Introduction
Dictyostelium discoideum sono solitari amebe vivente terreno che si nutrono di batteri e altri microrganismi, che sono presi da fagocitosi. Ha un ciclo di vita unico e straordinario che è stato un importante settore di ricerca dalla sua scoperta 1. Il precoce interesse per lo sviluppo multicellulare 2 e le basi molecolari della chemiotassi 3 fu presto completata da studi incentrati sulla motilità cellulare, la polarità delle cellule, immunità innata. Inoltre, D. discoideum è stato introdotto come sistema modello per 4,5 ricerca biomedica.
Recentemente, abbiamo stabilito D. discoideum come un nuovo sistema per studiare il sistema di controllo della qualità delle proteine (PQC) 6,7. Il suo proteoma è arricchito in proteine prioniche come aggregazione a rischio, che rappresenta una sfida per il controllo della qualità delle proteine 8. Per studiare se D. discoideum ha sviluppato meccanismi molecolari speciali per controllare il suo altamente agCongregazione incline proteoma, abbiamo studiato il comportamento delle proteine marker di aggregazione a rischio sia in normali condizioni colturali e durante lo stress. Condizioni di stress, come ad esempio lo stress da calore, può essere utilizzato per aumentare il tasso di proteine misfolding 9. Pertanto, abbiamo cercato un sistema in cui siamo riusciti a indurre cambiamenti di temperatura e contemporaneamente seguire il comportamento delle proteine marker. A questo scopo, abbiamo combinato live-cell imaging con riscaldamento Peltier controllato utilizzando un (camera di raffreddamento) inserto fase termica. Questo metodo ha permesso di mantenere una temperatura costante ed uniforme, così da indurre un cambiamento rapido ma preciso della temperatura.
Live-cell imaging viene utilizzato per studiare una varietà di processi biologici in D. discoideum. Tuttavia, questo approccio deve affrontare due limiti importanti. Innanzitutto, le cellule mostrano un'alta motilità e tendono a migrare fuori del campo di vista, inseguimento quindi delle singole celle spesso richiede l'imaging di una grande area. La mobilità delle cellule puòessere ridotto di agar di copertura 10, tuttavia, tali condizioni non sono adatti per l'imaging a lungo termine a causa di un calo della redditività. In secondo luogo, D. cellule discoideum mostrano una particolarmente elevata sensibilità a foto-tossicità, che si traduce in arrotondamento cellulare e arresto mitotico 11. Precedenti protocolli affrontato questo problema con l'aggiunta di acido ascorbico come scavenger di radicali e la riduzione dei tempi di esposizione 12. Quest'ultimo può essere critico se la proteina di interesse è espressa a livelli bassi e mostra un segnale debole fluorescenza. Gli autori suggeriscono anche di fornire una temperatura costante di 21 ° C sia per l'imaging in una stanza con aria condizionata o utilizzando le caselle di incubazione a temperatura controllata, che coprono l'obiettivo e microscopio fase 12.
Qui, si descrive un metodo con un migliorato controllo della temperatura utilizzando una camera di raffreddamento impostato a 23 ° C. Durante l'imaging nostro set-up migliora in modo significativo la resistenza alla foto-tossicità. essoconsente l'utilizzo di tempi di esposizione più elevati e superiori intensità di luce di eccitazione. Questo è di particolare importanza durante time-lapse imaging, come gli intervalli di tempo devono essere attentamente bilanciata rispetto al numero di posizioni imaged e il tempo di esposizione utilizzato. La possibilità di aumentare il numero di posizioni impressi permette anche la copertura di un'area più ampia di imaging e facilita il monitoraggio delle singole celle in un periodo di tempo più lungo.
Protocol
1. Preparazione delle cellule
- cellule in crescita
- Grow D. cellule discoideum a medio AX a 23 ° C sotto la luce nelle piastre di coltura di tessuti. Evitare di tenere le cellule ad alta densità superiore al 75% di confluenza.
NOTA: Per una risposta ottimale al calore stress, le cellule devono essere in fase di crescita esponenziale e non abbiano raggiunto fase stazionaria. - Il giorno prima di imaging, le cellule diviso in media di fluorescenza bassa (LFM) a 1 x 10 4 cellule / ml.
NOTA: Questo passaggio è necessario per ridurre la fluorescenza di fondo causato dal fluido AX. Il tempo di incubazione può essere ridotto ad un minimo di 2 ore. Tuttavia, vescicole prese in media AX possono ancora generare qualche segnale di fondo dopo 2 ore.
- Grow D. cellule discoideum a medio AX a 23 ° C sotto la luce nelle piastre di coltura di tessuti. Evitare di tenere le cellule ad alta densità superiore al 75% di confluenza.
