Introduction
Dictyostelium discoideum amebas son solitarios la vida del suelo que se alimentan de bacterias y otros microorganismos, que son absorbidos por fagocitosis. Tiene un ciclo de vida única y singular que ha sido un área importante de la investigación desde su descubrimiento 1. El interés en el desarrollo temprano multicelular 2 y la base molecular de la quimiotaxis 3 pronto se complementa con estudios centrados en la motilidad celular, la polaridad celular, la inmunidad innata. Además, D. discoideum se introdujo como un sistema modelo para la investigación biomédica 4,5.
Recientemente, hemos establecido D. discoideum como un nuevo sistema para estudiar el sistema de control de 6,7 calidad de la proteína (PQC). Su proteoma está enriquecida en proteínas priónicas-como agregación propensos, lo que plantea un reto al control de calidad de las proteínas 8. Para investigar si D. discoideum ha desarrollado mecanismos moleculares especiales para controlar su muy agproteoma congregación propensas, se estudió el comportamiento de las proteínas marcadoras agregación propensos tanto en condiciones de crecimiento normales y durante el estrés. Condiciones de estrés, tales como el estrés por calor, se pueden utilizar para aumentar la tasa de proteínas misfolding 9. Por lo tanto, se buscó un sistema en el que podríamos inducir cambios de temperatura y al mismo tiempo seguir el comportamiento de las proteínas marcadoras. Para este propósito, se combinaron imágenes de células vivas con calefacción controlada por sistema Peltier utilizando una (cámara de enfriamiento) inserto etapa térmica. Este método nos permitió mantener una temperatura constante y uniforme, así como para inducir un cambio rápido, pero precisa de la temperatura.
Imágenes de células vivas se utiliza para estudiar una variedad de procesos biológicos en D. discoideum. Sin embargo, este enfoque se enfrenta a dos limitaciones importantes. En primer lugar, las células muestran un alto motilidad y tienden a migrar fuera del campo de visión, el seguimiento tanto de las células individuales a menudo requiere de formación de imágenes de un área grande. La movilidad celular puedereducirse en agar de recubrimiento 10, sin embargo, estas condiciones no son adecuadas para formación de imágenes a largo plazo debido a una disminución de la viabilidad. En segundo lugar, D. discoideum células muestran una particularmente alta sensibilidad a la foto-toxicidad, lo que resulta en el redondeo celular y detención mitótica 11. Protocolos anteriores abordan este problema mediante la adición de ascorbato como un eliminador de radicales y reducción de los tiempos de exposición 12. Este último puede ser crítica si la proteína de interés se expresa en niveles bajos y muestra una señal de fluorescencia débil. Los autores también sugieren para proporcionar una temperatura constante de 21 ° C, ya sea por formación de imágenes en una habitación con aire acondicionado o mediante el uso de cajas de incubación a temperatura controlada, que cubren la etapa objetiva y microscopio 12.
A continuación, describimos un método con control de temperatura mejorado mediante el uso de una cámara de enfriamiento ajustado a 23 ° C. Durante una imagen nuestra puesta a punto mejora significativamente la resistencia a la fototoxicidad. Esopermite el uso de los tiempos de exposición superiores e intensidades de luz de excitación más altos. Esto es de particular importancia cuando se toman imágenes de lapso de tiempo, ya que los intervalos de tiempo tienen que ser sopesado frente a la cantidad de puestos fotografiados y el tiempo de exposición utilizado. La posibilidad de aumentar el número de posiciones fotografiadas también permite la cobertura de un área de imagen más ancho y facilita el seguimiento de las células individuales en un periodo de tiempo más largo.
Protocol
1. Preparación de la célula
- Las células que crecen
- Crecer D. discoideum células en medio AX a 23 ° C bajo luz en placas de cultivo de tejidos. Evitar mantener las células a altas densidades superiores a 75% de confluencia.
NOTA: Para obtener una respuesta óptima al estrés térmico, las células necesitan estar en la fase de crecimiento exponencial y no deberían haber alcanzado la fase estacionaria. - El día antes de exponer, las células se dividieron en medio de fluorescencia baja (LFM) a 1 x 10 4 células / ml.
NOTA: Este paso es necesario para reducir la fluorescencia de fondo causado por el medio de AX. El tiempo de incubación puede ser reducido a un mínimo de 2 horas. Sin embargo, las vesículas se recogió en medio AX todavía puede generar un poco de señal de fondo después de 2 horas.
