Introduction
Dictyostelium discoideum एकान्त मिट्टी के रहने वाले अमीबा कि बैक्टीरिया और अन्य सूक्ष्मजीवों, जो phagocytosis द्वारा लिया जाता है पर भोजन प्राप्त करते हैं। यह एक अद्वितीय और उल्लेखनीय जीवन चक्र है कि इसकी खोज के बाद से 1 अनुसंधान का एक प्रमुख क्षेत्र रहा है है। बहुकोशिकीय विकास 2 और 3 chemotaxis के आणविक आधार के शुरू में ब्याज जल्द ही सेल गतिशीलता, सेल polarity, सहज प्रतिरक्षा पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के द्वारा पूरित था। इसके अलावा, डी discoideum जैव चिकित्सा अनुसंधान 4,5 के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में पेश किया गया था।
हाल ही में, हम डी स्थापित discoideum प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण (PQC) प्रणाली 6.7 अध्ययन करने के लिए एक नई प्रणाली के रूप में। इसके proteome एकत्रीकरण की आशंका प्रिओन की तरह प्रोटीन है, जो प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण 8 के लिए एक चुनौती बन गया है में समृद्ध है। कि क्या जांच करने के लिए डी discoideum इसकी अत्यधिक एजी नियंत्रित करने के लिए विशेष आणविक तंत्र विकसित किया गया हैgregation-प्रवण proteome, हम दोनों सामान्य विकास शर्तों के तहत और तनाव के दौरान एकत्रीकरण की आशंका मार्कर प्रोटीन के व्यवहार का अध्ययन किया। जैसे गर्मी तनाव के रूप में तनाव की स्थिति, प्रोटीन misfolding 9 की दर में वृद्धि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, हम एक ऐसी प्रणाली है, जहां हम तापमान में परिवर्तन के लिए प्रेरित और एक साथ मार्कर प्रोटीन के व्यवहार का पालन कर सकता है की मांग की। इस प्रयोजन के लिए, हम Peltier नियंत्रित हीटिंग एक थर्मल चरण डालने (शीतलन कक्ष) का उपयोग कर के साथ लाइव सेल इमेजिंग संयुक्त। इस विधि हमें एक निरंतर और एक समान तापमान बनाए रखने के साथ-साथ एक तेजी से, अभी तक सटीक तापमान परिवर्तन के लिए प्रेरित करने की अनुमति दी।
लाइव सेल इमेजिंग डी में जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है discoideum। हालांकि, इस दृष्टिकोण के दो प्रमुख सीमाओं चेहरे। सबसे पहले, कोशिकाओं को एक उच्च गतिशीलता प्रदर्शित करने और देखने के क्षेत्र से बाहर की ओर पलायन करते हैं, इस प्रकार व्यक्ति की कोशिकाओं की ट्रैकिंग अक्सर एक बड़े क्षेत्र की इमेजिंग की आवश्यकता है। सेल गतिशीलता कर सकते हैंआगर ओवरले 10 तक कम किया जा सकता है, हालांकि, इन स्थितियों नहीं दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए उपयुक्त व्यवहार्यता में गिरावट के कारण हैं। दूसरा, डी discoideum कोशिकाओं तस्वीर विषाक्तता, जो सेल गोलाई और mitotic गिरफ्तारी के 11 में परिणाम के लिए एक विशेष रूप से उच्च संवेदनशीलता दिखा। पिछले प्रोटोकॉल एक कट्टरपंथी मेहतर और जोखिम बार 12 की कमी के रूप में एस्कॉर्बेट के अलावा द्वारा इस मुद्दे को संबोधित किया। बाद के महत्वपूर्ण यदि ब्याज की प्रोटीन कम स्तर पर व्यक्त की और एक कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत से पता चलता है हो सकता है। लेखकों को भी या तो एक वातानुकूलित कमरे में इमेजिंग द्वारा या तापमान नियंत्रित ऊष्मायन बक्से, जो उद्देश्य और माइक्रोस्कोप चरण 12 को कवर का उपयोग करके 21 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान प्रदान करने के लिए सुझाव देते हैं।
