Introduction
Dictyostelium discoideum являются одиночными почва живой амебы , которые питаются бактериями и другими микроорганизмами, которые захватываются фагоцитоза. Он имеет уникальный и замечательный жизненный цикл , который был одним из главных направлений исследований с момента его открытия 1. Ранний интерес к многоклеточного развития 2 и молекулярных основ хемотаксиса 3 вскоре была дополнена исследованиями с акцентом на подвижность клеток, клеточной полярности, врожденного иммунитета. Кроме того, Д. discoideum был введен в качестве модельной системы для биомедицинских исследований 4,5.
Недавно мы установили D. discoideum как новая система для изучения контроля качества белка (PQC) системы 6,7. Его протеом обогащен агрегации подверженных прионными-подобных белков, что создает проблему для контроля качества 8 белков. Для того, чтобы исследовать вопрос о том D. discoideum разработала специальные молекулярные механизмы для контроля его высоко AGкупности подверженных протеом, мы изучили поведение агрегации подверженных маркерных белков как при нормальных условиях роста и во время стресса. Стрессовые условия, такие как тепловой стресс, можно использовать для увеличения скорости белка неправильного сворачивания 9. Таким образом, мы стремились создать систему, где мы могли бы привести к изменениям температуры и одновременно следить за поведением белков-маркеров. Для этой цели мы объединили живых клеток с Пельтье-контролируемым нагревом с использованием стадии вставки теплового (камеру охлаждения). Этот метод позволил нам поддерживать постоянную и равномерную температуру, а также, чтобы вызвать быстрое, но точное изменение температуры.
Живых клеток используется для изучения различных биологических процессов в D. discoideum. Тем не менее, этот подход сталкивается с двумя основными ограничениями. Во-первых, клетки демонстрируют высокую подвижность и имеют тенденцию мигрировать из поля зрения, таким образом, отслеживание отдельных клеток часто требует получения изображения на большой площади. Подвижность клеток можетбыть уменьшена агара 10, однако, эти условия не подходят для длительного обработки изображений из - за снижения жизнеспособности. Во- вторых, D. discoideum клетки показывают особенно высокую чувствительность к фото-токсичность, что приводит к клеточной закруглением и митоза 11. Предыдущие протоколы рассмотрел этот вопрос путем добавления аскорбата в качестве поглотителя радикалов и сокращение времени воздействия 12. Последнее может иметь решающее значение, если интересующий белок экспрессируется на низких уровнях, и показывает слабый сигнал флуоресценции. Кроме того, авторы предполагают , чтобы обеспечить постоянную температуру 21 ° С либо визуализации в кондиционируемом помещении или с помощью контролируемой температурой инкубации коробки, которые покрывают объективный и микроскопа этап 12.
Здесь мы опишем метод с улучшенным контролем температуры с помощью охлаждающей камеры, установленный при температуре 23 ° C. Во время визуализации нашего настройку значительно повышает устойчивость к фото-токсичности. Этопозволяет использовать более высокие времени экспозиции и высокой интенсивности света возбуждения. Это имеет особое значение при покадровой обработки изображений, так как временные интервалы должны быть тщательно сбалансированы с числом позиций и отображенных Время экспозиции. Возможность увеличения числа отображенных позиций также позволяет охвата более широкой области обработки изображений и облегчает отслеживание отдельных клеток в течение более длительного периода времени.
Protocol
1. Подготовка сотового
- Растущие клетки
- Grow D. Клетки discoideum в среде AX при 23 ° С в атмосфере света в тканевых культуральных планшетах. Не допускайте, чтобы клетки при высоких плотностях выше 75% сплошности.
Примечание: Для получения оптимального ответа для теплового стресса, клетки должны быть в экспоненциальной фазе роста и не должны достигли стационарной фазы. - За день до обработки изображений, разбить ячейку на низкой среде флуоресценции (ЛЧМ) до 1 × 10 4 клеток / мл.
Примечание: Этот шаг необходим для снижения фоновой флуоресценции, вызванной AX средой. Время инкубации может быть уменьшено до минимума 2 часов. Тем не менее, везикулы, принятые в среде AX все еще может генерировать некоторый фоновый сигнал через 2 ч.
- Grow D. Клетки discoideum в среде AX при 23 ° С в атмосфере света в тканевых культуральных планшетах. Не допускайте, чтобы клетки при высоких плотностях выше 75% сплошности.
