Introduction
Dictyostelium discoideum são solitários amebas de vida do solo que se alimentam de bactérias e outros microorganismos, que são ocupados por fagocitose. Ele tem um ciclo de vida único e notável que tem sido uma importante área de pesquisa desde a sua descoberta 1. O interesse no início do desenvolvimento multicelular 2 e as bases moleculares da quimiotaxia 3 logo foi complementada por estudos sobre motilidade celular, polaridade celular, imunidade inata. Além disso, D. discoideum foi introduzido como um sistema modelo para 4,5 pesquisa biomédica.
Recentemente, estabelecemos D. discoideum como um novo sistema para estudar a 6,7 sistema de controle de qualidade da proteína (PQC). Sua proteoma é enriquecida com proteínas prião-como agregação-prone, o que representa um desafio a proteína de controlo de qualidade 8. Para investigar se a D. discoideum desenvolveu mecanismos moleculares especiais para controlar a sua altamente agproteoma congregação propensas, estudamos o comportamento de proteínas marcadoras de agregação propensas tanto em condições normais de crescimento e durante o estresse. Condições de estresse, tais como estresse por calor, pode ser usado para aumentar a taxa de proteína misfolding 9. Portanto, buscamos um sistema em que poderia induzir mudanças de temperatura e ao mesmo tempo seguir o comportamento de proteínas marcadoras. Para este efeito, combinamos de imagem de células vivas com aquecimento controlado por Peltier usando um (câmara de refrigeração) inserção fase térmica. Este método permitiu-nos manter a temperatura constante e uniforme, bem como para induzir uma mudança rápida, ainda preciso da temperatura.
Processamento de imagem de células vivas, são utilizados para estudar uma variedade de processos biológicos em D. discoideum. No entanto, esta abordagem enfrenta dois grandes limitações. Em primeiro lugar, as células apresentam uma alta mobilidade e tendem a migrar para fora do campo de visão, rastreando assim de células individuais muitas vezes requer imagiologia de uma grande área. A mobilidade celular podeser reduzida em Agar sobreposição 10, no entanto, estas condições não são adequadas para a imagem latente a longo prazo devido a um declínio na viabilidade. Em segundo lugar, D. células discoideum mostram uma sensibilidade particularmente elevada para foto-toxicidade, o que resulta no arredondamento celular e 11 de paragem da mitose. Protocolos anteriores abordou esta questão através da adição de ácido ascórbico como um limpador radical e redução da exposição vezes 12. Esta última pode ser importante se a proteína de interesse é expressa em níveis baixos e mostra um sinal de fluorescência fraca. Os autores sugerem também para proporcionar uma temperatura constante de 21 ° C, quer por imagem em um quarto com ar condicionado ou utilizando caixas de incubação com temperatura controlada, que cobrem o objetivo e microscópio estágio 12.
Aqui, nós descrevemos um método com um controlo melhorado da temperatura usando uma câmara de arrefecimento ajustado a 23 ° C. Durante a gravação nosso set-up aumenta significativamente a resistência à foto-toxicidade. istopermite a utilização de tempos de exposição mais elevadas e intensidades de luz de excitação mais elevados. Isto é de particular importância durante a imagem de lapso de tempo, como os intervalos de tempo precisa de ser cuidadosamente equilibrado contra o número de posições representada por imagem e o tempo de exposição utilizado. A possibilidade de aumentar o número de posições fotografada também permite que a cobertura de uma área de imagem mais largo e facilita a identificação de células individuais ao longo de um período mais longo de tempo.
Protocol
1. Preparação de células
- células em crescimento
- Crescer D. discoideum células em meio AX, a 23 ° C sob luz em placas de cultura de tecidos. Evitar a manter as células em densidades elevadas superiores a 75% de confluência.
NOTA: Para uma resposta óptima ao estresse por calor, as células precisam estar em fase de crescimento exponencial e não deve ter atingido fase estacionária. - No dia antes de imagem, as células divididas em média de fluorescência baixa (LFM) para 1 x 10 4 células / ml.
NOTA: Este passo é necessário para reduzir a fluorescência de fundo causado pela forma AX. O tempo de incubação pode ser reduzida a um mínimo de 2 horas. No entanto, as vesículas retomadas em meio AX ainda pode gerar algum sinal de fundo após 2 horas.