यहाँ, हम एक शीतलन कक्ष 23 डिग्री सेल्सियस पर सेट का उपयोग करके सुधार तापमान नियंत्रण के साथ एक विधि का वर्णन। हमारे सेट-अप इमेजिंग के दौरान काफी तस्वीर विषाक्तता के लिए प्रतिरोध को बढ़ाता है। यहउच्च जोखिम बार और उच्च उत्तेजना प्रकाश तीव्रता के उपयोग की अनुमति देता है। इस के रूप में समय अंतराल ध्यान से imaged पदों की संख्या और जोखिम का इस्तेमाल किया समय के खिलाफ संतुलित करने की आवश्यकता, समय चूक इमेजिंग के दौरान विशेष महत्व का है। संभावना imaged पदों की संख्या बढ़ाने के लिए भी एक व्यापक इमेजिंग क्षेत्र के कवरेज की अनुमति देता है और समय की एक लंबी अवधि में व्यक्ति की कोशिकाओं की ट्रैकिंग की सुविधा।
Protocol
1. सेल तैयार
- बढ़ कोशिकाओं
- डी बढ़ो टिशू कल्चर प्लेट में प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर कुल्हाड़ी माध्यम में discoideum कोशिकाओं। 75% confluency के ऊपर उच्च घनत्व में कोशिकाओं को रखने से बचें।
नोट: एक इष्टतम प्रतिक्रिया तनाव को गर्म करने के लिए, कोशिकाओं तेजी से विकास के चरण में होने की जरूरत है और स्थिर चरण पर पहुंच गया है नहीं करना चाहिए। - दिन इमेजिंग से पहले, कम रोशनी मध्यम (LFM) 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल में विभाजित कोशिकाओं।
नोट: यह कदम कुल्हाड़ी मध्यम की वजह से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करने के लिए आवश्यक है। ऊष्मायन समय 2 घंटा की एक न्यूनतम करने के लिए कम किया जा सकता है। हालांकि, कुल्हाड़ी माध्यम में ले लिया पुटिकाओं अभी भी 2 घंटे के बाद कुछ पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न कर सकते हैं।
- डी बढ़ो टिशू कल्चर प्लेट में प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर कुल्हाड़ी माध्यम में discoideum कोशिकाओं। 75% confluency के ऊपर उच्च घनत्व में कोशिकाओं को रखने से बचें।
- माइक्रोस्कोपी के लिए कक्षों की तैयारी
- इमेजिंग से पहले, LFM में ऊतक थाली से फसल कोशिकाओं और गिलास नीचे बर्तन में कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या हस्तांतरण।
नोट: आमतौर पर,1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल के लिए पर्याप्त है; हालांकि, अगर प्रयोगात्मक स्थापना लंबे इमेजिंग अवधि (8 घंटे से अधिक समय) की आवश्यकता है, ध्यान से सेल नंबर डी के रूप में समायोजित करने की आवश्यकता discoideum कोशिकाओं विकास चक्र के लिए संक्रमण और स्ट्रीम और कुल करने के लिए, जबकि पोषक तत्वों कम कर रहे हैं, तो सेल नंबर उच्च रहे हैं शुरू कर देंगे। - कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें। ध्यान से ताजा माध्यम के साथ प्रयोग किया मध्यम जगह से गैर-बसे कोशिकाओं निकालें।
- इमेजिंग से पहले, LFM में ऊतक थाली से फसल कोशिकाओं और गिलास नीचे बर्तन में कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या हस्तांतरण।