- Подготовка клетки для микроскопии
- Перед изображениями, урожай клеток из ткани пластины в МЛС и передать достаточное количество клеток в стеклянным дном посуды.
Примечание: Как правило,1 х 10 5 клеток / мл достаточно; Тем не менее, если экспериментальная установка требует длительных периодов обработки изображений (более 8 ч), число клеток необходимо тщательно регулировать, как и D. discoideum клетки будут переходить в цикле развития и начинают течь и заполнитель , если количество клеток высоки в то время как питательные вещества являются низкими. - Разрешить клетки урегулировать в течение 20 мин. Удаления не осажденные клетки путем тщательного замены использованной среды свежей средой.
- Перед изображениями, урожай клеток из ткани пластины в МЛС и передать достаточное количество клеток в стеклянным дном посуды.
2. обработки изображений
Примечание: Протокол может быть использован в системах, широко местах, а также в установках конфокальной микроскопии. Использование в инкубационный коробки с регулируемой температурой, охватывающей цели и столик микроскопа является полезным, но не является существенным для контроля температуры. Температура коробки инкубации установлена на самой высокой температуры , используемой в эксперименте, например, до 40 ° C , если выполняется тепловой стресс. В противном случае, температура установлена на 256; С. Изменения температуры должны быть сделаны заранее, чтобы позволить системе адаптироваться, так как изменения температуры во время формирования изображения может влиять на фокус.
Примечание: во время формирования изображения, температуру регулируют с помощью охлаждающей камеры. Температура по умолчанию для работы с изображениями не-подчеркнул клетки составляет 23 ° C. Для условий теплового стресса, температура соответственно увеличивается до желаемого уровня. Пьезоэлектрический элемент в холодильной камере может очень быстро реагировать на смену температуры. Тем не менее, в центре внимания изображение немного изменится (она может отклоняться до 20 мкм в зависимости от температурного сдвига). Таким образом, руководство рефокусировка требуется в течение первых минут захвата изображения, если используется микроскоп не оснащен аппаратным автофокусом.
- Получение изображений , не связанных с стрессовых условиях
- Клетки изображения при нерастягивающих затруднительных условиях при 23 ° С, получают как минимум 6 полей зрения (ПЗ).
ПРИМЕЧАНИЕ: состояние Non-стресс может быть visualizе изд либо путем записи короткого промежутка времени покадровой (5-30 мин) или приобретение представительных кадры. Для каждого состояния или клеточной линии приобретают минимум 6 полей зрения (ПЗ).
Примечание: В случае , если отдельные клетки представляют интерес, расположить соответствующие ячейки в середине поля зрения и записать плитки серии 3 х 3 с FOV , содержащей клетки , представляющие интерес в середине D.. discoideum клетки подвижны и могли мигрировать из FOV. Тем не менее, плитка серии 3 х 3 увеличивает площадь потенциально исследованная клеток, представляющих интерес, и она остается отслеживаться для покадровой периодов ~ 6 ч. - Приобретать Z-стеки максимально 7 мкм с шагом 1-0.25 мкм, чтобы захватить весь объем клетки.
- Получить ссылку на изображение в светлом поле, чтобы оценить общее количество клеток.
- Клетки изображения при нерастягивающих затруднительных условиях при 23 ° С, получают как минимум 6 полей зрения (ПЗ).
- Получение изображений для теплового стресса
- Отрегулируйте температуру холодильной камеры до 30 ° C в соответствии с инструкциями изготовителя. </ Li>
- После того, как индикатор температуры достигнет требуемого значения, переориентировать вручную в канале ярком поле и проверить все записанные перед началом ПЗ во времени покадровой.
- Начало Покадровой в течение 4 ч тепловой нагрузки с временным интервалом 5-10 мин между моментами времени. Проверьте правильность фокусировки при приобретении первых двух временных точках.
- Получение изображений во время восстановления
- После теплового стресса, уменьшить температуру обратно 23 ° C, дождитесь индикации температуры, чтобы настроить и переориентировать вручную.
- Запись время покадровой фильмы в фазе восстановления в течение 8-10 ч в 10-20 мин интервалы времени. Проверьте правильность фокусировки во время приобретения первого момента времени.