- Cellule Preparazione per la microscopia
- Prima di imaging, le cellule raccolta dalla piastra di tessuto in LFM e trasferire un numero adeguato di cellule in piatti di fondo di vetro.
NOTA: Solitamente,1 x 10 5 cellule / ml è sufficiente; tuttavia, se il setup sperimentale richiede periodi lunghi di imaging (più di 8 ore), il numero di cellule devono essere adeguati con attenzione, come D. cellule discoideum passeranno al ciclo di sviluppo e iniziare a trasmettere e globale se il numero di cellule sono elevati, mentre le sostanze nutrienti sono bassi. - Permettono alle cellule di stabilirsi per 20 min. Rimuovere le cellule non regolati sostituendo con attenzione il mezzo utilizzato con terreno fresco.
- Prima di imaging, le cellule raccolta dalla piastra di tessuto in LFM e trasferire un numero adeguato di cellule in piatti di fondo di vetro.
2. Imaging
NOTA: Il protocollo può essere utilizzato su sistemi a grande campo così come in configurazioni microscopia confocale. L'utilizzo di una scatola di incubazione a temperatura controllata che copre gli obiettivi e la fase microscopio è utile, ma non essenziale per il controllo della temperatura. La temperatura della scatola incubazione è impostata la temperatura più alta usata nell'esperimento, ad esempio, a 40 ° C se viene eseguita stress termico. Altrimenti, la temperatura viene impostata su 256; C. I cambiamenti di temperatura devono essere fatte in anticipo per consentire al sistema di adattarsi, come variazioni di temperatura durante l'imaging possono influenzare la messa a fuoco.
NOTA: Durante l'imaging, la temperatura viene controllata utilizzando una camera di raffreddamento. La temperatura di default per l'imaging cellule non-ha sottolineato è 23 ° C. Per le condizioni di tensione termica, la temperatura viene aumentata di conseguenza al livello desiderato. L'elemento piezoelettrico nella camera di raffreddamento può rispondere molto rapidamente al cambiamento di temperatura. Tuttavia, il focus delle immagini può variare leggermente (può discostarsi fino a 20 micron a seconda del cambiamento di temperatura). Così rifocalizzazione manualmente all'interno i primi minuti di acquisizione dell'immagine, a meno che il microscopio utilizzato è dotato di un hardware di autofocus.
- L'acquisizione delle immagini in condizioni di non-stress
- celle di immagine in condizioni di non-ha sottolineato a 23 ° C, acquistano un minimo di 6 campi di vista (FOV).
NOTA: condizione non lo stress può essere visualizEd entrambi registrando un breve time-lapse (5-30 min) o l'acquisizione di immagini fisse rappresentative. Per ogni linea di condizione o di cellule acquisire un minimo di 6 campi di vista (FOV).
NOTA: Nel caso le singole celle sono di interesse, posizionare le rispettive cellule nel mezzo del FOV e registrare una serie di piastrelle 3 x 3 con il FOV contenente le cellule di interesse nel mezzo D.. cellule discoideum sono mobili e possono migrare fuori del campo di vista. Tuttavia, la serie di piastrelle 3 x 3 aumenta l'area potenzialmente esplorato dalla cella di interesse e rimane tracciabile per periodi time-lapse di ~ 6 ore. - Acquisire z-pile di massimo 7 micron di 1-0.25 micron passi per catturare l'intero volume della cella.
- Acquisire un'immagine di campo chiaro riferimento per valutare il numero totale di cellule.
- celle di immagine in condizioni di non-ha sottolineato a 23 ° C, acquistano un minimo di 6 campi di vista (FOV).
- Acquisizione di immagini per lo stress termico
- Regolare la temperatura della camera di raffreddamento a 30 ° C secondo le istruzioni del produttore. </ Li>
- Dopo che il display della temperatura ha raggiunto il valore desiderato, riorientare manualmente il canale in campo chiaro e visualizzate tutte FOV registrati prima di iniziare il time-lapse.
- Avviare un time-lapse per 4 ore di stress da calore, con un intervallo di tempo di 5-10 minuti tra i punti di tempo. Controllare la corretta messa a fuoco durante l'acquisizione dei primi due punti di tempo.
- Acquisizione di immagini durante il recupero
- Dopo lo stress da calore, ridurre la temperatura torna a 23 ° C, attendere che il display della temperatura per regolare e riorientare manualmente.
- Registra filmati time-lapse in fase di recupero per 8-10 ore a 10-20 intervalli di tempo min. Controllare la corretta messa a fuoco durante l'acquisizione del primo punto temporale.
