Abstract
Subretinal injektioner med succes er blevet brugt i både mennesker og gnavere til at levere terapeutiske interventioner proteiner, virale agenter og celler til interphotoreceptor / subretinal kabine, som er direkte udsættelse for fotoreceptorer og retinale pigment epitel (RPE). Subretinal injektioner af plasminogen samt seneste prækliniske og kliniske forsøg har vist sikkerhed og / eller effekt levere virale vektorer og stamceller til personer med fremskreden retinal sygdom. Musemodeller for retinal sygdom, især arvelig retinal dystrofier, er afgørende for at teste disse behandlinger. Den mest almindelige injektionsprocedure hos gnavere er at bruge små transcorneal eller transcleral indsnit med en forreste tilgang til nethinden. Med denne fremgangsmåde, kanylen trænger den neurosensoriske nethinde forstyrre underliggende RPE og indsættelse kan nemt nick linsen, der forårsager linseuklarhed og nedskrivninger på ikke-invasiv imaging. Adgang til subretinarummet via en transcleral, posterior tilgang undgår disse problemer: nålen krydser sclera ca. 0,5 mm fra den optiske nerve, uden retinal penetration og undgår at forstyrre glaslegemet. Collateral skaden er begrænset til, at forbundet med kontaktpunktet sklerotomi og virkningerne af en forbigående, serøs nethindeløsning. Enkeltheden af metoden minimerer okulær skade, sikrer hurtig retinal refiksation og nyttiggørelse, og har en lav dumpeprocent. Den minimale skader på nethinden og RPE muliggør klar vurdering af effekten og direkte effekter af de terapeutiske midler selv. Dette håndskrift beskriver en hidtil ukendt subretinal injektion teknik, der kan anvendes til at målrette virale vektorer, farmakologiske midler, stamceller eller induceret pluripotente stamceller (IPS) celler til subretinarummet i mus med høj effektivitet, minimal skade, og hurtig genopretning.
Introduction
Subretinal injektioner er det primære middel til at levere cellulære og virale agenter til nethinder af mus til at undersøge deres virkninger på fotoreceptorer og underliggende RPE 1,2. De fleste subretinal injektion protokoller hos mus bruger en transcorneal eller et transcleral injektionsstedet anterior til ækvator (figur 1). Denne fremgangsmåde kan resultere i iboende indirekte skader, som omfatter huldannelse og resulterende uklarhed af linsen, afbrydelse af integriteten af glaslegemet, penetration af neurosensoriske nethinde og iris, retinal blødning, betydelige retinaløsninger og varig subretinal ødem 3-9. Eksperimentelle manipulationer skal overvinde disse effekter for at vurdere effekten af terapeutiske interventioner 3,7,10,11. Denne undersøgelse giver en detaljeret beskrivelse og validering af en posterior transcleral injektion metode, der undgår disse komplikationer, minimerer traume og har en høj succesrate for at målrette subretinal plads.
Injektioner målrettet mod subretinarummet i mus er ofte meget vanskeligt at udføre, og de fleste forskere støder på en høj frekvens af mislykkede forsøg, hvor vektoren, som leveres til en forkert placering, eller der er betydelig beskadigelse af nethinden, for eksempel i en fuldstændig nethindeløsning 6. Antallet af øjne er udelukket fra analysen på grund af injektion komplikationer typisk ikke rapporteret i muse studier, men i vores egne erfaringer og i samarbejde med andre forskere, kan antallet af mislykkede injektioner være så høj som 50% og varierer afhængig af erfaring og kapaciteter af investigator, der udfører injektioner. Succesen af injektionen typisk vurderes ved direkte fundus billedbehandling og / eller optisk kohærens tomografi (OCT) 7,9. En let mestret metode med høj succesrate for subretinal injektioner i mus kan fremskynde eksperimenter og reducere omkostningerne ved prækliniske studier af treatments for retinale sygdomme, der er vigtige årsager til blindhed i USA.