- Crescer D. discoideum células em meio AX, a 23 ° C sob luz em placas de cultura de tecidos. Evitar a manter as células em densidades elevadas superiores a 75% de confluência.
- Preparar células para microscopia
- Antes de imagem, as células colheita da placa de tecidos em LFM e transferir um número adequado de células em placas com fundo de vidro.
NOTA: Normalmente,1 x 10 5 células / ml é suficiente; No entanto, se a configuração experimental requer períodos longos de imagiologia (mais de 8 horas), o número de células precisam ser cuidadosamente ajustado, conforme D. células discoideum fará a transição para o ciclo de desenvolvimento e começar a transmitir e global caso o número de células são elevados enquanto os nutrientes são baixos. - Permitir que as células se contentar com 20 min. Remover as células não-liquidadas, substituindo cuidadosamente o meio utilizado por meio fresco.
- Antes de imagem, as células colheita da placa de tecidos em LFM e transferir um número adequado de células em placas com fundo de vidro.
2. Imagiologia
NOTA: O protocolo pode ser utilizado em sistemas de campo amplo, bem como em instalações de microscopia confocal. O uso de uma caixa de incubação com temperatura controlada, que inclui os objectivos e platina do microscópio é útil, mas não essencial para o controlo da temperatura. A temperatura da caixa de incubação é definido como a temperatura mais alta utilizada na experiência, por exemplo, a 40 ° C se o stress térmico é realizado. Caso contrário, a temperatura é ajustada a 256; C. As mudanças de temperatura devem ser feitas com antecedência para permitir que o sistema se adapte, como mudanças de temperatura durante a imagem pode afetar o foco.
Nota: Durante a gravação, a temperatura é controlada usando uma câmara de arrefecimento. A temperatura padrão para imagens células não-estressado é de 23 ° C. As condições de stress de calor, a temperatura é aumentada de acordo com o nível desejado. O elemento piezoeléctrico na câmara de refrigeração pode responder muito rapidamente à mudança de temperatura. No entanto, o foco das imagens irá alterar ligeiramente (ele pode desviar-se para até 20 uM dependendo da mudança de temperatura). Assim reorientação manual é necessária dentro dos primeiros minutos de aquisição de imagem, a menos que o microscópio utilizado está equipado com um auto-foco de hardware.
- Aquisição de imagem em condições não-estressados
- células de imagens em condições não-salientou a 23 ° C, adquirir um mínimo de 6 campos de visão (FOVs).
NOTA: condição de não-estresse pode ser visualized quer através da gravação de um curto lapso de tempo (5-30 min) ou aquisição de fotografias representativas. Para cada linha de estado ou de células adquirem um mínimo de 6 campos de visão (FOVs).
Nota: Em caso de células individuais são de interesse, a posição das respectivas células no meio do FOV e gravar uma série ladrilho 3 x 3 com o FOV que contém as células de interesse no meio D.. células discoideum são móveis e podem migrar para fora do FOV. No entanto, a série telha 3 x 3 aumenta a área potencialmente explorado pela célula de interesse e continua a ser rastreáveis por períodos de lapso de tempo de ~ 6 horas. - Adquirir z pilhas de máximo de 7 um em 1-0.25 uM passos para capturar todo o volume da célula.
- Adquirir uma imagem de referência brilhante campo para avaliar o número total de células.
- células de imagens em condições não-salientou a 23 ° C, adquirir um mínimo de 6 campos de visão (FOVs).
- Aquisição de imagem para o stress de calor
- Ajustar a temperatura da câmara de arrefecimento para 30 ° C de acordo com as instruções do fabricante. </ Li>
- Após a indicação de temperatura atingiu o valor desejado, reorientar manualmente no canal de campo claro e verificar todos os FOVs gravadas antes de iniciar o lapso de tempo.
- Iniciar um lapso de tempo de 4 horas de estresse de calor com um intervalo de tempo de 5-10 min entre momentos de tempo. Verificar a existência de focagem correcta durante a aquisição dos dois primeiros pontos de tempo.
- Aquisição de imagem durante a recuperação
- Depois de estresse por calor, reduzir a temperatura volta a 23 ° C, espere o indicador de temperatura para ajustar e reorientar manualmente.
- Gravar filmes de lapso de tempo na fase de recuperação para 8-10 h em intervalos de tempo mínimo de 10-20. Verificar a existência de focagem correcta durante a aquisição do primeiro ponto de tempo.