Analisi 3. Immagine
NOTA: per quantificare il numero di cellule che ospitano foci citosolica, valuta il numero totale di cellule e il numero di cellule con foci citosolico in ogni tempotelaio. A causa della difficoltà di segmentare cellule da immagini in campo chiaro, la quantificazione deve essere fatto manualmente. Qui di seguito, l'analisi dei dati è descritto per il pacchetto gratuito di elaborazione delle immagini ((http://fiji.sc/Fiji). Si richiede il plugin "Cell Counter" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
- Valutare il numero totale di cellule
- Caricare l'immagine in campo chiaro stack (XYT) facendo clic su "File" e "Apri".
- Aprire il plugin "Cell Counter" ( "Plugins" - "Cell Counter"). Caricare la risma immagine cliccando su "Inizializza".
- Scegliere il tipo appropriato di contatori barrando l'apposita casella.
NOTA: l'uso di tipo 1 come contatore per il numero totale di cellule e di tipo 2 come contatore per le cellule con focolai citosolico. Contare tutte le cellule. - Salvare i marcatori cliccando "Save Markers".
- Valutare il numero di cellule con focolai citosolica
- <li> Caricare il HyperStack immagine di fluorescenza (XZYT) ( "File" - "Apri") e fare una proiezione massima intensità utilizzando la "Z-proiettore" (Immagine / pile).
- Aprire il plugin "Cell Counter". Caricare l'immagine risultante pila (XYT) facendo clic su "Inizializza".
- Caricare i marcatori facendo clic su "Carica" Markers.
ATTENZIONE: I nomi dei file di immagine di riferimento e lo stack di fluorescenza devono essere identici. Se necessario, rinominare di conseguenza prima di inizializzare lo stack di immagini. - Scegliere il tipo di indicatore appropriato (vedi 3.1.3) e contare le cellule con focolai citosolico. I marcatori esistenti possono essere utilizzati come guida per la posizione delle singole cellule.
- Recuperare il numero di conteggi per fetta cliccando su "Risultati" e salvare i conteggi altrove per ulteriori calcoli.
Representative Results
Il protocollo di imaging descritto può essere utilizzato per analizzare il comportamento di proteine prioniche come aggregazione a rischio in un'ameba D. discoideum durante stress termico. La Figura 1 mostra la distribuzione di Q103 proteine polyglutamine GFP-etichettato in cellule normali condizioni colturali (Figura 1A), dopo 2 ore di stress termico a 30 ° C (Figura 1B) e dopo 6 ore di recupero stress e crescita a normali condizioni di crescita (Figura 1C). Su aumento della temperatura da 23 ° C a 30 ° C, il marcatore Q103-GFP fonde da una distribuzione diffusa per puntiformi strutture. Dopo il rilascio di stress e la crescita a temperatura normale, queste strutture si dissolvono. La ridistribuzione di Q103-GFP e la formazione di calore indotta da stress citosolico foci possono essere quantificati utilizzando l'analisi dell'immagine. La figura 2A mostra l'analisi dei singoli FOV utilizzando Fiji e il plugin "Cell contatore ". La figura 2B mostra la quantificazione della risposta allo stress termico. Questo dimostra che l'aumento di focolai Q103-GFP citosolico in numero con continuo stress da calore. Durante lo stress da calore, il sistema (PQC) il controllo della qualità delle proteine è sopraffatto, quindi aggregation- proteine inclini come la Q103 proteina prionica-simili non possono essere mantenute in uno stato solubile e sempre aggregata foci citosolico. le cellule mostrano anche un arrotondamento caratteristica, come illustrato nella Figura 1B. la riduzione dei foci citosolico dopo la rimozione di stress suggerisce che l'aggregato le proteine sono dissolti.
La qualità delle immagini è sensibile alla densità cellulare iniziale. Figura 3 mostra un esempio di cellule dopo il recupero stress, confrontando appropriata densità iniziale delle cellule (Figura 3A) e alta densità iniziale delle cellule (Figura 3B). Se la densità cellulare iniziale era troppo elevato, le cellule stellata per formare flussi come illustrato in figura 3b. Ciò che impone difficoltà sul successiva quantificazione come le cellule hanno spostato fuori del piano focale.
Il metodo descritto può essere utilizzato per monitorare le variazioni di temperatura indotte come descritto sopra. Può anche essere utilizzato per ridurre fototossicità quando l'imaging a temperatura crescita fisiologica. Figura 4 mostra un confronto di cellula ripreso a 23 ° C in una camera di raffreddamento (figura 4A) e cellule ripreso senza controllo della temperatura in una camera climatizzata, impostare a 25 ° C (Figura 4B). Al momento l'esposizione costante alla luce di eccitazione, le cellule completano il quadro quando non è ripreso in condizioni di temperatura controllata. Questo cambiamento di forma delle cellule indica stress.
