Abstract
망막 주사 성공적으로 직접 감광체로 노광 및 망막 색소 상피 (RPE)를 갖는 interphotoreceptor / 망막 구획 단백질의 치료 적 개입 바이러스제, 세포를 제공하는 사람과 설치류에서 모두 사용되었다. 플라스 미노 겐의 망막 주사뿐만 아니라 최근 전임상 및 임상 시험 고급 망막 질환과 개인에게 바이러스 성 벡터와 줄기 세포를 제공하는 안전 및 / 또는 효능을 증명하고있다. 망막 질환, 특히 유전 적 망막 이영양증의 마우스 모델은 이러한 치료를 테스트하기 위해 필수적이다. 설치류에서 가장 흔한 주입 절차 망막 전방 접근 작은 transcorneal transcleral 또는 절개를 사용하는 것이다. 이 방법, 주사 바늘은 기본 RPE 및 삽입에 영향을주지 감각 신경 망막을 관통 쉽게 닉 렌즈, 렌즈 혼탁 및 비 침습적 imagi의 손상을 유발NG. transcleral를 통해 망막 하 공간에 액세스, 후방 접근 방식은 이러한 문제를 피할 수 : 바늘은 망막 침투하지 않고, 시신경에서 약 0.5 mm 공막을 통과하고 유리체을 방해 방지 할 수 있습니다. 담보 손상 초점 공막 및 과도, 장액 망막 박리의 효과와 관련이 제한됩니다. 이 방법의 단순성은 안구 손상을 최소화 망막 재 부착 빠른 복구를 보장하고, 낮은 실패율을 갖는다. 망막과 망막 색소 상피에 최소한의 손상 효과의 명확한 평가와 치료제 자신의 직접적인 영향 수 있습니다. 이 원고는, 바이러스 벡터, 약리 에이전트를 대상으로 높은 효능, 최소한의 손상과 빠른 복구와 쥐의 망막 하 공간으로 세포 나 유도 만능 줄기 (IPS) 줄기 세포에 사용할 수있는 새로운 망막 주입 기술에 대해 설명합니다.
Introduction
망막 주사는 광 수용체 및 기본 RPE 1, 2에 미치는 영향을 연구하기 위해 쥐의 망막에 세포 및 바이러스 에이전트를 전달하는 주요 수단이다. 마우스에서 대부분의 망막 주입 프로토콜은 transcorneal 또는 적도에 transcleral 주사 부위 앞쪽 (그림 1)를 사용합니다. 이 방법은 새김 눈과 렌즈의 결과 혼탁의 감각 신경 망막과 홍채, 망막 출혈, 망막 박리 실질적이고 지속적인 망막 부종 3-9의 유리체, 침투의 무결성의 중단을 포함하는 고유의 담보가 손상 될 수 있습니다. 실험 조작은 치료 적 개입 3,7,10,11의 효과를 평가하기 위해 이러한 효과를 극복해야한다. 이 연구는, 이러한 합병증을 피할 후방 transcleral 주입 방법의 상세한 설명 및 유효성을 제공 외상을 최소화 서브 타겟팅 높은 성공률을 갖는다망막 공간.
쥐의 망막 하 공간을 대상으로 주사 종종 수행하는 것이 매우 어렵고, 대부분의 연구자들은 벡터가 잘못된 위치로 전달하거나 상당한 망막 손상은 전체 망막 박리 (6), 예를 들어 존재하는 시도 실패 고주파 발생. 때문에 사출 합병증 분석에서 제외 눈의 수는 일반적으로 마우스 연구에서보고되지 않고, 우리의 경험에서 다른 연구자와 논의 실패 주사의 수가 50 %만큼 높을 수 및 경험에 따라 달라질 수 있으며 주사를 수행하는 연구자의 기능을 제공합니다. 주입의 성공은 일반적으로 직접 안저 화상 및 / 또는 광 결맞음 단층 촬영 7,9에 의해 평가된다. 생쥐의 망막 주사에 대한 높은 성공률과 쉽게 습득 방법은 실험을 촉진하고 레의 전임상 연구의 비용을 줄일 수 있습니다미국에서 실명의 주요 원인은 망막 질환에 대한 atments.