2. इमेजिंग
नोट: प्रोटोकॉल व्यापक क्षेत्र सिस्टम पर और साथ ही confocal माइक्रोस्कोपी setups में इस्तेमाल किया जा सकता है। एक तापमान नियंत्रित ऊष्मायन और बॉक्स उद्देश्यों को कवर खुर्दबीन मंच के उपयोग के लिए उपयोगी है, फिर भी तापमान नियंत्रण के लिए आवश्यक नहीं है। ऊष्मायन बॉक्स का तापमान 40 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रयोग, उदाहरण के लिए में इस्तेमाल सबसे अधिक तापमान पर सेट किया जाता है, अगर गर्मी तनाव किया जाता है। अन्यथा, तापमान 25 के लिए सेट है6, सी। तापमान परिवर्तन के रूप में इमेजिंग के दौरान तापमान में बदलाव के फोकस को प्रभावित कर सकते हैं, इस प्रणाली को अनुकूल करने के लिए अनुमति देने के लिए अग्रिम में किया जाना चाहिए।
नोट: इमेजिंग के दौरान, तापमान एक शीतलन कक्ष का उपयोग कर नियंत्रित किया जाता है। गैर-जोर दिया कोशिकाओं इमेजिंग के लिए डिफ़ॉल्ट तापमान 23 डिग्री सेल्सियस है। गर्मी तनाव की स्थिति के लिए, तापमान वांछित स्तर तक के हिसाब से बढ़ जाती है। शीतलन कक्ष में पीजो तत्व तापमान शिफ्ट करने के लिए बहुत जल्दी जवाब कर सकते हैं। हालांकि, छवियों का ध्यान केंद्रित थोड़ा बदल जाएगा (यह तापमान पारी के आधार पर करने के लिए 20 माइक्रोन तक विचलित कर सकते हैं)। इस प्रकार का मार्गदर्शन refocusing, छवि अधिग्रहण के पहले मिनट के भीतर आवश्यक जब तक इस्तेमाल माइक्रोस्कोप एक हार्डवेयर ऑटो फोकस के साथ सुसज्जित है।
- गैर-जोर दिया की शर्तों के तहत छवि अधिग्रहण
- 23 डिग्री सेल्सियस पर गैर-जोर दिया की शर्तों के तहत छवि कोशिकाओं, देखने के 6 क्षेत्रों (FOVs) की एक न्यूनतम प्राप्त।
नोट: गैर तनाव हालत visualiz हो सकता हैएड प्रतिनिधि पोस्टरों की एक छोटी समय चूक (5-30 मिनट) या अधिग्रहण की रिकॉर्डिंग के द्वारा या तो। हर हालत या सेल लाइन के लिए देखने के 6 क्षेत्रों (FOVs) की एक न्यूनतम प्राप्त।
नोट: इस मामले में व्यक्ति की कोशिकाओं ब्याज की हैं, FOV के बीच में संबंधित कोशिकाओं की स्थिति और बीच में ब्याज की कोशिकाओं से युक्त FOV के साथ एक 3 एक्स 3 टाइल श्रृंखला रिकॉर्ड डी। discoideum कोशिकाओं गतिशील होते हैं और FOV से बाहर की ओर पलायन हो सकता है। हालांकि, 3 एक्स 3 टाइल श्रृंखला क्षेत्र संभावित ब्याज की सेल द्वारा पता लगाया बढ़ जाती है और यह ~ 6 घंटा के समय चूक अवधि के लिए मिल बनी हुई है। - 1-0.25 माइक्रोन चरणों में अधिकतम 7 माइक्रोन के z- ढेर मोल सेल की पूरी मात्रा पर कब्जा करने के लिए।
- एक संदर्भ उज्ज्वल क्षेत्र छवि मोल कोशिकाओं की कुल संख्या का आकलन करने के लिए।
- 23 डिग्री सेल्सियस पर गैर-जोर दिया की शर्तों के तहत छवि कोशिकाओं, देखने के 6 क्षेत्रों (FOVs) की एक न्यूनतम प्राप्त।
- गर्मी तनाव के लिए छवि अधिग्रहण
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार 30 डिग्री सेल्सियस के लिए शीतलन कक्ष के तापमान को समायोजित। </ Li>
- तापमान प्रदर्शन के बाद वांछित मूल्य तक पहुँच गया है, उज्ज्वल क्षेत्र चैनल में मैन्युअल refocus और समय चूक शुरू करने से पहले सभी रिकॉर्ड FOVs की जाँच करें।