Figura 1:
Figura 2: Quantificazione di formazione foci citosolico indotta dal calore (A) Analisi delle cellule con il pacchetto di elaborazione delle immagini gratuito Fiji e il plugin "Cell Counter".. La quantità totale di cellule (tipo 1, contro i marcatori blu) viene determinata l'immagine in campo chiaro a. I marcatori sono caricati nel GFP-canale e il numero di cellule con citosolica focolai (tipo 2, marcatori da banco rosso) è determinata. (B) Quantificazione dei focolai dopo 3 ore di stress da calore a 30 ° C e 3 ore di recupero dello stress a 23 ° C (n = 4 campi di vista, errore bar = SD). Fai clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
.jpg "/>
Figura 4:. Effetto di controllo di temperatura effetti fototossiche cellule (A) ripreso per 10 min a temperatura controllata a 23 ° C: 6 campi di vista, z-stack (spaziatura 0,5 mM, spessore del campione 8 mM), lasso di tempo (totale tempo 10 min, periodo 1 min), il canale GFP (0,07 msec tempo di esposizione, il 10% dell'intensità del laser), canale RFP (0,1 msec tempo di esposizione, l'intensità del laser 10%). Le cellule non mostrano segni dei cambiamenti morfologici caratteristici associati allo stress fototossico. (B) Le cellule ripreso per 10 minuti, senza controllo della temperatura (stesse condizioni in A). Le cellule mostrano segni di fototossicità indotta arrotondamento, che indica lo stress. Barra di scala = 10 micron. Le cellule sono stati ripresi in un sistema basato su un microscopio con un obiettivo 100x / 1.4 apertura numerica (NA). Le immagini sono state raccolte con una telecamera CCD da 1.024 x 1.024 pixel file utilizzando 1 x 1 binning.4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo qui descritto può essere usato per studiare il comportamento di una particolare proteina di interesse in risposta allo stress indotto da calore. Aumento della temperatura a 30 ° C è stato segnalato per innescare la risposta allo stress termico e in queste condizioni la vitalità di D. discoideum è marcatamente ridotta.
modifiche
Il protocollo può essere modificato per confrontare il comportamento delle varie proteine nelle stesse condizioni di stress. Per questo, le cellule che esprimono proteine diverse con lo stesso tag fluorescenti vengono trasferiti in piatti multi-e, come quattro piatti da camera (sezione 1.3.1). Il protocollo può essere applicato anche su cellule co-esprimono proteine con differenti marcatori, come GFP o RFP. Questo può essere ad esempio utilizzato per monitorare il comportamento delle varie componenti del sistema di controllo qualità delle proteine (PQC). Le cellule che esprimono marcatore aggregazione GFP-tagged e diversi componenti PCQ RFP-tag possono essere osservate con multi-pozzobombati per l'imaging. Questo garantisce le stesse condizioni di stress (velocità di aumento della temperatura / diminuzione, la durata della temperatura incremento / decremento) e permette studi comparativi.
Inoltre, il protocollo può essere usato per studiare l'influenza del sistema PQC sulla risposta allo stress termico. L'attività dei componenti può essere modulata cambiando livelli di espressione utilizzando strumenti genetici come knock-out o sovraespressione o utilizzando disponibili in commercio inibitori specifici 6. Il proteasoma può essere inibita aggiungendo MG132 (100 mM) o lactacistina (10 pM) per mezzo di crescita. Il chaperone Hsp90 può essere inibita mediante geldanamycin (6 micron) o radicicol (10 micron). Il chaperone Hsp70 può essere inibita con VER-155088, anche se non siamo riusciti a confermare l'efficacia di inibizione nelle nostre impostazioni sperimentali finora. Inibitori dovrebbero essere aggiunti un giorno prima di imaging e le cellule sono incubate per 14 ore.
Criti CAL passaggi all'interno del protocollo
Il passaggio critico per la valutazione della perturbazione indotta dal calore è lo stato delle cellule prima dell'esperimento di imaging. Studi in lievito hanno mostrato che le cellule acquisiscono la resistenza ad una varietà di stress ambientali durante la fase stazionaria 13. Abbiamo anche osservato risposta minimo per applicare lo stress da calore se D. cellule discoideum avevano raggiunto fase stazionaria prima di imaging. Pertanto, mantenendo un numero costante di cella <5 x 10 5 cellule / ml è critica.