후방은 여기에 설명 transcleral 망막 주사 기술은 임상 및 임상 프로토콜 9,12-에서 적응이다. 주입 된 쥐에서 수행 된 비 침습적 진단 평가는 온화하고 매우 지역화 피해를 입증하고 추가 담보 렌즈, 망막과 망막 색소 상피 손상이 부족하다. 따라서 이러한 연구와 연관된 비용을 감소, - (90 % 이상 80) 또한, 비교적 적은 연습, 실험자 높은 성공률 이러한 결과를 얻을 수있다. 이 절차는 전임상 연구에서 감광체 및 / 또는 행 RPE 세포 바이러스 또는 약물 치료 적 개입을 제공하도록 쉽게 실험 간섭을 평가할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 : 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학 (UCLA)에서 자란 야생 형 C57BL / 6J 마우스. 17주 세, 남성과 여성의 쥐를 포함 - 모든 동물 (11)이었다. 모든 마우스 그룹 수납 임의의 사료 및 물과 함께 12시 12분 / 암주기에서 유지시켰다. 모든 실험은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 UCLA 및 비전 연구 협회와 안과 정책의 제도적 지침에 따라 수행되었다.
참고 : 모든 약물과 주사 에이전트가 미국 약전 (USP) 등급이다.
1. 수술 준비
- 식염수 믹스 100 ㎎ / ㎏ 케타민 8 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 마우스가 더 발가락 핀치 또는 각막 터치 반사가 없도록 깊이로 마취를 관리 할 수 있습니다.
- 순환 물 패드와 37.0 ° C에서 체온을 유지한다.
- 2.5 % 페닐에 눈 D와 학생들을 팽창ROPS 및 트림 수염이 시각화를 용이하게한다. 수염 따라서, 위스커가 눈에 명확 블록 액세스하지 위스커의베이스 부분만을 제거한다 트리밍 마우스 상당한 감각 입력을 제공한다. 우리의 경험에 의하면, 마우스는이 절차 후 정상 회복을 보여줍니다. 메틸 눈을 적용하면 건조를 방지하고 마취 유도 과도 백내장 (13)을 최소화하기 위해 삭제합니다.
- 수술 (즉, betadine와 에탄올 또는 뜨거운 구슬) 이전에 악기를 소독.
- 시각화를 수행 할 경우 무균 환경에서 희석 형광을 (0.01 % 0.9 % 식염수를 사용하여) 준비 (즉, 바이오 안전성 캐비닛) (아래 섹션 3 참조).
2. 사출 현장 준비
- 적절한 주입 부피 (예를 들어, 0.3-1.0 μL) 주사기 (예를 들어, 5 μL 주사기)을 준비한다.
- 눈이 디에서 명확하게 볼 위로 향하게되도록 마우스를 배치현미경을 ssecting.
- 부드럽게 뾰족한 집게로 시간적 결막을 꼬집어. 곡선 Vannas 가위를 사용하여 약 90 도의 원주 절개를합니다.
- 기본 장부의 캡슐 단계를 반복 2.3.
- 비강 지구를 회전하면서 뾰족한 집게로 주변의 결합 조직을 절제. 시신경 약 0.5 mm 일시 주사 부위를 향해 작동한다. 복고풍 궤도 동을 방해하지 않도록 세심한주의를 사용합니다.
3. 공막과 망막 주입
참고 :이 절차를 배우면서 0.9 %의 식염수에 0.01 %의 형광의 주입이 시각화 지원하기 위해 사용하는 것이 좋습니다. 형광의 지형 분포를 효과적으로 안저 화상 (아래 섹션 4 참조)과 함께 설명 될 수있다.
- 부드럽게 22.5도 안과 블레이드와 아이 컵을 긁는하여 주사 부위에 작은 공막 절개를합니다. 이 절개 수오단, 바늘 끝이 공막을 통과 할 수 있도록 충분히 커야 신분증.
- 5 각도 경 사진 33 G 바늘 (삽입 -. 경사가 직면하고 망막에 각도 병렬로 공막에 10 °를 (원하는 볼륨을 주사 예를 들어, 학습 목적으로 0.01 % 플루 오레 0.3 ~ 1.0 μL).