Análise 3. Imagem
NOTA: Para a quantificação do número de células contendo focos citosólica, avaliar o número total de células e o número de células com focos citosólico em cada momentoquadro. Devido à dificuldade de segmentar células a partir de imagens de campo claro, a quantificação precisa de ser feito manualmente. A seguir, a análise dos dados é descrito para o pacote de processamento de imagem free ((http://fiji.sc/Fiji). Ele requer o plug-in "Cell Contra" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
- Avaliando número total de células
- Carregar o brilhante pilha de campo (XYT), clicando em "Arquivo" e "Open".
- Abra a "célula Contador" plug-in ( "Plugins" - "Cell Contra"). Carregar a pilha de imagens, clicando em "Inicializar".
- Escolha o tipo apropriado de contadores, assinalando a caixa apropriada.
NOTA: O uso do tipo 1 como contador para o número total de células e tipo 2 como contador para células com focos citosólica. Contagem de todas as células. - Salvar os marcadores clicando em "Salvar marcadores".
- A avaliação do número de células com focos citosólica
- <li> Coloque o hyperstack imagem de fluorescência (XZYT) ( "File" - "Open") e fazer uma projeção de intensidade máxima usando o "Z-Projector" (Imagem / Stacks).
- Abra a "célula Contador" plugin. Carregar a pilha imagem resultante (XYT), clicando em "Inicializar".
- Coloque os marcadores clicando em "Marcadores de carga".
ATENÇÃO: Os nomes da imagem de referência ea pilha de fluorescência de arquivo deve ser idêntico. Se necessário, mudar o nome de conformidade antes de inicializar a pilha de imagem. - Escolha o tipo de marcador apropriado (ver 3.1.3) e contagem de células com focos citosólica. Os marcadores existentes podem ser utilizadas como guia para a posição das células individuais.
- Recuperar o número de contagens por fatia, clicando em "Resultados" e salvar as contagens em outra parte para outros cálculos.
Representative Results
O protocolo de imagem descrito pode ser usado para analisar o comportamento de proteínas prião-como agregação propensa na ameba D. discoideum durante o stress de calor. A Figura 1 mostra a distribuição de Q103 proteína poliglutamina GFP em células sob condições de crescimento normais (Figura 1A), após 2 horas de stress de calor a 30 ° C (Figura 1B) e depois de 6 horas de recuperação de stress e crescimento em condições de crescimento normal (Figura 1C). Após o aumento da temperatura de 23 ° C a 30 ° C, o marcador de Q103-GFP funde a partir de uma distribuição difusa para estruturas puntiformes. Após a liberação do stress e crescimento à temperatura normal, estas estruturas se dissolver. A redistribuição de Q103-GFP e formação de calor focos citosólico induzido pelo estresse pode ser quantificada usando análise de imagem. A Figura 2A mostra a análise da FOVs individuais usando Fiji eo plug-in "Cell counter ". A figura 2B mostra a quantificação da resposta ao estresse de calor. Isto mostra que o aumento focos Q103-GFP citosólico em número com a continuação estresse por calor. Durante o estresse de calor, o controle de qualidade da proteína do sistema (PQC) é sobrecarregado, assim aggregation- proteínas propensas tais como a Q103 proteína prião semelhante não pode ser mantido num estado solúvel e cada vez mais agregado em focos citosólica. as células também mostram um aspecto arredondado, como representado na Figura 1B. a redução de focos citosólica após a remoção de stress sugere que o agregado proteínas são dissolvidas.
A qualidade de imagem é sensível à densidade celular inicial. A Figura 3 mostra um exemplo de células após a recuperação de stress, comparando a densidade inicial de células apropriado (Figura 3A) e a densidade celular inicial elevada (Figura 3B). Se a densidade celular inicial era demasiado elevado, as células de estrelaTed para formar correntes tal como ilustrado na Figura 3b. Este que impõe dificuldades na quantificação subsequente como as células se mudaram para fora do plano focal.