Inoltre, il numero di cellule elevate possono indurre la transizione dal ciclo vegetativo di D. discoideum al ciclo di sviluppo, innescando così percorsi da fame, che potrebbero portare ad una diversa risposta allo stress da calore. Se il numero di cellule alti sono raggiunti in fase di recupero dopo lo stress da calore, lo streaming e le cellule aggregazione possono interferire con l'analisi dei dati come le cellule si muovono fuori fuoco (vedi Figura 4).
contenuto "> limitazione della tecnicaLa perdita di messa a fuoco è il collo di bottiglia del protocollo. Durante variazioni di temperatura, il piano focale può spostare drasticamente, che richiede rifocalizzazione manuale in un periodo di tempo immediatamente dopo la modifica della temperatura. Il salto nel fuoco può essere a volte troppo estremo da superare con autofocus software, soprattutto se il tempo tra i punti di tempo è alta. Tuttavia, se il microscopio utilizzato è dotato di un autofocus hardware, questa strozzatura può essere aggirato.
Importanza della tecnica con rispetto a metodi esistenti
In confronto con configurazioni esistenti, come l'uso di camere climatizzate, scatole di incubazione a temperatura controllata che coprono gli obiettivi ei fase fasi microscopio o temperatura controllata e collari oggettive, l'uso di una camera di raffreddamento fornisce un controllo più preciso del ambiente temperatura. Il Peltier-elemento nella camera di raffreddamento può mantenere una tem costante ed uniformetemperatura in tutto l'apparato sperimentale. In configurazioni classiche, le differenze di temperatura locali potrebbero portare a risultati di osservazione diversi. Inoltre, può rispondere rapidamente e rapidamente ai cambiamenti indotti nella temperatura, mentre configurazioni classici adattano molto lentamente alle variazioni di temperatura indotte, in particolare l'abbassamento della temperatura. Il Peltier-elemento nella camera di raffreddamento può anche coprire una gamma più ampia di temperatura (15-40 ° C) rispetto configurazioni classici, con le temperature che raggiungono come 15 ° C o 40 ° C è molto difficile.
Dictyostelium discoideum è particolarmente sensibile alla foto-tossicità. Precedenti studi utilizzati ascorbato come spazzino per ridurre la foto-tossicità. Tuttavia, i periodi di imaging lunghi richiedono integrazione aggiuntiva. Inoltre, l'uso di ascorbato è limitata a studi in cui il meccanismo di interesse non è influenzato dal supplemento antiossidante. Si propone che l'imaging temperatura controllata può essere utilizzata come alternativa ca.oach per minimizzare fototossicità e potrebbe essere combinata con l'aggiunta di ascorbato di diminuire ulteriormente la tossicità.
effetti fototossiche possono essere minimizzati fornendo una temperatura costante ed uniforme di 23 ° C utilizzando una camera di raffreddamento. Le cellule ripreso con controllo della temperatura mostrano meno segni di foto-tossicità, quali l'arrotondamento delle cellule, per un periodo di tempo più lungo. Questo permette anche di imaging con intensità elevate, intervalli di tempo più o più campi di vista (FOV).
Applicazione generale
Stress termico a temperature superiori ha dimostrato di innescare calore diversa risposta allo stress 14. Pertanto, aumentando la temperatura a 34 ° C o 37 ° C potrebbe indurre una risposta differente. Oltre allo stress temperatura applicata, la durata di una particolare situazione di stress può essere modificato per studiare la risposta immediata o adattamento a lungo termine per stress termico.
In generale, il protocollo descritto può essereesteso a una vasta gamma di applicazioni. Poiché il controllo preciso della temperatura riduce considerevolmente effetti foto-tossico, il protocollo può essere utilizzato in ambienti che richiedono elevati tempi di esposizione e / o elevate intensità di luce di eccitazione, per esempio, per la visualizzazione di proteine con un livello di espressione basso, o in combinazione con brevi intervalli di tempo tra le immagini, ad esempio, durante il time-lapse imaging. Può anche essere vantaggioso per immagini di oggetti che coprono tutta la cella, ad esempio, microtubuli, come queste impostazioni richiedono un elevato numero di z-sezioni ottiche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
- Bonner, J. T. Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).
- Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium. Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).
- Williams, J. G. Dictyostelium finds new roles to model. Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).
- Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine. European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).
- Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).
- Malinovska, L., Alberti, S. Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem. Prion. 9 (5), 339-346 (2015).
- Schneider, K., Bertolotti, A. Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms. Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).
- Dobson, C. M.
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).
- Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium. Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).
- Herman, P. K.
- Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S.
