Introduction
Dictyostelium discoideum sont solitaires amibes vivant du sol qui se nourrissent de bactéries et d' autres micro - organismes, qui sont prises par phagocytose. Il a un cycle de vie unique et remarquable qui a été un domaine de recherche important depuis sa découverte 1. L'intérêt précoce pour le développement multicellulaire 2 et la base moléculaire de la chimiotaxie 3 a été rapidement complétée par des études portant sur la motilité cellulaire, la polarité cellulaire, l' immunité innée. En outre, D. discoideum a été introduit en tant que système modèle pour la recherche biomédicale 4,5.
Récemment, nous avons établi D. discoideum comme un nouveau système pour étudier le contrôle de la qualité des protéines (PQC) 6,7 système. Son protéome est enrichi en protéines prion-like d'agrégation sujettes, ce qui pose un défi à la protéine de contrôle de la qualité 8. Afin de déterminer si D. discoideum a développé des mécanismes moléculaires spécifiques pour contrôler sa très aggrégation sujettes protéome, nous avons étudié le comportement des marqueurs de protéines d'agrégation sujettes à la fois dans des conditions de croissance normales et pendant le stress. Les conditions de stress, tels que le stress thermique, peuvent être utilisés pour augmenter le taux de protéines repliement 9. Par conséquent, nous avons cherché un système où l'on pouvait induire des changements de température et simultanément suivre le comportement des protéines marqueurs. A cet effet, nous avons combiné l'imagerie des cellules vivantes avec chauffage Peltier contrôlé en utilisant une (chambre de refroidissement) insert de scène thermique. Cette méthode nous a permis de maintenir une température constante et uniforme, ainsi que pour induire un changement rapide de la température, mais précis.
Imagerie des cellules vivantes est utilisé pour étudier une variété de processus biologiques dans D. discoideum. Cependant, cette approche se heurte à deux limites majeures. Tout d'abord, les cellules présentent une grande mobilité et ont tendance à migrer hors du champ de vision, donc le suivi de cellules individuelles nécessite souvent l'imagerie d'une grande surface. La mobilité cellulaire peutêtre réduite par Agar overlay 10, cependant, ces conditions ne conviennent pas pour imagerie longue durée en raison d'une baisse de la viabilité. En second lieu , D. cellules discoideum montrent une sensibilité particulièrement élevée à la photo-toxicité, qui se traduit par l' arrondissement des cellules et arrêt de la mitose 11. Protocoles précédents ont abordé cette question par addition d'ascorbate comme fixateur et la réduction des temps d' exposition 12 radical. Ce dernier peut être critique si la protéine d'intérêt est exprimée à des niveaux bas et montre un signal de fluorescence faible. Les auteurs suggèrent également de fournir une température constante de 21 ° C , soit par imagerie dans une salle climatisée ou en utilisant des boîtes d'incubation à température contrôlée, qui couvrent l'objectif et microscope étape 12.
Ici, nous décrivons une méthode avec un meilleur contrôle de la température à l'aide d'une chambre de refroidissement fixé à 23 ° C. Au cours de l'imagerie notre set-up améliore considérablement la résistance à la photo-toxicité. Ilpermet l'utilisation de l'augmentation des temps d'exposition et intensités lumineuses plus élevées d'excitation. Ceci est d'une importance particulière lors de l'imagerie time-lapse, les intervalles de temps doivent être soigneusement équilibrée par rapport au nombre de positions imagées et le temps d'exposition utilisé. La possibilité d'augmenter le nombre de postes imagées permet également la couverture d'une zone de formation d'image plus large et facilite le suivi de cellules individuelles pendant une période de temps plus longue.
Protocol
1. Préparation des cellules
- cellules de culture
- Cultivez D. cellules discoideum en milieu AX à 23 ° C sous la lumière dans des plaques de culture de tissus. Evitez de garder les cellules à des densités élevées, supérieures à 75% de confluence.
NOTE: Pour une réponse optimale au stress thermique, les cellules doivent être en phase de croissance exponentielle et ne doivent pas avoir atteint la phase stationnaire. - La veille imagerie, les cellules divisées en faible moyenne de fluorescence (LFM) à 1 x 10 4 cellules / ml.
REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour réduire la fluorescence de fond provoqué par le milieu AX. Le temps d'incubation peut être réduite à un minimum de 2 heures. Cependant, les vésicules prises en milieu AX peuvent encore générer des signaux de fond après 2 h.