Анализ 3. Изображение
Примечание: Для того, чтобы определить число клеток, несущих цитозольного фокусы, оценить общее количество клеток и количество клеток с цитозольной очагов в каждый момент времениРамка. Из-за сложности сегментирования клеток из ярких полевых изображений, Количественное должно быть сделано вручную. В последующем анализе данных описан для свободного пакета для обработки изображений ((http://fiji.sc/Fiji). Для этого требуется плагин "Счетчик клеток" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
- Оценка общего количества клеток
- Загрузите яркий стек поля изображения (XYT), нажав кнопку "Файл" и "Открыть".
- Откройте "Счетчик клеток" плагин ( "Плагины" - "Счетчик клеток"). Загрузите стопку изображения, нажав кнопку "Initialize".
- Выберите подходящий тип счетчиков, отметив соответствующий флажок.
Примечание: используйте тип 1 для счетчика общего количества клеток и 2-го типа, как счетчик для клеток с цитозольного фокусов. Подсчет всех клеток. - Сохраните маркеры, нажав кнопку "Сохранить маркеры".
- Оценивая число клеток с цитозольного очагов
- <li> Загрузите HyperStack флуоресцентного изображения (XZYT) ( "Файл" - "Открыть") и сделать максимальную проекцию интенсивности с помощью "Z-проектора" (Image / Стеки).
- Откройте "Счетчик клеток" плагин. Загрузите результирующий стек изображения (XYT), нажав кнопку "Initialize".
- Загрузите маркеры, нажав кнопку "Load" Маркеры.
ВНИМАНИЕ: Имена файлов эталонного изображения и стека флуоресценции должны быть идентичны. При необходимости переименовать соответственно перед инициализацией стека изображений. - Выберите подходящий тип маркера (см 3.1.3) и подсчет клеток с цитозольного фокусов. Существующие маркеры могут быть использованы в качестве руководства для положения отдельных ячеек.
- Получить количество отсчетов на срезе, нажав на "Результаты" и сохраните подсчеты в другом месте для дальнейших расчетов.
Representative Results
Описанный протокол формирования изображения может быть использован для анализа поведения агрегации подверженных прион-подобных белков в амеба D. discoideum во время теплового стресса. На рисунке 1 показано распределение GFP-меченый полиглутаминового белка Q103 в клетках при нормальных условиях роста (рис 1А), после 2 -х часов теплового стресса при температуре 30 ° C (рис 1B) и после 6 часов восстановления напряжения и рост в нормальных условиях роста (рис 1C). При повышении температуры от 23 ° С до 30 ° С, Q103-GFP маркер коалесцирует от диффузного распределения в пунктированная структур. После снятия напряжения и роста при нормальной температуре, эти структуры растворяются. Перераспределение Q103-GFP и образование тепловой стресс-индуцированной цитозольного очагов может быть определена количественно с помощью анализа изображений. На рисунке 2А представлен анализ отдельных Фиджи с использованием ПЗ и плагин "CELL счетчик ". Рисунок 2B показывает количественную оценку ответа теплового стресса. Это показывает , что цитозольная Q103-GFP увеличение числа очагов с постоянной тепловой нагрузки. Во время теплового стресса, контроль качества белка система (PQC) перегружен, таким образом , aggregation- склонные белки , такие как прион-подобный белок Q103 не может поддерживаться в растворимом состоянии и все более агрегированный в цитозоле фокусах. клетки также показывают характерное закругление, как показано на фигуре 1В. уменьшение цитозольного очагов после снятия стресса предполагает , что агрегированный белки растворяются.
Качество изображения является чувствительным к исходной плотности клеток. На рисунке 3 показан пример клеток после восстановления напряжения, сравнивая соответствующую исходной плотности клеток (фиг.3А) и высокую начальную плотность клеток (фигура 3В). Если начальная плотность клеток была слишком высока, клетки звездыTed для формирования потоков , как показано на рисунке 3b. Это что накладывает трудности на последующей количественной оценке, так как клетки переместились из фокальной плоскости.
Описанный способ может быть использован для мониторинга изменений температуры, вызванной, как описано выше. Он также может быть использован для уменьшения фото-токсичность при визуализации при физиологической температуре роста. На рисунке 4 показано сравнение ячейки изображаемого при 23 ° С в охлаждающую камеру (фиг.4А) и клетки изображенную без контроля температуры в комнате с кондиционером, установлен до 25 & deg ; с (фиг.4В). При постоянном воздействии света возбуждения, клетки округлить когда не получено при контролируемой температуре условиях. Это изменение формы клеток указывает на стресс.