Den bageste, transcleral beskrevet her subretinal injektionsteknik er en tilpasning fra kliniske og prækliniske protokoller 9,12. De invasive diagnostiske vurderinger foretaget i injicerede mus demonstrerer mild og meget lokal skader og mangler yderligere sikkerhed linse, retinal og RPE skade. Desuden vil der med relativt lidt praksis, kan en eksperimentator opnå disse resultater med en høj succesrate (80 - 90% eller bedre) og dermed reducere omkostningerne i forbindelse med sådanne undersøgelser. Denne procedure kan anvendes til at levere cellulære, virale, eller farmakologiske terapeutiske interventioner til fotoreceptorer og / eller RPE i prækliniske undersøgelser og til nemt vurdere eksperimentelle interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr: Vild typen C57BL / 6J mus avlet ved University of California i Los Angeles (UCLA). Alle dyr var mellem 11 - 17 uger gammel, og omfattede mandlige og kvindelige mus. Alle mus var i grupper, holdt i en 12:12 lys / mørke cyklus med mad og vand ad libitum. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer UCLA og Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi Erklæring for anvendelse af dyr i Ophthalmic og Vision Research.
BEMÆRK: Alle lægemidler og injicerbare agenter er United States Pharmacopeia (USP) kvalitet.
1. Kirurgisk Forberedelse
- Bedøver musen med en intraperitoneal injektion af 100 mg / kg ketamin og 8 mg / kg xylazin i et saltvand mix. Administrere anæstesi til en sådan dybde, at musen har ingen toe pinch eller hornhinde touch-reflekser.
- Opretholde kroppens temperatur ved 37,0 ° C med en cirkulerende vand pad.
- Spile elever med 2,5% phenylephrin eye dROPS og trim knurhår at lette visualiseringen. Whiskers yde betydelig sanseindtryk til musen derfor whisker trimning bør trækkes kun den mængde, der blokerer klar adgang til øjet, og ikke til bunden af knurhår. Det er vores erfaring, mus viser normale bedring efter denne procedure. Påfør methylcellulose øjendråber at forhindre tørhed og minimere anæstesi inducerede forbigående grå stær 13.
- Sterilisere instrumenter før operation (dvs. Betadine og ethanol eller varme kugler).
- Forbered fortyndet fluorescein (0,01% ved anvendelse af 0,9% saltvand) i et sterilt miljø (dvs. biosikkerhed kabinet) hvis visualisering vil blive udført (se afsnit 3 nedenfor).
2. injektionsstedet Forberedelse
- Forbered en sprøjte (f.eks 5 pi sprøjte) med den passende injektionsvolumen (f.eks 0,3 til 1,0 gi).
- Anbring musen så øjet vender opad og klart synlige i dissecting mikroskop.
- Klem forsigtigt den tidsmæssige conjunctiva med fine tippet pincet. Lav en periferisk snit på ca. 90 ° ved hjælp af buede Vännäs saks.
- Gentag trin 2.3 med den underliggende Tenons kapsel.
- Resektion det omgivende bindevæv med fine tippet pincet, mens du roterer kloden nasalt. Arbejde for injektionsstedet ca. 0,5 mm tidsmæssig til synsnerven. Brug stor omhu for at undgå at forstyrre retro-orbital sinus.
3. sklerotomi og subretinal Injection
BEMÆRK: Det anbefales, at injektion af 0,01% fluorescein i 0,9% saltvand bruges til at hjælpe med visualisering mens lære denne procedure. Den topografiske fordeling af fluorescein effektivt kan dokumenteres med fundus imaging (se afsnit 4 nedenfor).
- Lav en lille skleral snit på injektionsstedet ved forsigtigt skrabe øjestykket med en 22,5 graders oftalmologiske klinge. Denne snit should kun være store nok til at tillade spidsen af nålen at passere gennem sclera.
- Indsæt det afskårne 33 G nål (vinklet 5 -. 10 ° ind i sklerotomi med facet står og vinklet parallelt med nethinden indsprøjtes ønskede volumen (f.eks 0,3 til 1,0 pi 0,01% fluorescein til læring formål).