- Cultivez D. cellules discoideum en milieu AX à 23 ° C sous la lumière dans des plaques de culture de tissus. Evitez de garder les cellules à des densités élevées, supérieures à 75% de confluence.
- Préparation des cellules pour la microscopie
- Avant l'imagerie, les cellules de récolte de la plaque de tissu dans LFM et transférer un nombre suffisant de cellules dans des boîtes à fond de verre.
NOTE: Habituellement,1 x 10 5 cellules / ml est suffisante; cependant, si le montage expérimental nécessite des périodes d'imagerie longues (plus de 8 heures), le nombre de cellules doivent être ajustés avec soin, comme D. les cellules discoideum passeront au cycle de développement et de commencer à diffuser en continu et global si le nombre de cellules sont élevés tandis que les nutriments sont faibles. - Laisser les cellules sédimenter pendant 20 min. Retirer les cellules non-réglées en remplaçant soigneusement le support utilisé avec du milieu frais.
- Avant l'imagerie, les cellules de récolte de la plaque de tissu dans LFM et transférer un nombre suffisant de cellules dans des boîtes à fond de verre.
2. Imaging
NOTE: Le protocole peut être utilisé sur des systèmes à grand champ, ainsi que dans les configurations de microscopie confocale. L'utilisation d'une boîte d'incubation à température contrôlée portant sur les objectifs et la platine du microscope est utile, mais pas indispensable pour le contrôle de la température. La température de la zone d'incubation est réglée à la température la plus élevée utilisée dans l'expérience, par exemple à 40 ° C si le stress thermique est effectué. Dans le cas contraire, la température est réglée à 256; C. Les changements de température doivent être faites à l'avance pour permettre au système d'adaptation, comme les changements de température au cours de l'imagerie peuvent affecter la mise au point.
Remarque: Au cours de l'imagerie, la température est contrôlée à l'aide d'une chambre de refroidissement. La température par défaut pour l'imagerie des cellules non souligné est de 23 ° C. Pour des conditions de stress dû à la chaleur, la température est augmentée en conséquence au niveau souhaité. L'élément piézoélectrique dans la chambre de refroidissement peut répondre très rapidement au changement de température. Cependant, la mise au point des images change légèrement (il peut dévier jusqu'à 20 um en fonction du changement de température). Ainsi recentrage manuel est nécessaire dans les premières minutes de l'acquisition d'images, à moins que le microscope utilisé est équipé d'un matériel auto-focus.
- L' acquisition des images dans des conditions non stressées
- les cellules de l'image dans des conditions non stressées à 23 ° C, acquérir un minimum de 6 champs de vision (FOV).
REMARQUE: la condition non-stress peut être visualized soit par l'enregistrement d'un time-lapse court (5-30 min) ou l'acquisition d'images fixes représentatives. Pour chaque ligne de condition ou de la cellule d'acquérir un minimum de 6 champs de vision (FOV).
NOTE: Dans le cas où les cellules individuelles sont d' un intérêt, positionner les cellules respectives dans le milieu de la FOV et d' enregistrer une série de tuiles 3 x 3 avec le FOV contenant les cellules d'intérêt dans le milieu D.. discoideum cellules sont motiles et peuvent migrer hors du champ de vision. Cependant, la série 3 x 3 tuiles augmente la zone potentiellement explorée par la cellule d'intérêt et il reste traçable pour des périodes de ~ 6 h time-lapse. - Acquérir z maximale des piles de 7 um um 1-0.25 étapes consistant à capter la totalité du volume de la cellule.
- Acquérir une image de champ lumineux de référence pour évaluer le nombre total de cellules.
- les cellules de l'image dans des conditions non stressées à 23 ° C, acquérir un minimum de 6 champs de vision (FOV).
- L' acquisition des images pour le stress thermique
- Ajuster la température de la chambre de refroidissement à 30 ° C selon les instructions du fabricant. </ Li>
- Après l'affichage de la température a atteint la valeur souhaitée, recentrer manuellement dans le canal de champ lumineux et vérifier tous les FOV enregistrées avant de commencer le time-lapse.
- Lancer un time-lapse pendant 4 heures de stress thermique avec un intervalle de 5-10 min de temps entre les points de temps. Vérifiez mise au point correcte lors de l'acquisition des deux premiers points de temps.
- L' acquisition des images lors de la récupération
- Après le stress de chaleur, réduire la température de retour à 23 ° C, attendez que l'affichage de la température pour ajuster et recentrer manuellement.
- Enregistrez des films en accéléré dans la phase de récupération pour les 8-10 h en 10-20 intervalles de temps min. Vérifiez mise au point correcte lors de l'acquisition du premier point de temps.
