressionsnivåer med användning av genetiska verktyg såsom knock-out eller överuttryck eller genom användning av kommersiellt tillgängliga specifika inhibitorer 6. Proteasomen kan hämmas genom tillsats av MG132 (100 pM) eller lactacystin (10 ^ M) till tillväxtmediet. Kaperonet Hsp90 kan inhiberas med hjälp av geldanamycin (6 M) eller radicicol (10 M). Kaperonet Hsp70 kan hämmas med VER-155.088, även om vi inte kunde bekräfta effekten av inhiberingen i våra experimentella inställningar hittills. Hämmare bör läggas en dag innan avbildning och cellerna inkuberas under 14 h.
Criti cal steg inom protokollet
Det kritiska steget för bedömning av värmeinducerad störningen är tillståndet av cellerna före avbildningsexperiment. Studier i jäst visade att celler förvärvar resistens mot ett antal olika stressfaktorer i omgivningen under den stationära fasen 13. Vi observerade också minimal känslighet för tillämpad värmestress om D. discoideum celler hade nått stationär fas före avbildning. Därför upprätthåller en konstant celltal <5 x 10 5 celler / ml kritisk.
Dessutom kan höga cellantal inducerar övergång från den vegetativa cykeln D. ideum till utvecklingscykeln, vilket utlöser svält vägar, vilket kan leda till ett annat svar på värmestress. Om höga cellantal uppnås i återhämtningsfasen efter värmestress, streaming och aggregerande celler kan störa dataanalys som cellerna flytta ut ur fokus (se Figur 4).
innehåll "> Begränsning av teknikenFörlusten av fokus är flaskhalsen i protokollet. Under temperaturförändringar, kan fokalplanet skifta dramatiskt, som kräver manuell fokusering under en tidsperiod omedelbart efter byte av temperaturen. Hoppa i fokus kan ibland vara alltför extrema för att övervinnas av programvara autofokus, speciellt om tiden mellan de tidpunkter är hög. Men om den använda Mikroskopet är utrustat med en hårdvaru autofokus, denna flaskhals kan kringgås.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga metoder
I jämförelse med befintliga inställningar såsom användning av luftkonditionerade rum, temperaturreglerade inkubation lådor som omfattar mål och mikroskop scenen eller temperaturreglerade stadier och objektiva kragar, tillhandahåller användningen av en kylkammare en mer noggrann kontroll av den omgivande temperatur. Peltier-elementet i kylkammaren kan upprätthålla en konstant och likformig temperatur hela experimentuppställning. I klassiska uppställningar, kan skillnader lokala temperatur leda till olika observationsresultat. Dessutom kan den reagera snabbt och snabbt till inducerade förändringar i temperatur, medan klassiska uppställningar anpassa sig mycket långsamt till inducerade temperaturförändringar, särskilt sänkning av temperaturen. Peltier-elementet i kylkammaren kan också omfatta ett bredare temperaturområde (15-40 ° C) än klassiska uppställningar, som når temperaturer såsom 15 ° C eller 40 ° C är mycket svårt.
Dictyostelium discoideum är särskilt känslig för fototoxicitet. Tidigare studier använde askorbat som rensare att reducera foto-toxicitet. Men långa avbildningstider kräver ytterligare tillskott. Dessutom är användningen av askorbat begränsad till studier där mekanismen av intresse inte påverkas av antioxidant tillägg. Vi föreslår att temperaturstyrd avbildning kan användas som ett alternativ ca.oach att minimera foto toxicitet och skulle kunna kombineras med tillsats av askorbat för att ytterligare minska toxicitet.
Fototoxiska effekter kan minimeras genom att tillhandahålla en konstant och likformig temperatur av 23 ° C med användning av en kylkammare. Celler avbildas med temperaturkontroll visar färre tecken på fototoxicitet, såsom cell avrundning, för en längre tidsperiod. Detta gör också avbildning med högre intensitet, mindre tidsintervall eller flera synfält (FOVs).
Allmänt Applikation
Värmestress vid högre temperaturer har visat sig utlösa ett annat värmestressrespons 14. Därför kan ökning av temperaturen till 34 ° C eller 37 ° C inducerar ett annat svar. Utöver den pålagda temperaturstress, kan varaktigheten för en viss stressituation modifieras för att studera den omedelbara responsen eller långvarig anpassning till värmestress.
I allmänhet kan de beskrivna protokollexpanderas till en bred uppsättning program. Eftersom exakt temperaturstyrning minskar fototoxiska effekter avsevärt kan protokollet användas i miljöer som kräver höga exponeringstider och / eller högre exciterings Ijusintensiteter, t.ex. för att visualisera proteinerna med en låg uttrycksnivå, eller i kombination med korta tidsintervall mellan avbildning, t ex under time-lapse avbildning. Det kan också vara fördelaktigt för avbildning föremål som spänner över hela cellen, t ex, mikrotubuli, eftersom dessa inställningar kräver ett stort antal optiska z-sektioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
- Bonner, J. T. Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).
- Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium. Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).
- Williams, J. G. Dictyostelium finds new roles to model. Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).
- Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine. European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).
- Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).
- Malinovska, L., Alberti, S. Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem. Prion. 9 (5), 339-346 (2015).
- Schneider, K., Bertolotti, A. Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms. Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).
- Dobson, C. M.
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).
- Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium. Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).
- Herman, P. K.
- Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S.