BEMÆRK: opretholde sterilitet af sprøjten ved grundig rensning med successive vaskninger med et egnet opløsningsmiddel og DI vand før hver injektion. - Tryk stemplet langsomt (over ~ 3 sek) uden at flytte nålen og med jævnt tryk.
BEMÆRK: Når nålen er i subretinarummet, vil en let modstand mærkes, mens at trykke på stemplet. Der vil ikke være til minimal modstand, hvis nålen punkterer nethinden, og høj modstand, hvis nålen ikke trænger sclera eller RPE. - Vent nogle sekunder før nålen trækkes for at minimere tilbageløb.
- Skyl øjet med sterilt saltvand og sikre øjet hsom drejes tilbage til sin normale position.
4. Vurdering af Nethindeløsning af OLT Fundus Imaging
- Udfør billedkvaliteten ved OCT umiddelbart efter injektion for at evaluere kvaliteten af injektionen og ved passende tidspunkter efter injektion efter behov for at vurdere retinal struktur.
BEMÆRK: Eksempler på anvendelsen af OLT lignende undersøgelser er tidligere blevet beskrevet 7,14.- Juster og tilpasse OLT billedet for at målrette injektionsstedet. Den injektionsstedet bør være midterlinjen og 0,5 mm tidsmæssig til synsnerven. Gentag efter behov, hvis udstationering er ude af ramme eller ikke optimalt centreret.
- Visualiser nethindeløsning og farvestof injektion med en-face fundus imaging 7,14.
BEMÆRK: Hvis et OLT imaging system ikke er tilgængeligt, vil injektion af en lille mængde fluorescein med en vektor for praksis tillade visualisering med enhver fundus kamera, der udfører fluorescein angiografi under anvendelse af de samme excitationsbølgelængder og blokering filtre. Lokaliserede områder med hyper-fluorescens vises nedenunder vaskulaturen og vaskulaturen vil have skarpe og tydelige grænser, hvis subretinarummet målrettes korrekt. Kanten af bleb fra injektionen, vil blive afgrænset af overgangen fra hyper hypo- fluorescens. Flere instrumenter giver denne evne til musen; instrumentering bruges her er beskrevet andetsteds 14.
5. Postoperativ pleje
- Påfør et tykt lag af triple antibiotisk oftalmisk creme til hornhindeoverfladen af det injicerede øjet.
- Placer mus i rene ensomme bure til nyttiggørelse. Bland ikke mus, der har gennemgået operation, indtil de er fuldt tilbagebetalt.
- Overvåg respiration og temperatur under anæstesi opsving. Overvåg dyr, indtil de kan opretholde brystleje.
- Udfør yderligere passende postoperativ overvågningog behandling, herunder en subkutan injektion af carprofen (5 mg / kg) for postoperative smertebehandling.
6. Vurdering af nethindens funktion ved Elektroretinografi (ERG)
- Udfør ERG analyse pre-injektion og på passende tidspunkter efter injektion efter behov for at vurdere retinal funktion. Hvis injektionen blev gjort til subretinarummet bør nethindeløsning løse inden 72 timer.
- Brug standard ERG teknikker til at vurdere retinal funktion før og efter injektion som beskrevet tidligere 14,15.
7. 3D Genopbygning og Bleb Volume Kvantificering
BEMÆRK: Oct scanninger med høj kontrast omfatter hele frigørelse inden for rammerne af visningen er optimale til brug. ImageJ / Fiji 17,18 og Imaris blev anvendt, men andre software kan bruges.
- Eksporter b-scanning af interesse, import til ImageJ / Fiji og afgrøde (Billede> Beskær) den del af OLT scen skal modelleres ved hjælp af den rektangulære markeringsværktøj.
- Juster kontrasten (Image> Juster> Lysstyrke / Kontrast) og afgrænse eventuelle manglende grænser ved at forbinde to sektioner med en linje.