참고 : 철저하게 각 주입하기 전에 적당한 용매 및 탈 이온수의 연속적인 세척과 청소하여 주사기의 불임을 유지한다. - 바늘을 이동하지 않고, 심지어 압력으로 천천히 플런저 (이상 ~ 3 초) 우울.
주 : 바늘이 망막 하 공간에있을 때, 상기 플런저를 누르면서, 약간의 저항이 느껴질 것이다. 바늘 공막 또는 RPE를 관통하지 않는 경우 바늘이 망막, 높은 저항을 천공하는 경우 최소한의 저항이 더 없을 것이다. - 역류를 최소화하기 위해 바늘을 인출하기 전에 몇 초 동안 기다립니다.
- 멸균 완충 식염수로 눈을 씻어 눈 시간을 보장다시 정상 위치로 회전 할있다.
및 OCT 안저 영상에 의한 망막 박리 4. 평가
- 즉시 주사의 품질을 평가하기위한 주사 후 적절한 시간에 간섭 단층 촬영을 수행하는 망막 구조를 평가하는 데 필요한 포스트 분사를 가리킨다.
주의 : 유사한 연구에서의 OCT 사용의 예는 이전에 7,14을 설명 하였다.- 조정 및 주사 부위를 대상으로 OCT의 이미지를 맞 춥니 다. 주사 부위는 중간 선 및 시신경 헤드 시간 0.5 mm이어야한다. 최적의 중심 이탈이 프레임 밖으로 경우에만 필요 여부로 반복합니다.
- 망막 박리를 시각화하고 엉 - 얼굴 안저 영상 7, 14과 주입 영역을 염색.
참고 :의 OCT 이미징 시스템을 사용할 수없는 경우, 연습 벡터와 형광 소량의 주입은 형광 angio을 수행하는 안저 카메라로 시각화 수 있습니다동일한 여기 파장을 사용하여 필터를 차단 그래피로. 하이퍼 형광의 지역화 된 영역은 혈관 아래에 표시되고 망막 하 공간이 제대로 대상으로하면 혈관이 선명하고 뚜렷한 경계를해야합니다. 사출에서 여과포의 가장자리는 하이포 형광에 하이퍼의 전환에 의해 경계가 될 것입니다. 여러 악기는 마우스이 기능을 제공한다; 여기에 사용 된 장비는 다른 14 설명한다.
5. 수술 후 케어
- 주입 된 눈의 각막 표면에 트리플 항생제 안과 크림의 두꺼운 코트를 적용합니다.
- 복구를위한 깨끗한 독방 새장에 마우스를 놓습니다. 그들은 완전히 회복 될 때까지 수술을받은 마우스를 함께 사용하지 마십시오.
- 마취 회복 중에 호흡과 온도를 모니터링합니다. 그들은 흉골 드러 누움을 유지할 수있을 때까지 동물을 모니터링합니다.
- 추가 적절한 수술 후 모니터링을 수행및 수술후 통증 관리 카프로 펜의 서브 피하 주사 (5 ㎎ / ㎏)을 포함한 치료.
전위도에 의해 망막 기능의 6 평가 (ERG)
- ERG 분석 미리 주입을 수행하고 적절한 시간에 망막 기능을 평가하기 위해 필요에 따라 포스트 분사. 주사는 망막 하 공간에 만들어진 경우, 망막 박리는 72 시간 내에 해결됩니다.
- 이전에 14,15을 설명한대로 전과 주입 후 망막 기능을 평가하기 위해 표준 ERG 기술을 사용합니다.
7. 3D 재건 및 여과포 볼륨 정량화
참고 : 고 대비가보기의 프레임 내에서 전체 분리를 포괄와 10월 스캔이 사용하기에 최적입니다. ImageJ에 / 피지 17,18 및 Imaris이 사용되었지만, 다른 소프트웨어를 사용할 수있다.
- 관심의 B 검사를 내보내기 ImageJ에 / 피지 및 작물 (이미지> 자르기)은 OCT (SC)의 부분에 가져 오기는 사각형 선택 도구를 사용하여 모델링된다.