- Crecer D. discoideum células en medio AX a 23 ° C bajo luz en placas de cultivo de tejidos. Evitar mantener las células a altas densidades superiores a 75% de confluencia.
- Las células se preparan para la microscopía
- Antes de imágenes, las células de la cosecha de la placa en el tejido LFM y la transferencia de un número adecuado de células en placas de fondo de cristal.
NOTA: Por lo general,1 x 10 5 células / ml es suficiente; Sin embargo, si la configuración experimental requiere periodos largos de formación de imágenes (más de 8 horas), el número de células necesitan ser ajustados cuidadosamente, como D. discoideum células pasará al ciclo de desarrollo y empezar a transmitir y global si el número de células son altos mientras que los nutrientes son bajos. - Permitir que las células se asienten durante 20 minutos. Eliminar las células no resueltos por la sustitución con cuidado el medio utilizado con medio fresco.
- Antes de imágenes, las células de la cosecha de la placa en el tejido LFM y la transferencia de un número adecuado de células en placas de fondo de cristal.
2. Imaging
NOTA: El protocolo se puede utilizar en sistemas de gran campo, así como en las configuraciones de microscopía confocal. El uso de una caja de incubación de temperatura controlada que cubre los objetivos y la platina del microscopio es útil, sin embargo, no es esencial para el control de la temperatura. La temperatura de la caja de incubación se ajusta a la temperatura más alta utilizada en el experimento, por ejemplo, a 40 ° C si no se realiza el estrés por calor. De lo contrario, la temperatura se establece en 256; C. Los cambios de temperatura deben hacerse con anticipación para permitir que el sistema se adapte, como los cambios de temperatura durante la exploración pueden afectar el enfoque.
NOTA: Durante la formación de imágenes, la temperatura se controla mediante una cámara de enfriamiento. La temperatura predeterminada para obtener imágenes de células no estresado es de 23 ° C. Para las condiciones de estrés por calor, la temperatura se aumenta en consecuencia al nivel deseado. El elemento piezoeléctrico en la cámara de enfriamiento puede responder muy rápidamente a la cambio de temperatura. Sin embargo, el enfoque de las imágenes va a cambiar ligeramente (que puede desviarse a un máximo de 20 micras dependiendo del cambio de temperatura). Por lo tanto se requiere reorientación manual de dentro de los primeros minutos de adquisición de imágenes, a menos que el microscopio usado está equipado con un hardware de enfoque automático.
- La adquisición de imágenes en condiciones no estresadas
- celdas de imagen en condiciones sin estrés a 23 ° C, adquieren un mínimo de 6 campos de visión (FOV).
NOTA: condición no el estrés puede ser visualized mediante la grabación de un corto lapso de tiempo (5-30 min) o la adquisición de imágenes fijas representativas. Para cada línea celular condición o adquirir un mínimo de 6 campos de visión (FOV).
NOTA: En el caso de las células individuales son de interés, la posición de las respectivas células en el medio de la FOV y grabar una serie de baldosas 3 x 3 con el campo de visión que contiene las células de interés en el medio D.. discoideum células son móviles y pueden migrar fuera del campo de visión. Sin embargo, la serie de baldosas de 3 x 3 aumenta el área potencialmente explorado por la célula de interés y sigue siendo detectable por períodos de lapso de tiempo de ~ 6 horas. - Adquirir z-pilas de máximo 7 micras de 1-0.25 m pasos para capturar todo el volumen de la célula.
- Adquirir una imagen de referencia de campo claro para evaluar el número total de células.
- celdas de imagen en condiciones sin estrés a 23 ° C, adquieren un mínimo de 6 campos de visión (FOV).
- La adquisición de imágenes de estrés por calor
- Ajustar la temperatura de la cámara de enfriamiento a 30 ° C de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </ Li>
- Después de la exhibición de la temperatura ha alcanzado el valor deseado, vuelva a enfocar manualmente en el canal de campo claro y se les presentarán todas las FOV registrados antes de iniciar el lapso de tiempo.
- Iniciar un lapso de tiempo de 4 horas de estrés por calor con un intervalo de tiempo de 5-10 minutos entre los puntos de tiempo. Compruebe el correcto enfoque durante la adquisición de los dos primeros puntos de tiempo.
- La adquisición de imágenes durante la recuperación
- Después de estrés por calor, reducir la temperatura de nuevo a 23 ° C, esperar a que el indicador de temperatura para ajustar y reorientar manualmente.