- Tegn en lige linje med den linje værktøj (holder shift), der spænder over RPE til fotoreceptorlaget. Mål (Analyser> Measure) længden af linjen for at få størrelsen af maksimal distance til trin 7.8.
- Import beskåret rammer til 3D-rekonstruktion software (Se tabel of Materials) ved hjælp af "RGB til grå" plugin og Matlab Compiler Runtime.
- Indstil voxelstørrelsen (under Billedegenskaber) ved hjælp af kalibreringsparametre fra OLT scanning (x, y, z).
- Udfør "RGB til Gray" plugin (under Billedegenskaber), med lige vægtning til hver kanal, for at skabe en fjerde kanal. Slet original rød-grøn-blå kanaler.
- Vend grå kanal ved hjælp kontrast forandring. Store billede.
- Klik på "tilføj enew overflade "knappen i fanen 3D-visning, og begynde den guidede 4 trin processen med at skabe overfladen.
- Indstil detalje overfladen niveau (trin 1 af 4).
BEMÆRK: I vores erfaring 8,0-12,0 var den mest effektive område. - Indstil den maksimale sfære størrelse (under Background Selection) til lidt mindre end den maksimale distance størrelse målt i 7.1.2. Opret overfladen og fortryde grå kanal inversion (trin 2 af 4).
- Indstil tærsklen til den maksimale værdi, så overfladen af de negative rum uden af nethinden og frigørelse ikke kommer i kontakt (trin 3 af 4).
- Indstil filtertype til antallet af voxel og isolere den negative plads i løsrivelse sted efter størrelse. Afslut overfladen (trin 4 af 4).
BEMÆRK: Mængden af den distance overflade er placeret under volumen under fanen statistik.
- Indstil detalje overfladen niveau (trin 1 af 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Posterior transcleral subretinal injektioner blev udført på 31 sunde øjne fra 16 vildtypemus med injektioner af 0,3 pi (n = 18), 0,5 pi (n = 8) og 1,0 pi (n = 5) på 0,01% fluorescein. Det ene øje var udelukket fra injektion på grund af en allerede eksisterende kornea, der forhindrede strukturel og funktionel analyse. Hver injicerede øje er medtaget i denne rapport. Ingen utilsigtede retinaløsninger, blev påvist punkteringer af neurosensoriske nethinde, eller lækage i glaslegemet blev heller ikke tegn på linsen nicking, inflammatoriske responser, uveitis, eller post-kirurgiske infektioner i nogen øjne iagttagne.
Nethindestruktur blev vurderet før injektion, 10 min efter injektion og 4 uger efter injektion ved hjælp af billedkvaliteten ved OCT (figur 2 og 3). En 9-punkts gitter, med midtpunktet ligger over midten af maksimal frigørelse, blev placeret på den 10-minefter injektion en face scanning (Figur 2B). Brug vaskulære vartegn, pre-indsprøjtning og 4-ugers efter injektion scanninger blev roteret for at være i registrering i 10 minutter efter injektion scanning. Dette tillod identifikation af nøjagtig de samme steder i før og efter injektion retinale scanninger (Figur 2A, C).
Subretinal injektioner resulterede i blæredannelse, der var centreret væk fra injektionsstedet, hvor nålen ind i subretinarummet (figur 2B pil), og var enten flade (figur 3A) med en lavvandet løsgørelse strækker sig over et udvidet område eller kuplet (figur 3B - D) med dyb løsrivelse i en indspændt område (tabel 1). En hvælvet bleb blev defineret som enhver udstationering, der oversteg 50 um vinkelret på RPE. Ingen rosetter, en bølget mønster frembragt ved strækning af de ydre retinale lag, blev observeret. extelt af injektion deposition blev visualiseret med en face oktober (figur 2D, stiplet linje), fluorescein fundus billeddannelse (fig 2E) og OLT B-Scanner (figur 3). Størstedelen af bleb'er (29 af 31) forlænget ud over synsfeltet af OLT scanninger, som omfatter ca. 10% af muse nethinden. Der var ingen kontrol over andre end øget hyppighed af kuplede bleb'er med større injektionsvolumener (tabel 1) bleb form. Alle bleb'er løst ved 2 uger (data ikke vist).