- समय बिंदुओं के बीच 5-10 मिनट का समय अंतराल के साथ गर्मी तनाव के 4 घंटे के लिए एक समय चूक की शुरुआत करें। सही समय पहले दो अंक के अधिग्रहण के दौरान ध्यान केंद्रित के लिए जाँच करें।
- वसूली के दौरान छवि अधिग्रहण
- गर्मी तनाव के बाद, वापस 23 डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम करने को समायोजित करने और मैन्युअल refocus करने के लिए तापमान प्रदर्शन के लिए प्रतीक्षा करें।
- 10-20 मिनट समय के अंतराल में 8-10 घंटे के लिए वसूली चरण में रिकार्ड समय चूक फिल्मों। सही पहली बार बिंदु के अधिग्रहण के दौरान ध्यान केंद्रित के लिए जाँच करें।
3. छवि विश्लेषण
नोट: साइटोसोलिक foci शरण कोशिकाओं की संख्या यों, कोशिकाओं की कुल संख्या और हर बार में साइटोसोलिक foci के साथ कोशिकाओं की संख्या का आकलनफ्रेम। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों से कोशिकाओं विभाजन की कठिनाई के कारण, मात्रा का ठहराव मैन्युअल रूप से किया जाना चाहिए। बाद में, डेटा विश्लेषण मुक्त छवि प्रसंस्करण पैकेज ((http://fiji.sc/Fiji)। यह प्लगइन "सेल काउंटर" (http://fiji.sc/Cell_Counter) की आवश्यकता के लिए वर्णित है।
- कोशिकाओं की कुल संख्या का आकलन
- "फाइल" और "ओपन" पर क्लिक करके उज्ज्वल क्षेत्र छवि ढेर (XYT) लोड।
- "सेल काउंटर" प्लगइन (- "सेल काउंटर" "प्लगइन्स") खोलें। "प्रारंभ" पर क्लिक करके छवि ढेर लोड।
- उचित बॉक्स बजाते द्वारा काउंटरों की उचित प्रकार चुनें।
नोट: कोशिकाओं की कुल संख्या और साइटोसोलिक foci के साथ कोशिकाओं के लिए काउंटर के रूप में टाइप 2 के लिए काउंटर के रूप में उपयोग प्रकार 1। सभी कोशिकाओं की गणना। - "सहेजें मार्करों" पर क्लिक करके मार्कर को बचाओ।
- साइटोसोलिक foci के साथ कोशिकाओं की संख्या का आकलन
- <li> प्रतिदीप्ति छवि hyperstack (XZYT) ( "फाइल" - "ओपन") लोड और "Z-प्रोजेक्टर" (छवि / ढेर) का उपयोग कर एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण बनाते हैं।
- "सेल काउंटर" प्लगइन खोलें। "प्रारंभ" पर क्लिक करके परिणामस्वरूप छवि ढेर (XYT) लोड।
- "लोड मार्करों" पर क्लिक करके मार्कर लोड।
चेतावनी: संदर्भ छवि और प्रतिदीप्ति ढेर के फ़ाइल नाम समान होना चाहिए। यदि आवश्यक हो, छवि ढेर आरंभ करने के पहले तदनुसार नाम बदलें। - उचित मार्कर प्रकार (3.1.3 देखें) चुनें और साइटोसोलिक foci के साथ कोशिकाओं की गिनती। मौजूदा मार्कर व्यक्ति की कोशिकाओं के पद के लिए मार्गदर्शन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
- "परिणाम" पर क्लिक करके टुकड़ा प्रति गिनती की संख्या प्राप्त करें और आगे की गणना के लिए कहीं मायने रखता बचाने के लिए।
Representative Results