Рисунок 1:
Рисунок 2: Количественная формирования цитозольного очагов тепла индуцированных (А) Анализ клеток с использованием свободного обработки изображений пакет Фиджи и плагин "Счетчик клеток".. Общее количество клеток (тип 1, синие маркеры счетчик) определяется в светлом поле изображения. Маркеры загружаются в GFP-канала и число клеток с цитозольной фокусов (тип 2, красные маркеры встречные) определяется. (B) Количественная очагов после 3 ч тепловой нагрузки при 30 ° C и 3 часа восстановления напряжения при 23 ° С (п = 4 поля зрения, ошибка бар = SD). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого цифра.
.jpg "/>
Рисунок 4:. Влияние температурного контроля на фототоксические эффекты (А) Клетки отображены в течение 10 мин с регулированием температуры при 23 ° C: 6 полей зрения, Z-стек (расстояние 0,5 мкм, толщина образца 8 мкМ), промежутка времени (общее время 10 мин, покадровой 1 мин), GFP канала (0,07 мс время экспозиции, 10% интенсивности лазерного излучения), RFP канала (0,1 мс время экспозиции, 10% интенсивности лазерного излучения). Клетки не проявляют никаких признаков характерных морфологических изменений, связанных с фототоксического стрессом. (B) Клетки отображены в течение 10 мин без контроля температуры ( таких же условиях , как и в A). Клетки проявляют признаки фототоксического индуцированных закругления, что указывает на стресс. Шкала бар = 10 мкм. Клетки были обследованы на системе, основанной на микроскопе с объективом 100х / 1,4 числовая апертура (NA). Изображения были собраны с помощью ПЗС-камеры в качестве 1,024 х 1,024 пикселей файлов с использованием 1 х 1 биннинга.4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Протокол, описанный здесь, может быть использован для изучения поведения конкретного интересующего белка в ответ на тепло индуцированной стрессом. Повышение температуры до 30 ° C, как сообщается , чтобы вызвать реакцию теплового стресса и в этих условиях жизнеспособность D. discoideum заметно снижается.
изменения
Протокол может быть изменен, чтобы сравнить поведение различных белков при тех же самых условиях стресса. Для этого, клетки, экспрессирующие различные белки с той же флуоресцентной метки передаются в многолуночных блюда, такие как четыре камерных блюда (раздел 1.3.1). Протокол также может быть применен на клетках коэкспрессирующей белки с различными маркерами, такими как GFP или RFP. Это может быть, например, использоваться для наблюдения за поведением различных компонентов системы контроля качества белка (PQC). Клетки, экспрессирующие GFP-меченый агрегации маркер и различные RFP меченных компоненты PCQ можно наблюдать с помощью многоскважинныхвогнутое для работы с изображениями. Это обеспечивает те же стрессовые условия (скорость повышения температуры / снижения, длительности температурного увеличения / уменьшения) и позволяет для сравнительных исследований.
Кроме того, протокол может быть использован для изучения влияния системы PQC на реакцию теплового стресса. Активность компонентов можно модулировать путем изменения уровней экспрессии с использованием генетических инструментов , таких как нокаута или избыточной экспрессии или с использованием коммерчески доступных специфических ингибиторов 6. Протеасома может быть подавлено добавлением MG132 (100 мкМ) или lactacystin (10 мкМ) в ростовую среду. Шаперона Hsp90, может быть подавлено с помощью гельданамицина (6 мкМ) или Радикикол (10 мкМ). Шаперонная Hsp70 может быть подавлена с Ver-155088, хотя мы не смогли подтвердить эффективность торможения в наших экспериментальных условиях до сих пор. Ингибиторы должны быть добавлены за один день до обработки изображений, и клетки инкубируют в течение 14 ч.
Criti ческие шаги в рамках Протокола
Важным шагом для оценки теплового индуцированного возмущения состояние клеток перед экспериментом визуализации. Исследования в дрожжах показали , что клетки приобретают устойчивость к различным экологическим стрессам во время стационарной фазы 13. Мы также наблюдали минимальную чувствительность к применяемой тепловой стресс , если D. discoideum клетки достигли стационарной фазы до визуализации. Таким образом, поддержание постоянного числа клеток <5 × 10 5 клеток / мл имеет решающее значение.