Total retinal tykkelse (Bruchs membran til nerven fiberlaget) blev kvantitativt vurderet 4 uger efter injektion i 0,3 pi (figur 3A), 0,5 pi (figur 3B) og 1,0 pi (figur 3C) injektionsvolumener ved hvert punkt på gitteret stede i svarende B-Scanner (tabel 1). Den procentvise forskel (% Δ) wsom beregnet som forskellen i forhold til præ-injektion målinger for både strukturelle og funktionelle målinger. Ikke alle gitterpunkter blev erhvervet under alle billeddiagnostiske sessioner. For eksempel 3 øjne fik en 1 eller 2 point, 4 øjne havde 3 eller 4 point, og 23 øjne havde 5 til 9 punkter i alle scanninger. Kuplede og flade blærer, og injektionsvolumener var kollapset siden samlede retinal tykkelse ikke var signifikant forskellig for præ- og post-injektioner, selv om der blev observeret en generel tendens til retinal udtynding for begge (tabel 2).
Yderligere analyse viste, lille, men statistisk signifikant udtynding af 6,5% ± 1,9 samlet (præ = 196 ± 1, n = 31; post = 183 ± 4, n = 31, T 60 = 3,4, p = 0,001) (tabel 3). At bestemme, hvor retinal udtynding forekom, blev en delmængde af 10 øjne, der indeholdt tykkelsesmåling for alle 9 gitterpunkter analyseret. Svarende til analyse for alle øjne,delmængde af øjne viste også lille, men signifikant samlet retinal udtynding (10,3% ± 3,5, pre = 199 ± 1, n = 10; post = 179 ± 8, n = 10, T 18 = 2,4, p = 0,02). Ingen retinal udtynding blev observeret ved steder distalt for injektionsstedet (7,2% ± 4,0, pre = 199 ± 2, n = 10; post = 185 ± 8, n = 10, T 18 = 1,7, p = 11). Retinal udtynding blev observeret ved stedet for maksimal nethindeløsning (11,2% ± 5,0, pre = 201 ± 2, n = 10; post = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2,1, p = 0,04), injektionsstedet uden beskadigelse (13,8 ± 6,0, pre = 201 ± 1, n = 4; post = 173 ± 10, n = 4, T 6 = 2,8, p = 0,03), injektionssteder med retinal indespærring når en lille region af nethinden er trækkes gennem sclera på nål tilbagetrækning (14,1% ± 1,0, pre = 199 ± 1, n = 3; post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8,9, p = 0,001) og injektionssteder med ardannelse (26,5% ± 1,6, pre = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, T 4 = 5,1, p = 0,007). I alt forekom indespærring i 14 ud af 31 injektioner, hvoraf 3 resulterede i ardannelse af årehinden med tab på op til halvdelen af de ydre retinale lag (figur 3E). I hvert tilfælde dog disse var meget lokaliserede virkninger.
Full-field elektroretinografi blev udført før injektion og gentaget 4 uger efter injektion med relative ændringer vurderes individuelt for hvert øje for at vurdere funktionelle ændringer (tabel 1). Kun mørke tilpasset og stang-medierede reaktioner blev registreret. Intensitet reaktionsfunktioner var udstyret med Michaelis-Menten ligninger til at udlede Vmax for begge fotoreceptorer (a -waves) og den midterste nethinden (b -waves). Responser blev ikke påvirket af bleb form og blev derfor kollapsede (tabel 4). Der var en lille, men statistisk signifikant fald i Vmax påen -waves (F (1, 28) = 7,1, p = 0,013), men ikke b -waves (F (1, 28) = 4,0, p = 0,055) efter injektion (tabel 4). Repræsentative bølgeformer for præ- og post-injektion af 0,3 pi, 0,5 pi og 1,0 pi er vist (figur 4). Der var en effekt af injektion volumen på både en - og b -waves (F (2, 28) = 6,2, p = 0,006 og F (2, 28) = 8,8, p = 0,001, henholdsvis).