वर्णित इमेजिंग प्रोटोकॉल अमीबा डी में एकत्रीकरण की आशंका प्रिओन-जैसे प्रोटीन के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता गर्मी तनाव के दौरान discoideum। चित्रा 1 से 30 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 बी) और तनाव वसूली के बाद 6 घंटे और सामान्य विकास की स्थिति (चित्रा 1 ए) के तहत कोशिकाओं में GFP टैग पॉलीग्लुटामाइन प्रोटीन Q103 का वितरण, गर्मी तनाव के 2 घंटे के बाद पता चलता है सामान्य विकास की स्थिति (चित्रा 1 सी) में वृद्धि हुई है। 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 23 डिग्री सेल्सियस से तापमान में वृद्धि करने पर, Q103-GFP मार्कर संरचनाओं कबरा एक फैलाना वितरण से coalesces। तनाव जारी है और सामान्य तापमान पर विकास करने पर, इन संरचनाओं भंग। Q103-GFP के पुनर्वितरण और गर्मी तनाव प्रेरित साइटोसोलिक foci के गठन की छवि विश्लेषण का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। चित्रा 2A व्यक्ति फिजी और प्लगइन "सी का उपयोग FOVs के विश्लेषण से पता चलता हैपक्ष काउंटर "। चित्रा 2 बी गर्मी तनाव की प्रतिक्रिया की मात्रा का ठहराव से पता चलता है। इससे पता चलता है कि सतत गर्मी तनाव के साथ संख्या में साइटोसोलिक Q103-GFP foci वृद्धि हुई है। गर्मी के दौरान तनाव, प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण (PQC) प्रणाली अभिभूत है, इस प्रकार aggregation- है ऐसे प्रिओन की तरह प्रोटीन Q103 के रूप में होने का खतरा प्रोटीन नहीं के रूप में चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, साइटोसोलिक foci में एक घुलनशील अवस्था में बनाए रखा जा सकता है और तेजी से समग्र। कोशिकाओं को भी एक विशेषता गोलाई दिखा। तनाव को हटाने के बाद साइटोसोलिक foci की कमी पता चलता है कि एकत्रित प्रोटीन भंग कर रहे हैं।
इमेजिंग गुणवत्ता प्रारंभिक सेल घनत्व के प्रति संवेदनशील है। चित्रा 3 तनाव वसूली के बाद कोशिकाओं का एक उदाहरण से पता चलता है, उचित प्रारंभिक सेल घनत्व (चित्रा 3 ए) और उच्च प्रारंभिक सेल घनत्व (चित्रा 3 बी) की तुलना। अगर प्रारंभिक सेल घनत्व बहुत अधिक थी, कोशिकाओं स्टारके रूप में चित्रा 3 बी में चित्रित टेड धाराओं के रूप में। यह जो कोशिकाओं के रूप में बाद में मात्रा का ठहराव पर कठिनाइयों लगाता फोकल हवाई जहाज़ से बाहर चले गए हैं।
वर्णित विधि के रूप में ऊपर वर्णित तापमान प्रेरित परिवर्तन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी, जब शारीरिक विकास तापमान में इमेजिंग तस्वीर विषाक्तता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 4 एक वातानुकूलित कमरे में तापमान नियंत्रण के बिना imaged एक शीतलन कक्ष (चित्रा 4 ए) में 23 डिग्री सेल्सियस पर imaged सेल और कोशिकाओं की तुलना से पता चलता सेट 25 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4 बी) के लिए। उत्तेजना प्रकाश के लिए लगातार जोखिम पर, कोशिकाओं दौर में जब तापमान नियंत्रित परिस्थितियों में imaged नहीं। सेल आकार में यह परिवर्तन तनाव का संकेत है।
आकृति 1:
चित्रा 2: गर्मी प्रेरित साइटोसोलिक foci गठन की मात्रा (ए) मुक्त छवि प्रसंस्करण पैकेज फिजी और प्लगइन "सेल काउंटर" का उपयोग कोशिकाओं का विश्लेषण।। कोशिकाओं की कुल राशि (टाइप 1, नीले काउंटर मार्कर) उज्ज्वल क्षेत्र छवि में चुना गया है। मार्कर GFP चैनल और साइटोसोलिक foci के साथ कोशिकाओं (टाइप 2, लाल काउंटर मार्कर) निर्धारित किया जाता है की संख्या में लोड कर रहे हैं। (बी) के foci की मात्रा 30 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी तनाव के 3 घंटा और 23 डिग्री सेल्सियस पर तनाव वसूली के 3 घंटे के बाद। (एन = दृश्य, त्रुटि बार = एसडी के 4 क्षेत्रों) कृपया यहाँ क्लिक करें इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए चित्रा।