- Grabar películas a intervalos en la fase de recuperación de 8-10 horas en intervalos de tiempo de 10-20 min. Compruebe el correcto enfoque durante la adquisición del primer punto de tiempo.
Análisis 3. Imagen
NOTA: Para cuantificar el número de células que albergan focos citosólica, evaluar el número total de células y el número de células con focos citosólica en cada momentomarco. Debido a la dificultad de la segmentación de las células a partir de imágenes de campo claro, la cuantificación que hay que hacer manualmente. En lo que sigue, se describe el análisis de datos para el paquete libre de procesamiento de imagen ((http://fiji.sc/Fiji). Se requiere el plugin "Cell Counter" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
- Evaluar número total de células
- Cargar la pila brillante imagen de campo (XYT) haciendo clic en "Archivo" y "Abrir".
- Abra el "Cell Counter" plug-in ( "plugins" - "Cell Counter"). Cargar la pila de la imagen haciendo clic en "Inicializar".
- Elegir el tipo adecuado de contadores, marcando la casilla correspondiente.
NOTA: El uso de tipo 1 como contador para el número total de células y tipo 2 como contador de células con focos citosólica. Contar todas las células. - Guardar los marcadores haciendo clic en "Guardar" marcadores.
- Evaluar el número de células con focos citosólica
- <li> Carga la HyperStack imagen de fluorescencia (XZYT) ( "Archivo" - "Open") y hacer una proyección de intensidad máxima con el "Z-proyector" (Imagen / Pilas).
- Abrir el plugin "Cell Counter". Cargar la pila de la imagen resultante (XYT) haciendo clic en "Inicializar".
- Cargar los marcadores haciendo clic en "Marcadores de carga".
PRECAUCIÓN: Los nombres de archivo de la imagen de referencia y la pila de fluorescencia deben ser idénticos. Si es necesario, cambiar el nombre en consecuencia antes de inicializar la pila de imágenes. - Elegir el tipo de marcador apropiado (véase 3.1.3) y contar las células con focos citosólica. Los marcadores existentes se pueden utilizar como guía para la posición de las células individuales.
- Recuperar el número de cuentas por rebanada haciendo clic en "Resultados" y guardar los recuentos en otro lugar para otros cálculos.
Representative Results
El protocolo de formación de imágenes descrito se puede utilizar para analizar el comportamiento de las proteínas priónicas como agregación propensos en la ameba D. discoideum durante el estrés por calor. La Figura 1 muestra la distribución de poliglutamina Q103 proteína GFP-etiquetado en las células en condiciones de crecimiento normales (Figura 1A), después de 2 horas de estrés por calor a 30 ° C (Figura 1B) y después de 6 horas de recuperación estrés y crecimiento en condiciones de crecimiento normales (Figura 1C). Al aumento de la temperatura desde 23 ° C a 30 ° C, el marcador Q103-GFP se une de una distribución difusa a punctata estructuras. Tras la liberación del estrés y el crecimiento a temperatura normal, estas estructuras se disuelven. La redistribución de Q103-GFP y la formación de estrés inducido por calor focos citosólica se pueden cuantificar usando análisis de imágenes. La figura 2A muestra el análisis de FOV individuales utilizando Fiji y el plugin "Cell mostrador ". La figura 2B muestra la cuantificación de la respuesta al estrés de calor. Esto demuestra que el aumento de focos Q103-GFP citosólico en serie con la continuación de estrés por calor. Durante el estrés por calor, el sistema (CMC) de control de calidad de la proteína es abrumado, por tanto, agregación- proteínas propensas como el Q103 proteína prión-como no se pueden mantener en un estado soluble y cada vez agregada en focos citosólica. las células también muestran un redondeo característica, como se muestra en la Figura 1B. la reducción de focos citosólica después de la eliminación del estrés sugiere que el agregado proteínas se disuelven.
La calidad de la imagen es sensible a la densidad celular inicial. Figura 3 muestra un ejemplo de las células después de la recuperación de estrés, la comparación de la densidad adecuada inicial de células (Figura 3A) y la densidad celular inicial alta (Figura 3B). Si la densidad celular inicial era demasiado alto, las células estrellated para formar corrientes como se muestra en la Figura 3b. Este que impone dificultades en la posterior cuantificación medida que las células se han trasladado fuera del plano focal.