Endelig blev 3D-modellering anvendes til at visualisere strukturen i både kuplede og flade bleb'er. Et eksempel på en kuppelformet bleb (figur 5A) viser en kuppelformet væskefyldt løsrivelse indeholdt i scanningsområdet. Eksempler fra flade blærer (figur 5B, C) viser lavvandede væskefyldte områder, der strækker sig ud over regionen af scanningen. Når retinal indespærring sker, er et lille hul i genopbygningen set (figur 5C). Kunstige grænser vises i kanten af en scanning to tillade genopbygning (figur 5C). Beregning af bleb mængder fra disse eksempler injektioner viste, at mindst 0,15 pi og 0,01 pi lykkedes målrettet til subretinarummet i 0,3 pi injektioner resulterer i kuppelformede og flade bleb'er hhv. Den beregnede mængde indsprøjtet sandsynligvis undervurderer det faktiske volumen på grund af opløsning på billedbehandling og genopbygning, resorption af væske under proceduren som opstår i menneskelige subretinal injektioner, og for flade eller kuppelformede bleb'er især, hvis hele distance ikke var repræsenteret i OLT scanninger.
Tabel 1. Funktionelle og strukturelle virkninger af subretinal injektioner af Eye. Metrics enkelte øjne og deres resultater fra subretinal injektioner. Retinale reaktioner på lys (midten nethinden b -waves og fotoreceptor en -waves) og retinal tykkelsesmålinger (Bruchs membran til nervefiberlag) er angivet. Fodnoter:
en BT = Bleb Type, Flat (F) eller kuppel (D)
b #gp = antal gitterpunkter målt
* Eyes anvendes til rekonstruktion af injektion volumen.
** Kun 1 gitterpunkt rådighed til at måle ved ar.
# Eyes med ardannelse.
| Tid | hvælvet Bleb | Flad Bleb | 0,3 pi | 0,5 pi | 1,0 pi | |
| (um) | (um) | (um) | (um) | (um) | ||
| Pre-injektion 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Post-injektion | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Tabel 2. Effekt af subretinal Injektioner på Total Retinal Tykkelse. Analyse af bleb form og injektionsvolumen på retinal tykkelse.
| Tykkelse (um) | |||||
| Webstedet | n (øjne) | Pre | 4 wk | Δ | % Δ |
| Retina (alle overensstemmende punkter) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6,5 ± 1,9 |
| Retina med alle 9 gitterpunkter * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10,3 ± 3,5 |
| Distalt for Injection * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7,2 ± 4,0 |
| Maksimal Detachment * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11,2 ± 5,0 |
| Injektion uden Skader * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13,8 ± 6,0 |
| Indespærring på Injection * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14,1 ± 1,0 |
| Scar ved Injection * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26,5 ± 1,6 |
Tabel 3. Effekt af skader på nethindestruktur. Analyse af stedafhængig retinal udtynding. Fodnoter: * Analyse fra 10 mus med data fra alle 9 gitterpunkter.
| Vmax (μV) | Kuplede (n = 12) | Flat (n = 6) | 0,3 pi (n = 18) | 0,5 pi (n = 8) | 1,0 pi (n = 5) |
| a -waves | |||||
| Pre-injektion | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Post-injektion | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| b -waves | |||||
| Pre-injektion | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Post-injektion | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
inden-side = "1"> T stand 4. Effekt af subretinal Injektioner på scotopic Rod-medieret a - og b -waves. Analyse af bleb form og injektionsvolumen på retinale reaktioner på lys (midten nethinden b -waves og fotoreceptor en -waves).