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चित्रा 4:। Phototoxic प्रभाव पर तापमान नियंत्रण के प्रभाव (ए) प्रकोष्ठों 23 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर नियंत्रण के साथ 10 मिनट के लिए imaged: देखें, जेड ढेर (रिक्ति 0.5 सुक्ष्ममापी, नमूना मोटाई 8 माइक्रोन) के, समय चूक के 6 क्षेत्रों (कुल समय 10 मिनट, चूक 1 मिनट), GFP चैनल (0.07 मिसे जोखिम समय, 10% लेजर तीव्रता), आरएफपी चैनल (0.1 मिसे जोखिम समय, 10% लेजर तीव्रता)। प्रकोष्ठों phototoxic तनाव से जुड़े विशेषता रूपात्मक बदलाव के कोई संकेत नहीं दिखा। (बी) कोशिकाओं (ए के रूप में ही की स्थिति) तापमान नियंत्रण के बिना 10 मिनट के लिए imaged। प्रकोष्ठों phototoxic प्रेरित गोलाई के संकेत दिखा रहे हैं, तनाव का संकेत है। स्केल बार 10 माइक्रोन =। कोशिकाओं को एक प्रणाली एक 100x / 1.4 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य के साथ एक खुर्दबीन के आधार पर imaged थे। छवियों 1024 x 1024 पिक्सेल 1 एक्स 1 binning का उपयोग फ़ाइलों के रूप में एक सीसीडी कैमरा के साथ एकत्र किए गए थे।4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल गर्मी प्रेरित तनाव के जवाब में ब्याज की एक विशेष प्रोटीन के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान में वृद्धि गर्मी तनाव की प्रतिक्रिया को गति प्रदान करने के लिए और सूचित किया गया है डी की व्यवहार्यता इन परिस्थितियों discoideum स्पष्ट रूप से कम है।
संशोधनों
प्रोटोकॉल एक ही तनाव की स्थिति के तहत विभिन्न प्रोटीन के व्यवहार की तुलना करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस के लिए, एक ही फ्लोरोसेंट टैग के साथ अलग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं में इस तरह के चार कक्ष व्यंजन (धारा 1.3.1) के रूप में, बहु अच्छी तरह से बर्तन में स्थानांतरित कर रहे हैं। प्रोटोकॉल भी सह व्यक्त जैसे GFP या आरएफपी के रूप में अलग मार्कर, साथ प्रोटीन कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है। इस प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण (PQC) प्रणाली के विभिन्न घटकों के व्यवहार पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया, उदाहरण के लिए हो सकता है। GFP टैग एकत्रीकरण मार्कर और अलग आरएफपी टैग PCQ घटकों व्यक्त कोशिकाओं बहु अच्छी तरह से उपयोग करते हुए देखा जा सकता हैइमेजिंग के लिए dished। यह एक ही तनाव की स्थिति (तापमान वृद्धि / कमी, तापमान में वृद्धि / कमी की अवधि की गति) सुनिश्चित करता है और तुलनात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है।