3. Analyse de l'image
NOTE: Pour quantifier le nombre de cellules hébergeant des foyers cytosolique, évaluer le nombre total de cellules et le nombre de cellules avec des foyers cytosolique dans chaqueCadre. En raison de la difficulté de segmenter les cellules à partir d'images de champ lumineux, la quantification doit être effectuée manuellement. Dans ce qui suit, l'analyse des données est décrit pour le logiciel de traitement d'image libre ((http://fiji.sc/Fiji). Il requiert le plugin "Cell Counter" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
- Évaluer nombre total de cellules
- Chargez le brillant image de champ pile (XYT) en cliquant sur "Fichier" et "Open".
- Ouvrez le "Cell Counter" plugin ( "Plugins" - "Cell Counter"). Chargez la pile d'image en cliquant sur "Initialisation".
- Choisissez le type approprié de compteurs en cochant la case appropriée.
REMARQUE: l'utilisation de type 1 comme compteur pour le nombre total de cellules et de type 2 en tant que contre des cellules avec des foyers cytosolique. Comptez toutes les cellules. - Enregistrer les marqueurs en cliquant sur "Enregistrer les marqueurs".
- L' évaluation du nombre de cellules avec des foyers cytosolique
- <li> Charger HyperStack d'image de fluorescence (XZYT) ( "Fichier" - "Ouvrir") et faire une projection d'intensité maximale en utilisant le "Z-projecteur" (image / Stacks).
- Ouvrez le plug-in "Cell Counter". Charger l'image pile résultante (XYT) en cliquant sur "Initialisation".
- Chargez les marqueurs en cliquant sur "marqueurs de charge».
ATTENTION: Les noms de fichier de l'image de référence et la pile de fluorescence doivent être identiques. Si nécessaire, renommer en conséquence avant l'initialisation de la pile d'images. - Choisissez le type de marqueur approprié (voir 3.1.3) et compter les cellules avec des foyers cytosolique. Les marqueurs existants peuvent être utilisés comme guide pour la position des cellules individuelles.
- Récupérer le nombre de coups par tranche en cliquant sur "Résultats" et enregistrer les chiffres ailleurs pour d'autres calculs.
Representative Results
Le protocole d'imagerie décrit peut être utilisé pour analyser le comportement des protéines prion-like agrégation sujettes à l'amibe D. discoideum lors d'un stress thermique. La figure 1 montre la distribution de la GFP-tagged polyglutamine protéine Q103 dans les cellules dans des conditions de croissance normales (figure 1A), après 2 heures de stress thermique à 30 ° C (figure 1B) et après 6 heures de récupération du stress et la croissance dans des conditions de croissance normales (figure 1c). Lors d'une augmentation de température de 23 ° C à 30 ° C, le marqueur de Q103-GFP coalesce d'une distribution diffuse à ponctuée structures. Après la libération du stress et de la croissance à la température normale, ces structures se dissolvent. La redistribution des Q103-GFP et la formation de stress induit par cytosolique foyers de chaleur peuvent être quantifiés en utilisant l' analyse de l' image. La figure 2A montre l'analyse des FOV individuels en utilisant les Fidji et le plug - in "Cell counter ". La figure 2B montre la quantification de la réponse au stress de chaleur. Cela montre que l'augmentation de cytosolique de foyers Q103-GFP en nombre avec la poursuite du stress thermique. Lors d'un stress thermique, le contrôle de la qualité des protéines du système (PQC) est débordé, ainsi aggregation- protéines sujettes telles que la protéine Q103 prion-like ne peuvent pas être maintenus dans un état soluble et de plus en plus global dans les foyers cytosolique. les cellules montrent aussi un arrondi caractéristique, comme représenté sur la figure 1B. la réduction des foyers cytosolique après l' élimination du stress suggère que la agrégée les protéines sont dissoutes.
La qualité d'image est sensible à la densité cellulaire initiale. La figure 3 montre un exemple des cellules après la récupération du stress, en comparant la densité initiale de cellules appropriée (figure 3A) et la densité cellulaire initiale élevée (figure 3B). Si la densité cellulaire initiale était trop élevé, les cellules étoilested pour former des courants comme représenté sur la figure 3b. Ce qui impose des difficultés sur la quantification ultérieure lorsque les cellules sont déplacées hors du plan focal.