Кроме того, большое число клеток может вызвать переход от вегетативного цикла D. discoideum в цикле развития, тем самым вызывая голодание пути, которые могут привести к различным ответ на тепловой стресс. Если высокие количества клеток достигаются в фазе восстановления после теплового стресса, потоковой передачи и агрегирование клетки могут помешать анализу данных , как клетки перемещаются в фокусе (смотри рисунок 4).
Содержание "> Ограничение техникиПотеря фокуса является узким местом протокола. Во время изменения температуры, фокальная плоскость может смещаться резко, что требует ручного переориентацию в период времени сразу после изменения температуры. Скачок в фокусе иногда может быть слишком экстремальным, чтобы быть преодолены с помощью программного обеспечения автоматической фокусировки, особенно, если время между моментами времени высока. Тем не менее, если используется микроскоп оснащен аппаратной автоматической фокусировки, это узкое место может быть обойдена.
Значимость техники в отношении существующих методов
По сравнению с существующими установками, такими как использование номеров с кондиционерами, с регулируемой температурой инкубации коробки, охватывающих цели и столик микроскопа или с регулируемой температурой этапы и объективных воротники, использование охлаждающей камеры обеспечивает более точный контроль температуры окружающей среды температура. Пельтье-элемент в холодильной камере может поддерживать постоянную и равномерную ПЭМпературе на протяжении экспериментальной установки. В классических установках, местные перепады температур могут привести к различным результатам наблюдений. Кроме того, он может быстро и оперативно реагировать на индуцированные изменения температуры, в то время как классические расстановок адаптируются очень медленно к наведенных изменениям температуры, особенно понижение температуры. Пельтье элементом в холодильной камере также может охватывать более широкий диапазон рабочих температур (15-40 ° C), чем классических установок, с помощью которого достигают температуры, такие как 15 ° C или 40 ° C очень трудно.
Dictyostelium discoideum особенно чувствителен к фото-токсичности. Предыдущие исследования использовали аскорбат в качестве поглотителя для снижения фото-токсичности. Тем не менее, длительные периоды обработки изображений требуют дополнительной добавки. Кроме того, использование аскорбата ограничивается исследованиями, где механизм интерес не зависит от антиоксидантной добавки. Мы полагаем, что с регулируемой температурой формирования изображения может быть использован в качестве альтернативного провертренере, чтобы свести к минимуму фото-токсичность и могут быть объединены с добавлением аскорбиновой кислоты для дальнейшего снижения токсичности.
Фототоксический эффекты могут быть сведены к минимуму путем обеспечения постоянной и равномерной температуре 23 ° С с использованием охлаждающей камеры. Клетки визуализируют с помощью контроля температуры показывают меньше признаков фотостарения токсичности, такой клетки закругления, в течение более длительного периода времени. Это также дает возможность получить изображение с более высокой интенсивности, меньших временных интервалов или более полей зрения (ПЗ).
Общее применение
Тепловое воздействие при более высоких температурах , как было показано , чтобы вызвать разные тепловой стресс реакции 14. Таким образом, повышение температуры до 34 ° С или 37 ° С может побудить другой ответ. В дополнение к приложенному температурного стресса, длительность конкретной ситуации стресса, может быть изменен, чтобы изучить немедленного ответа или долгосрочной адаптации к тепловому стрессу.
В общем, описанный протокол может бытьрасширен до широкого набора приложений. Поскольку точный контроль температуры значительно уменьшает фотографического токсический эффект, протокол может быть использован в установках, требующих высокого уровней экспозиции и / или более высокую интенсивность света возбуждения, например, для визуализации белков с низким уровнем экспрессии, или в сочетании с короткими интервалами времени между изображениями, например, во время съемки в заданный промежуток времени. Он также может быть полезным для получения изображений объектов , охватывающих всю ячейку, например, микротрубочки, так как эти параметры требуют большого количества оптических Z-секции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
- Bonner, J. T. Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).
- Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium. Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).
- Williams, J. G. Dictyostelium finds new roles to model. Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).
- Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine. European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).
- Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).
- Malinovska, L., Alberti, S. Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem. Prion. 9 (5), 339-346 (2015).
- Schneider, K., Bertolotti, A. Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms. Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).
- Dobson, C. M.
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).
- Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium. Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).
- Herman, P. K.
- Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S.