Figur 1. Skematisk repræsentation af subretinal injektion. En top-down skematisk på en mus øje i soklen viser fremgangsmåden i traditionelle subretinal injektioner, under anvendelse af en transcorneal (pilen A) eller transcleral (pil b) injektionssted nær pars plana. Denne metode anvender en transcleral tilgang nær bageste pol (pilen C), opnås ved at rotere øjet nasalt at blotlægge den posteriore pol.les / ftp_upload / 54.808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Registrering af OLT billeder Giver Identifikation af retinale steder for Tykkelse Analysis. AC, en face oktober billede af mus 1OS i original orientering. A) Billede af nethinden før injektion med smeltet registrering gitter. B) Billede af retina 10 min efter injektion. En 9-punkts gitter blev placeret med midtpunktet på stedet for maksimal nethindeløsning. Injektionsstedet er synlige (pil). C) Billede af nethinden 4 uger efter injektion med smeltet registrering gitter. DE, billeder af mus 9OS. D) En face oktober billede af nethinden 4 uger efter injektion viser strække af subretinal løsrivelse. E)Overlejring af fundus (grøn) og en face OLT billeder af nethinden 10 min efter injektion. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. subretinal injektioner Årsag Midlertidig retinaløsninger med Minimal Retinal Udtynding. Repræsentative OLT B-Scanner på stedet for maksimal nethindeløsning er vist for præ-injektion, 10 min efter injektion og 4 uger efter injektion. A) Dannelse og opløsning af en flad bleb fra en 0,3 pi injektion. B) Dannelse og opløsning af et hvælvet bleb fra en 0,5 pi injektion. C) Dannelse og opløsning af et hvælvet bleb fra en 1,0 pi injektion. D) Eksempel på alvorlig choroidal ardannelse og retinal udtynding på injektionsstedet. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. nethinder Bevar Normal funktion efter Bleb resolution. Bølgeformer for scotopic stang-medierede responser er vist for præ-injektion (sort linie) og 4 uger efter injektion (rød stiplet linie) for A) 0,3 pi, B) 0,5 pi og C) 1,0 pi injektioner på 9 belysning intensiteter spænder fra 4.37 x 10 -6 til 0,51 cd / m2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. 3D rekonstruktion af bleb'er. A) Software-genererede 3D rekonstruktioner af repræsentative A) hvælvet og B, C) flade blærer fra 0,3 pi injektioner. Ribkant er en artefakt af genopbygning software. Kunstige grænser blev placeret i C for at tillade rekonstruktion. Scale bar = 150 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal injektioner er den foretrukne metode til levering af virale vektorer og stamcelle-afledt terapi for at manipulere fotoreceptorer og RPE i både grundforskning og klinisk behandling. Hos patienter, der subretinal injektioner typisk sker med en forreste sklerotomi ved pars plana, en bageste kernevitrektomi og indtrængning af nethinden af nålen med direkte visualisering. Som med de fleste vitrektomi procedurer, er det almindeligt for kataraktdannelse at forekomme tidligt medmindre øjet er allerede pseudophakiske. Hos mus er subretinal injektioner traditionelt udført med sklerotomi anterior til retina, en fremgangsmåde ofte forbundet med både nicking af linsen, som optager størstedelen af den bageste kavitet i øjet, og transretinal penetration, der kan føre til glaslegemet indfangning og fuld retinaløsninger. Ved hjælp af en posterior-tilgang teknik i mus reducerer disse uønskede konsekvenser og forbedrer evnen til at fortolke efeffekter af den tilsigtede manipulation.
Fordele ved subretinal injektionsteknik rapporteret her omfatter minimale strukturelle eller funktionelle effekter og reduceret collateral damage (f.eks uklarhed fra linsen nicking, glasagtige lækker eller inflammation), der tillader lettere vurdering af eksperimentelle resultater og hurtigere helbredelse gange. Denne teknik kræver større manipulation af øjet for at nå den bageste pol, men kan være afsluttet i ca. 10 - 15 min per øje med en høj succesrate som ingen øjne blev forkastet fra analyse. I de fleste injektioner blev den normale retina struktur og funktion observeret inden for 4 uger. Til sammenligning rapporterer tidligere undersøgelser 5 - 8 uger for inddrivelse af struktur og funktion eller ikke rapporterer en restitutionstid 6,7. Derfor kan eksperimenter gennemføres på kortere tid med færre dyr.