इसके अलावा, प्रोटोकॉल गर्मी तनाव की प्रतिक्रिया पर PQC प्रणाली के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। घटकों की गतिविधियों को इस तरह के नाक आउट या overexpression के रूप में आनुवंशिक उपकरण का उपयोग कर अभिव्यक्ति के स्तर बदलकर या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विशिष्ट अवरोधकों 6 का उपयोग करके संग्राहक जा सकता है। एंटीबॉडी मध्यम विकास के लिए MG132 (100 माइक्रोन) के या lactacystin (10 माइक्रोन) के जोड़ने से हिचकते जा सकता है। निगरानी HSP90 geldanamycin (6 माइक्रोन) या radicicol (10 माइक्रोन) का उपयोग कर हिचकते जा सकता है। निगरानी Hsp70, देखें-155088 के साथ हिचकते जा सकता है, हालांकि हम अब तक हमारे प्रयोगात्मक सेटिंग्स में अवरोध की प्रभावकारिता पुष्टि नहीं कर सका। Inhibitors इमेजिंग से पहले एक दिन में जोड़ा जाना चाहिए और कोशिकाओं 14 घंटे के लिए incubated हैं।
Criti प्रोटोकॉल के भीतर कैलोरी कदम
गर्मी प्रेरित गड़बड़ी के आकलन के लिए महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं इमेजिंग प्रयोग करने से पहले की स्थिति है। खमीर में अध्ययन से पता चला कोशिकाओं स्थिर चरण 13 के दौरान पर्यावरण तनाव की एक किस्म के लिए प्रतिरोध हासिल है। हम यह भी लागू गर्मी तनाव यदि डी करने के लिए कम से कम जवाबदेही मनाया discoideum कोशिकाओं इमेजिंग के लिए पहले स्थिर चरण में पहुंच गया था। इसलिए, एक निरंतर सेल नंबर को बनाए रखने <5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल महत्वपूर्ण है।
इसके अलावा, उच्च सेल नंबर डी की वनस्पति चक्र से संक्रमण पैदा कर सकते हैं विकास चक्र को discoideum, इस प्रकार भुखमरी रास्ते, जो एक अलग प्रतिक्रिया को जन्म दे सकता है तनाव गर्म करने के लिए ट्रिगर। उच्च सेल नंबर गर्मी तनाव, स्ट्रीमिंग के बाद वसूली चरण में पहुँच रहे हैं और कुल कोशिकाओं डेटा विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में कोशिकाओं ध्यान से बाहर ले जाते हैं (चित्रा 4 देखें)।
सामग्री "> तकनीक की सीमाध्यान की हानि प्रोटोकॉल की टोंटी है। तापमान परिवर्तन के दौरान, फोकल हवाई जहाज़ में काफी बदलाव कर सकते हैं, जो तुरंत तापमान बदलने के बाद एक समय अवधि में मैनुअल refocusing की आवश्यकता है। ध्यान में कूद कभी कभी भी चरम सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस द्वारा दूर किया जा करने के लिए हो सकता है, समय बिंदुओं के बीच के समय में उच्च है, खासकर अगर। हालांकि, अगर इस्तेमाल माइक्रोस्कोप एक हार्डवेयर ऑटोफोकस के साथ सुसज्जित है, इस अड़चन धोखा दिया जा सकता है।
मौजूदा तरीकों के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व
इस तरह वातानुकूलित कमरे, तापमान नियंत्रित ऊष्मायन के उद्देश्यों और खुर्दबीन मंच या तापमान नियंत्रित चरणों और उद्देश्य कॉलर को कवर बक्से के उपयोग के रूप में मौजूदा setups के साथ तुलना में, एक शीतलन कक्ष के उपयोग के परिवेश का एक और अधिक सटीक नियंत्रण प्रदान करता है तापमान। शीतलन कक्ष में Peltier-तत्व एक निरंतर और एक समान मंदिर बनाए रख सकते हैंप्रयोगात्मक सेटअप भर perature। शास्त्रीय setups में, स्थानीय तापमान मतभेद अलग अवलोकन