O método descrito pode ser usado para monitorar mudanças induzidas pela temperatura, como descrito acima. Ele também pode ser usado para reduzir o foto-toxicidade quando imagiologia à temperatura de crescimento fisiológico. A Figura 4 mostra uma comparação de células fotografada a 23 ° C numa câmara de arrefecimento (Figura 4A) e células fotografada sem controlo de temperatura num quarto com ar condicionado, definir a 25 ° C (Figura 4B). Após a exposição constante à luz de excitação, as células arredondar para cima quando não estiver fotografada em condições de temperatura controlada. Esta mudança na forma da célula está indicando stress.
Figura 1:
Figura 2: Quantificação de formação de focos citosólico induzido pelo calor (A) Análise de células usando o pacote de processamento de imagem livre de Fiji eo plug-in "Cell Contador".. A quantidade total de células (tipo 1, azul marcadores de balcão) é determinado na imagem de campo claro. Os marcadores são carregados no GFP-canal e o número de células com focos citosólica (tipo 2, marcadores vermelhos contador) é determinada. (B) Quantificação de focos após 3 horas de estresse por calor a 30 ° C e 3 horas de recuperação de stress a 23 ° C (n = 4 campos de visão, o erro bar = SD). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4:. Efeito de controlo de temperatura em efeitos fototóxicos (A) células trabalhada durante 10 min com controlo de temperatura a 23 ° C: 6 campos de visão, Z-pilha (espaçamento de 0,5 uM, espessura da amostra 8 uM), lapso de tempo (total tempo 10 min, lapso 1 min), o canal de GFP (0,07 tempo de exposição mseg, 10% de intensidade de laser), o canal de RFP (0,1 mseg tempo de exposição, 10% de intensidade de laser). As células não mostram sinais de que as alterações morfológicas características associadas ao estresse fototoxicidade. (B) As células fotografada por 10 minutos, sem controle de temperatura (mesmas condições que no A). As células apresentam sinais de fototoxicidade induzida arredondamento, indicando stress. Barra de escala = 10 mm. As células foram fotografadas num sistema baseado num microscópio com uma objectiva 100x / 1.4 abertura numérica (NA). As imagens foram coletadas com uma câmera CCD de 1.024 x 1.024 pixels arquivos usando 1 x 1 binning.4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para estudar o comportamento de uma proteína de interesse particular, em resposta ao stress induzido por calor. O aumento de temperatura para 30 ° C tem sido relatado para desencadear resposta de stress de calor e sob estas condições, a viabilidade de D. discoideum é marcadamente reduzida.
modificações
O protocolo pode ser modificado para comparar o comportamento de proteínas diferentes sob as mesmas condições de stress. Para isso, as células que expressam diferentes proteínas com a mesma etiqueta fluorescente são transferidos para placas de multi-poços, tal como quatro pratos de câmara (secção 1.3.1). O protocolo também pode ser aplicada em células de proteínas com diferentes marcadores, tais como GFP ou RFP que co-expressam. Isto pode ser por exemplo utilizado para monitorar o comportamento de diferentes componentes do sistema de controlo de qualidade de proteínas (PQC). As células que expressam marcador agregação GFP-marcadas e diferentes componentes PCQ marcado-RFP pode ser observado usando multi-bemcôncavo para a imagem latente. Isso garante as mesmas condições de estresse (velocidade de aumento da temperatura / diminuição, a duração da temperatura aumento / diminuição) e permite a realização de estudos comparativos.
Além disso, o protocolo pode ser utilizado para estudar a influência do sistema de PQC na resposta ao stress de calor. A actividade dos componentes pode ser modulada pela alteração dos níveis de expressão utilizando ferramentas genéticas, tais como knock-out ou a sobre-expressão ou utilizando inibidores específicos disponíveis comercialmente 6. O proteassoma pode ser inibida pela adição de MG132 (100 uM) ou lactacistina (10 uM) ao meio de crescimento. O acompanhante Hsp90 pode ser inibida utilizando geldanamicina (6 uM), ou do radicicol (10 uM). O acompanhante Hsp70 pode ser inibida com VER-155088, embora não pudemos confirmar a eficácia da inibição em nossas configurações experimentais até agora. Inibidores deve ser adicionado um dia antes de imagem e as células são incubadas durante 14 horas.
Criti Passos cal no âmbito do Protocolo
O passo crítico para a avaliação da perturbação induzida pelo calor é o estado das células antes da experiência de imagem. Estudos em leveduras demonstraram que as células adquirem resistência a uma variedade de stresses ambientais durante a fase estacionária 13. Observou-se também a capacidade de resposta mínima ao estresse térmico aplicado, se D. células discoideum tinha atingido fase estacionária antes da imagem. Por conseguinte, a manutenção de um número constante de célula <5 x 10 5 células / ml é crítica.