Komplikationer af denne subretinal injektionsteknik inkluderet ardannelse og tab affotoreceptorer i ca. 10% af injektioner, med kun tre tilfælde af væsentlige strukturelle og funktionelle mangler. Nethinden bibeholdt normale reaktioner på lys med kun de største ar aftagende funktion til 80% af fotoreceptor respons og 77% af den indre nethinde respons sammenlignet med præ-injektion. Retinale indespærring kan blive reduceret med anvendelsen af en ny nål til hver injektion, selvom dette ikke blev vurderet i den aktuelle undersøgelse. Alternativt kan de forekomme på grund af undertryk og dermed være uundgåelig. Indespærring er meget almindelige i humane subretinal injektioner, men på grund af den store størrelse af øjet, indespærring udgør mindre skade på den samlede nethinden. Betyder, at hvis et terapeutisk middel var blevet injiceret, ville 90% af injicerede øjne er tilgængelige til evaluering af virkningerne af denne intervention.
Variabiliteten i retinale tykkelsesmålinger før og efter subretinal injektion afspejler reproducerbarhed than oktober instrument på mus, præcisionen af tilpasse retinale steder på tværs billeder og retinale ændringer fra injektion af fysiologisk saltvand med lav dosis fluorescein farvestof. Disse målinger kan tjene til at vejlede undersøgere i power beregninger for antallet af øjne og retinale steder er nødvendige for at detektere statistisk valide ændringer som følge af subretinal injektioner hvorvidt et terapeutisk middel er til stede. I de 10 tilfælde, hvor der var 9 gitterpunkter på alle retinale scanninger, variabiliteten af retinal tykkelse uden for injektionsstedet (5 - 8 point pr øjet) var 7,2% ± 4,0%, selv i mangel af en giftig eller terapeutisk middel eller en arvelig retinal dystrofi. En sådan variation er en overvejelse for opstilling til sammenligning af kliniske resultater ved hjælp af musemodeller for subretinal behandlinger, og meget tyder på, at passende kontroller omfatter subretinal injektion af køretøj i stedet for en ikke-injicerede øje 3. Endelig opfordrer vi Investigators at gøre talrige OLT scanninger af multiple retinale regioner før injektion for at forbedre dækningen af injektionsstedet i alle scanninger.
Terapeutisk virkning vil sandsynligvis blive opnået ved eksperimentelle midler leveres til en større flade af nethinden. I disse tilfælde større volumener er ideelle, men kan ikke være nødvendigt, da 0,3 pi injektioner ofte dannet flade bleb'er, der omfattede et stort retinal overfladeareal. Bleb form var ikke styrbar, skønt større injektionsvolumener produceret mere kuppelformede bleb'er. Op til 1 pi kan injiceres uden negative resultater, er det dog muligt, at hvælvet blærer blive så udvidet at Retina hånd og klæber til den bageste kapsel af linsen, især i unge mus med lave glasagtige mængder. Trods den leverede mængde fra sprøjten, er det faktiske volumen målrettet til subretinarummet beregnet til at være mindre. Dette kan afspejle volumen, der ikke er erhvervet i OLT scanninger, især for hvælvet eller flat blærer eller en artefakt af OLT-scanning og efterfølgende rekonstruktion, men kan afspejle tab volumen fra tilbageløb efter tilbagetrækning af nålen.
Sammenfattende hjælp af en posterior tilgang til subretinal injektioner har færre komplikationer og forbedret opsving, hvilket resulterer i en høj succesrate for målretning og lav udstødelse. Denne teknik er ideel til virale, farmakologiske, og cellulære manipulationer af gnavere nethinder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