Le procédé décrit peut être utilisé pour surveiller les modifications induites par la température, comme décrit ci-dessus. Il peut également être utilisé pour réduire la photo-toxicité lors de l' imagerie à la température de croissance physiologique. La figure 4 montre une comparaison des cellules imagées à 23 ° C dans une chambre de refroidissement (figure 4A) et des cellules imagées sans contrôle de la température dans une pièce climatisée, définie à 25 ° C (figure 4B). Lors de l'exposition constante à la lumière d'excitation, les cellules complètent lorsqu'ils ne sont pas imager dans des conditions à température contrôlée. Ce changement de forme de la cellule est indiquant stress.
Figure 1:
Figure 2: Quantification de cytosolique formation de foyers induite par la chaleur (A) Analyse des cellules en utilisant le paquet de traitement d' image libre Fidji et le plug - in "Cell Counter".. La quantité totale de cellules (type 1, contre marqueurs bleus) est déterminée dans l'image lumineuse de champ. Les marqueurs sont chargés dans le canal de la GFP et le nombre de cellules avec des foyers cytosolique (type 2, les contre marqueurs rouges) est déterminée. (B) Quantification des foyers après 3 heures de stress thermique à 30 ° C et 3 heures de récupération du stress à 23 ° C (n = 4 champs de vision, erreur bar = SD). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4:. Effet de la régulation de la température sur les effets phototoxiques (A) Les cellules imagées pendant 10 min avec contrôle de température à 23 ° C: 6 champs de vision, z-stack (espacement 0,5 uM, épaisseur de l' échantillon 8 uM), laps de temps (total temps 10 min, laps 1 min), le canal GFP (0,07 msec temps d'exposition, l'intensité du laser de 10%), le canal de RFP (0,1 msec de temps d'exposition, 10% l'intensité du laser). Les cellules ne montrent aucun signe de changements morphologiques caractéristiques associées au stress phototoxique. (B) des cellules imagées pendant 10 minutes sans contrôle de la température (mêmes conditions que dans A). Les cellules présentent des signes de phototoxique induit arrondi, ce qui indique le stress. Barre d'échelle = 10 pm. Les cellules ont été imagées sur un système basé sur un microscope avec un 100x / 1.4 ouverture numérique (NA) objectif. Les images ont été recueillies à l'aide d'une caméra CCD en tant que 1,024 x 1,024 fichiers de pixel à l'aide de 1 x 1 binning.4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Le protocole décrit ici peut être utilisé pour étudier le comportement d'une protéine particulière d'intérêt en réponse au stress induit par la chaleur. Augmentation de la température à 30 ° C a été rapporté pour déclencher la réponse au stress de la chaleur et dans ces conditions , la viabilité de D. discoideum est nettement réduite.
Modifications
Le protocole peut être modifié pour comparer le comportement des différentes protéines dans les mêmes conditions de stress. Pour cela, les cellules exprimant des protéines différentes avec le même marqueur fluorescent sont transférés dans des boîtes multi-puits, tels que quatre plats de chambre (section 1.3.1). Le protocole peut également être appliquée sur les cellules des protéines avec des marqueurs différents, tels que la GFP ou RFP co-exprimant. Cela peut être par exemple utilisé pour surveiller le comportement des différents composants du système de contrôle de la qualité des protéines (PQC). Les cellules exprimant GFP-tagged agrégation marqueur et différents composants PCQ DP marqués peuvent être observés à l'aide multi-puitsprodiguées pour l'imagerie. Cela garantit les mêmes conditions de stress (vitesse de montée en température / diminution, la durée de la température augmentation / diminution) et permet des études comparatives.
En outre, le protocole peut être utilisé pour étudier l'influence du système PQC sur la réponse au stress thermique. L'activité des composants peut être modulée en modifiant les niveaux d'expression en utilisant des outils génétiques tels que knock-out ou à la surexpression ou en utilisant des inhibiteurs spécifiques disponibles dans le commerce 6. Le protéasome peut être inhibée par l'addition MG132 (100 uM) ou de lactacystine (10 uM) dans le milieu de croissance. Le chaperon Hsp90 peut être inhibée en utilisant geldanamycine (6 uM) ou radicicol (10 uM). Le chaperon Hsp70 peut être inhibée avec VER-155088, bien que nous ne pouvions pas confirmer l'efficacité de l'inhibition dans nos paramètres expérimentaux jusqu'à présent. Les inhibiteurs devraient être ajoutés un jour avant l'imagerie et les cellules sont incubées pendant 14 heures.