परिणामों को जन्म दे सकता है। इसके अलावा, यह जल्दी और तेजी से तापमान में परिवर्तन के लिए प्रेरित जवाब कर सकते हैं, जबकि शास्त्रीय setups प्रेरित तापमान में परिवर्तन करने के लिए बहुत धीरे-धीरे अनुकूल है, विशेष रूप से तापमान को कम। शीतलन कक्ष में Peltier तत्व भी एक व्यापक तापमान रेंज (15-40 डिग्री सेल्सियस) शास्त्रीय setups से है, जिसके साथ इस तरह के 15 डिग्री सेल्सियस या 40 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया के रूप में तापमान बहुत मुश्किल है कवर कर सकते हैं।
Dictyostelium discoideum विशेष रूप से फोटो विषाक्तता के प्रति संवेदनशील है। पिछले अध्ययनों मेहतर के रूप में इस्तेमाल किया एस्कॉर्बेट तस्वीर विषाक्तता को कम करने के लिए। हालांकि, लंबी अवधि इमेजिंग अतिरिक्त पूरकता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एस्कॉर्बेट के उपयोग के अध्ययन जहां ब्याज की व्यवस्था एंटीऑक्सीडेंट पूरक से प्रभावित नहीं है तक सीमित है। हम जानते हैं कि तापमान नियंत्रित इमेजिंग के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता appr का प्रस्तावoach तस्वीर विषाक्तता को कम करने के लिए और आगे की विषाक्तता को कम करने के एस्कॉर्बेट के अलावा के साथ जोड़ा जा सकता है।
Phototoxic प्रभाव एक शीतलन कक्ष का उपयोग कर 23 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर और एक समान तापमान प्रदान करके कम से कम किया जा सकता है। तापमान नियंत्रण का उपयोग कर imaged कोशिकाओं तस्वीर विषाक्तता, इस तरह के सेल गोलाई के कम लक्षण, एक लंबे समय अवधि के लिए दिखा। यह भी उच्च तीव्रता, छोटे समय के अंतराल या दृश्य (FOVs) के और अधिक क्षेत्रों के साथ इमेजिंग की अनुमति देता है।
सामान्य उपयोग
उच्च तापमान पर गर्मी तनाव एक अलग गर्मी तनाव की प्रतिक्रिया 14 को गति प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, 34 डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान में वृद्धि के लिए एक अलग प्रतिक्रिया उत्पन्न हो सकता है। लागू किया तापमान तनाव के अलावा, एक विशेष तनाव की स्थिति की अवधि तत्काल प्रतिक्रिया या लंबी अवधि के अनुकूलन तनाव गर्म करने के लिए अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
सामान्य तौर पर, वर्णित प्रोटोकॉल हो सकता हैआवेदनों की एक विस्तृत सेट करने के लिए विस्तार किया। क्योंकि सटीक तापमान नियंत्रण काफी तस्वीर विषैले प्रभाव को कम करता है, प्रोटोकॉल, या कम समय के अंतराल के साथ संयोजन में सेटिंग्स जो उच्च जोखिम बार और / या उच्च उत्तेजना प्रकाश तीव्रता, जैसे, एक कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ प्रोटीन की आवश्यकता होती है visualizing के लिए इस्तेमाल किया जा सकता इमेजिंग, जैसे, समय चूक इमेजिंग के दौरान बीच। यह भी इमेजिंग पूरे सेल फैले वस्तुओं के लिए फायदेमंद हो सकता है, जैसे, सूक्ष्मनलिकाएं, इन सेटिंग्स ऑप्टिकल जेड वर्गों के एक उच्च संख्या की आवश्यकता के रूप में।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
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