El método descrito se puede utilizar para controlar los cambios inducidos por la temperatura como se describe anteriormente. También se puede utilizar para reducir la foto-toxicidad cuando la formación de imágenes a temperatura crecimiento fisiológico. Figura 4 muestra una comparación de células fotografiado a 23 ° C en una cámara (Figura 4A) enfriar y células fotografiado sin control de temperatura en una habitación con aire acondicionado, establece a 25 ° C (Figura 4B). Tras la exposición constante a la luz de excitación, las células completan cuando no está reflejado en las condiciones de temperatura controlada. Este cambio en la forma de la célula es lo que indica el estrés.
Figura 1:
Figura 2: Cuantificación de la formación de focos citosólico inducida por calor (A) Análisis de las células utilizando el paquete de procesamiento de imágenes libre de Fiji y el "Cell Counter" plug-in.. La cantidad total de células (tipo 1, marcadores contador azul) se determina la imagen de campo claro en. Los marcadores son cargados en el GFP-canal y el número de células con focos citosólica (tipo 2, los marcadores de contador rojo) se determina. (B) Cuantificación de los focos después de 3 h de estrés por calor a 30 ° C y 3 horas de recuperación de estrés a 23 ° C (n = 4 campos de visión, el error bar = SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4:. Efecto de control de la temperatura sobre los efectos fototóxicas células (A) de captación de imagen para 10 min con control de temperatura a 23 ° C: 6 campos de visión, z-stack (espaciado de 0,5 M, espesor de la muestra 8 M), lapso de tiempo (en total tiempo 10 min, lapso de 1 min), el canal de GFP (0,07 mseg tiempo de exposición, 10% la intensidad del láser), el canal de RFP (0,1 mseg tiempo de exposición, la intensidad del láser 10%). Las células no muestran signos de los cambios morfológicos característicos asociados con el estrés fototóxico. (B) Las células de captación de imagen para 10 min sin control de temperatura (mismas condiciones que en A). Las células presentan signos de fototoxicidad inducida por redondeo, lo que indica el estrés. Barra de escala = 10 micras. Las células fueron imágenes en un sistema basado en un microscopio con un objetivo 100x / 1,4 apertura numérica (NA). Las imágenes fueron recolectados con una cámara CCD como 1.024 x 1.024 píxeles, utilizando los archivos de 1 x 1 hurgar en la basura.4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El protocolo descrito aquí se puede utilizar para estudiar el comportamiento de una proteína particular de interés en respuesta al estrés inducida por calor. Aumento de la temperatura a 30 ° C ha sido reportado para desencadenar la respuesta de estrés de calor y bajo estas condiciones, la viabilidad de D. discoideum se reduce notablemente.
modificaciones
El protocolo puede ser modificado para comparar el comportamiento de diferentes proteínas en las mismas condiciones de estrés. Para esto, las células que expresan diferentes proteínas con la misma etiqueta fluorescente se transfieren en placas de múltiples pocillos, tal como cuatro platos de cámara (sección 1.3.1). El protocolo también se puede aplicar sobre las células proteínas con diferentes marcadores, tales como GFP o RFP co-expresan. Esto puede ser por ejemplo utilizado para monitorear el comportamiento de los diferentes componentes del sistema de control de calidad de la proteína (PQC). Las células que expresan el marcador agregación BPA de etiquetado y diferentes componentes PCQ RFP-etiquetados se pueden observar utilizando múltiples pocillosen forma de plato para la imagen. Esto asegura las mismas condiciones de estrés (velocidad de aumento de la temperatura / disminución, la duración de la temperatura de aumento / disminución) y permite estudios comparativos.
Además, el protocolo se puede utilizar para estudiar la influencia del sistema de PQC en la respuesta al estrés de calor. La actividad de los componentes puede ser modulado por cambios en los niveles de expresión utilizando herramientas genéticas tales como knock-out o sobreexpresión o mediante el uso de inhibidores específicos disponibles en el mercado 6. El proteasoma puede ser inhibida por la adición de MG132 (100 M) o lactacistina (10 M) al medio de crecimiento. La chaperona Hsp90 puede ser inhibida usando geldanamicina (6 M) o radicicol (10 M). La chaperona Hsp70 puede inhibirse con VER-155 088, aunque no pudimos confirmar la eficacia de la inhibición en nuestras condiciones experimentales hasta ahora. Los inhibidores se deben añadir un día antes de formación de imágenes y las células se incuban durante 14 hr.