Criti cal étapes dans le protocole
L'étape critique pour l'évaluation de la perturbation induite par la chaleur est l'état des cellules avant l'expérience d'imagerie. Des études ont montré que la levure cellules acquièrent une résistance à divers stress environnementaux durant la phase stationnaire 13. Nous avons également observé la réactivité minimale à appliquer le stress thermique si D. cellules discoideum avaient atteint la phase stationnaire avant l' imagerie. Par conséquent, le maintien d' un numéro de cellule constante de <5 x 10 5 cellules / ml est critique.
En outre, un nombre élevé de cellules peuvent induire la transition du cycle végétatif de D. discoideum le cycle de développement, déclenchant ainsi des voies de famine, ce qui pourrait conduire à une réponse différente au stress thermique. Si un grand nombre de cellules sont atteintes dans la phase de récupération après un stress thermique, le streaming et les cellules d' agrégation peuvent interférer avec l' analyse des données que les cellules se déplacent hors du foyer (voir la figure 4).
content "> Limitation de la TechniqueLa perte de concentration est le goulot d'étranglement du protocole. Au cours de changements de température, le plan focal peut changer de façon drastique, ce qui nécessite un recentrage manuel dans une période de temps immédiatement après un changement de température. Le saut dans le foyer peut parfois être trop extrême pour être vaincu par l'autofocus du logiciel, surtout si le temps entre les points de temps est élevé. Cependant, si le microscope utilisé est équipé d'une mise au point automatique du matériel, ce goulot d'étranglement peut être contournée.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes
En comparaison avec les configurations existantes, telles que l'utilisation des chambres climatisées, des boîtes d'incubation à température contrôlée couvrant les objectifs et les étapes de la phase de microscope ou à température contrôlée et des colliers objectifs, l'utilisation d'une chambre de refroidissement fournit un contrôle plus précis de la température ambiante température. Le Peltier-élément dans la chambre de refroidissement peut maintenir un système constant et uniformetempérature tout au long du montage expérimental. Dans les configurations classiques, les différences locales de température peuvent conduire à des résultats différents d'observation. En outre, il peut réagir rapidement et rapidement aux changements induits dans la température, tandis que des configurations classiques d'adapter très lentement aux changements de température induits, en particulier l'abaissement de la température. Le Peltier-élément dans la chambre de refroidissement peut également couvrir une gamme plus large de température (15-40 ° C) que les configurations classiques, avec lesquelles des températures atteignant telles que 15 ° C ou 40 ° C est très difficile.
Dictyostelium discoideum est particulièrement sensible à la photo-toxicité. Des études antérieures utilisées ascorbate comme fixateur pour réduire la photo-toxicité. Toutefois, les périodes d'imagerie longues nécessitent un supplément additionnel. De plus, l'utilisation d'ascorbate est limitée aux études où le mécanisme d'intérêt ne sont pas affectés par le supplément d'antioxydants. Nous proposons que l'imagerie à température contrôlée peut être utilisé comme une solution de rechange approche pour minimiser la photo-toxicité et peut être combiné avec l'addition d'ascorbate de diminuer encore la toxicité.
effets phototoxiques peuvent être réduits au minimum en prévoyant une température constante et uniforme de 23 ° C en utilisant une chambre de refroidissement. Les cellules imagées en utilisant le contrôle de la température montrent moins de signes de photo-toxicité, tels l'arrondissement des cellules, pour une période de temps plus longue. Cela permet également l'imagerie avec des intensités plus élevées, des intervalles de temps plus petits ou plus champs de vision (FOV).
Application générale
Le stress thermique à des températures plus élevées a été montré pour déclencher une réaction de stress de chaleur différente 14. Par conséquent, l'augmentation de la température à 34 ° C ou 37 ° C, peut induire une réponse différente. En plus de la contrainte de la température appliquée, la durée d'une situation de stress particulière peut être modifié de manière à étudier la réponse immédiate ou à l'adaptation à long terme du stress thermique.
En général, le protocole décrit peut êtreétendu à un large éventail d'applications. Parce que le contrôle précis de la température permet de réduire considérablement les effets photo-toxiques, le protocole peut être utilisé dans des environnements qui nécessitent des temps d'exposition élevés et / ou des intensités de lumière d'excitation, par exemple pour visualiser les protéines avec un faible niveau d'expression, ou en combinaison avec des intervalles de temps courts entre l' imagerie, par exemple, lors de l' imagerie time-lapse. Il peut également être avantageux pour l' imagerie d' objets couvrant toute la cellule, par exemple, les microtubules, étant donné que ces paramètres nécessitent un grand nombre de profilés en Z optiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
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