Além disso, o número de células elevadas pode induzir a transição do ciclo vegetativo de D. discoideum com o ciclo de desenvolvimento, desencadeando assim as vias de fome, o que pode levar a uma resposta diferente ao estresse térmico. Se o número de células altas são alcançadas na fase de recuperação após o estresse de calor, streaming e células agregando pode interferir com a análise de dados como as células se movem fora de foco (veja a Figura 4).
content "> limitação da técnicaA perda de foco é o gargalo do protocolo. Durante a mudanças de temperatura, o plano focal pode mudar drasticamente, o que requer reorientação manual num período de tempo imediatamente após a alteração da temperatura. O salto do foco pode ser por vezes demasiado extremo a ser superado por focagem automática do software, especialmente se o tempo entre os pontos de tempo é alta. No entanto, se o microscópio utilizado está equipado com um hardware de focagem automática, esse gargalo pode ser contornado.
Importância da Técnica em Matéria de métodos existentes
Em comparação com configurações existentes, tais como o uso de quartos com ar condicionado, caixas de incubação de temperatura controlada, relativos aos objectivos e as etapas de palco microscópio ou com temperatura controlada e colares objetivos, o uso de uma câmara de resfriamento proporciona um controle mais preciso do ambiente temperatura. O elemento de Peltier na câmara de refrigeração pode manter uma TEM constante e uniformeratura em toda a configuração experimental. Em configurações clássicas, diferenças de temperatura locais pode levar a resultados diferentes de observação. Além disso, ele pode responder rapidamente e rapidamente a mudanças induzidas na temperatura, enquanto instalações clássicas adaptar-se muito lentamente a mudanças de temperatura induzidas, especialmente a diminuição da temperatura. O elemento de Peltier na câmara de refrigeração pode também cobrir uma gama mais ampla de temperatura (15-40 ° C) do que instalações clássicas, com as quais as temperaturas que alcançam, tais como 15 ° C ou 40 ° C é muito difícil.
Dictyostelium discoideum é particularmente sensível a foto-toxicidade. Estudos anteriores utilizaram ascorbato como limpador para reduzir foto-toxicidade. No entanto, períodos de imagem longos exigem suplementação adicional. Além disso, o uso de ácido ascórbico está limitado a estudos em que o mecanismo de interesse não é afectado por o suplemento de antioxidante. Propomos que a imagem de temperatura controlada pode ser utilizada como uma alternativa aproxoach para minimizar foto-toxicidade e pode ser combinado com a adição de ácido ascórbico para diminuir ainda mais a toxicidade.
efeitos fototóxicos pode ser minimizado através de uma temperatura constante e uniforme de 23 ° C utilizando uma câmara de arrefecimento. Células fotografada usando controle de temperatura mostram menos sinais de foto-toxicidade, esse arredondamento celular, por um período de tempo mais longo. Isso também permite imagens com maior intensidade, intervalos de tempo menores ou mais campos de visão (FOVs).
Aplicação geral
O stress térmico a temperaturas mais elevadas tem sido mostrado para desencadear uma resposta de stress de calor diferente 14. Portanto, aumentando a temperatura para 34 ° C ou 37 ° C podem induzir uma resposta diferente. Em adição ao stress de temperatura é aplicado, a duração de uma situação de stress particular pode ser modificado para estudar a resposta imediata ou adaptação a longo prazo a stress térmico.
Em geral, o protocolo pode ser descritoexpandiu-se para um amplo conjunto de aplicações. Uma vez que o controle preciso da temperatura reduz consideravelmente os efeitos foto-tóxicas, o protocolo pode ser utilizado em ambientes que exigem tempos de exposição elevada e / ou intensidades de luz de excitação mais elevadas, por exemplo, para visualizar as proteínas com um nível de expressão baixo, ou em combinação com intervalos de tempo curtos entre imagem, por exemplo, durante a imagem time-lapse. Também pode ser vantajoso para imagiologia de objectos que abrangem toda a célula, por exemplo, os microtúbulos, uma vez que estas configurações necessitam de um elevado número de z-secções ópticas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartment glass-bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
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