Criti Cal pasos dentro del Protocolo
El paso crítico para la evaluación de la perturbación inducida por calor es el estado de las células antes del experimento de formación de imágenes. Los estudios en levadura mostraron que las células adquieren resistencia a una variedad de problemas ambientales durante la fase estacionaria 13. También se observó la capacidad de respuesta mínima al estrés térmico aplicado si D. discoideum células habían alcanzado la fase estacionaria antes de la imagen. Por lo tanto, el mantenimiento de un número constante de celda <5 x 10 5 células / ml es crítica.
Por otra parte, el número de células altas pueden inducir la transición del ciclo vegetativo de D. discoideum con el ciclo de desarrollo, lo que desencadena vías de hambre, lo que podría dar lugar a una respuesta diferente al estrés por calor. Si se alcanzan altos números de células en la fase de recuperación después de estrés por calor, streaming y células de agregación pueden interferir con el análisis de datos como las células se mueven fuera de foco (véase la Figura 4).
contenido "> limitación de la técnicaLa pérdida de enfoque es el cuello de botella del protocolo. Durante los cambios de temperatura, el plano focal puede cambiar drásticamente, lo que requiere reorientación manual en un período de tiempo inmediatamente después de cambiar la temperatura. El salto en el enfoque a veces puede ser demasiado extrema para ser vencido por el enfoque automático de software, especialmente si el tiempo entre los puntos de tiempo es alta. Sin embargo, si el microscopio usado está equipado con un enfoque automático hardware, este cuello de botella puede ser evitado.
Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes
En comparación con las configuraciones existentes, tales como el uso de habitaciones con aire acondicionado, cajas de incubación a temperatura controlada relativas a los objetivos y las etapas platina del microscopio o con control de temperatura y collares objetivos, el uso de una cámara de enfriamiento proporciona un control más preciso del ambiente temperatura. El elemento Peltier en la cámara de refrigeración puede mantener una tem constante y uniformetura a lo largo de la configuración experimental. En configuraciones clásicas, las diferencias de temperatura locales podrían dar lugar a resultados diferentes de observación. Además, se puede responder de forma rápida y rápidamente a los cambios inducidos en la temperatura, mientras que las configuraciones clásicas se adaptan muy lentamente a los cambios inducidos por la temperatura, especialmente la reducción de la temperatura. El elemento Peltier en la cámara de enfriamiento también puede cubrir una gama más amplia de temperatura (15-40 ° C) que las configuraciones clásicas, con el que las temperaturas que alcanzan tales como 15 ° C o 40 ° C es muy difícil.
Dictyostelium discoideum es particularmente sensible a la foto-toxicidad. Estudios previos han usado ascorbato como eliminador para reducir la fototoxicidad. Sin embargo, los períodos de formación de imágenes largas requieren suplementos adicionales. Por otra parte, el uso de ascorbato se limita a estudios en los que el mecanismo de interés no se ve afectada por el suplemento antioxidante. Proponemos que la imagen de temperatura controlada se puede utilizar como una alternativa aproxoach para minimizar foto-toxicidad y se podría combinar con la adición de ascorbato para disminuir aún más la toxicidad.
efectos fototóxicas pueden minimizarse proporcionando una temperatura constante y uniforme de 23 ° C usando una cámara de enfriamiento. Las células imágenes utilizando el control de temperatura muestran menos signos de foto-toxicidad, tal redondeo celular, por un período de tiempo más largo. Esto también permite obtener imágenes con intensidades más altas, intervalos de tiempo más cortos o más campos de visión (FOV).
Aplicacion General
El estrés por calor a temperaturas más altas se ha demostrado para desencadenar una respuesta de estrés diferente de calor 14. Por lo tanto, aumentando la temperatura hasta 34 ° C o 37 ° C podría inducir una respuesta diferente. Además del estrés temperatura aplicada, la duración de una situación de estrés en particular puede ser modificado para estudiar la respuesta inmediata o adaptación a largo plazo al estrés por calor.
En general, el protocolo descrito puede serexpandido a una amplia gama de aplicaciones. Dado que el control preciso de la temperatura reduce considerablemente efectos de foto-tóxico, el protocolo se puede utilizar en entornos que requieren altos tiempos de exposición y / o intensidades de luz de excitación más altos, por ejemplo, para la visualización de las proteínas con un bajo nivel de expresión, o en combinación con intervalos de tiempo cortos entre las imágenes, por ejemplo, cuando se toman imágenes de lapso de tiempo. También puede ser ventajoso para obtener imágenes de objetos que abarcan toda la célula, por ejemplo, los microtúbulos, ya que estos ajustes requieren un alto número de z secciones ópticas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
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