- 콘트라스트 조정 (이미지>> 밝기 / 명암 대비를 조정)과 선으로 두 부분을 연결하여 누락 된 경계를 묘사.
- 광 수용체 층에 RPE에 걸쳐있는 줄 도구 (들고 이동)과 직선을 그립니다. 측정 (측정> 분석) 라인의 길이는 단계 7.8에 대한 최대 박리의 크기를 얻을 수있다.
- 가져 오기 "회색 RGB"플러그인 및 MATLAB 컴파일러 런타임을 사용해서 (재료의 표 참조) 3 차원 재구성 소프트웨어 프레임립니다.
- OCT를 스캔 (X, Y, Z)에서 교정 매개 변수를 사용하여 (이미지 속성 아래) 복셀 크기를 설정합니다.
- 네 번째 채널을 만들기 위해, 각 채널에 동일한 가중치와 (이미지 속성 아래) "RGB 회색에"플러그인을 실행합니다. 원래 빨강 - 녹색 - 파랑 채널을 삭제합니다.
- 콘트라스트 변화를 이용하여 그레이 채널을 전환. 저장 이미지.
- 의 "추가를 클릭합니다EW 표면의 "3D-보기 탭에서 버튼을 표면을 만드는 가이드 4 단계 과정을 시작합니다.
- 표면 레벨 세부 사항 (4 단계의 1)를 설정합니다.
참고 : 우리의 경험에 12.0-8.0 가장 유효 범위이었다. - (배경 선택에 따라) 최대 영역 크기 7.1.2에서 측정 된 최대 박리의 크기보다 약간 이하로 설정합니다. 회색 채널 반전 (4 단계의 2) 표면을 작성하고 취소.
- 망막의 외부 음의 공간과 분리의 표면이 접촉 (4의 3 단계)로 제공하지 않도록 최대 값으로 임계 값을 설정합니다.
- 복셀의 개수는 필터의 종류를 설정하고 크기별로 분리 사이트 네가티브 공간을 격리. 표면 (4 단계 4)를 완료합니다.
참고 : 분리 표면의 볼륨이 통계 탭에서 볼륨 아래에 있습니다.
- 표면 레벨 세부 사항 (4 단계의 1)를 설정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
접근 transcleral 망막 주사는 0.3 μL (N = 18), 0.5 μL (N = 8)과 0.01 %의 형광의 1.0 μL (N = 5)의 주사로 16 야생형 생쥐에서 31 건강한 눈을 수행 하였다 후방. 한쪽 눈으로 인해 구조 및 기능 분석을 방지 미리 기존의 각막 혼탁에 주입에서 제외 하였다. 모든 주입 눈이 보고서에 포함되어 있습니다. 의도하지 않은 망막 박리는 유리체에 감각 신경 망막 또는 누설의 천공은 검출되지 않았다하거나 관찰하는 눈에서 렌즈 칼자국을내는, 염증 반응, 포도막염, 또는 수술 후 감염의 증거였다.
망막 구조는 사전 주입 10 분 후 분사 간섭 단층 촬영하여 사주 후 분사 (도 2 및 3)을 평가 하였다. 9- 포인트 그리드, 최대 박리의 중심 위에 놓인 중심점, 10 분에 넣었다얼굴 스캔 (그림 2B) 엔 포스트 분사. 혈관 랜드 마크, 사전 주입 및 4 주 후 분사 스캔을 사용하는 것은 10 분 후 분사 검사와 등록에 회전했다. 이것은 사전 및 사후 주입 망막 스캔 (그림 2A, C)에 정확하게 동일한 위치의 식별을 허용했다.
망막 주사 떨어진 바늘 망막 하 공간 (도 2B의 화살표)을 입력 주사 부위로부터 중심으로 한 것 여과포 형성을 초래하고, 얕은 분리는도 3b를 확장 영역에 걸쳐 연신 또는 (돔형으로 납작 (도 3A)이었다 - 구속 영역에 깊은 분리 (표 1)와 D). 돔형 소포는 RPE 직교 50 μm의를 초과하는 박리로 정의 하였다. 어떤 로제트 외측 망막 층의 연신에 의해 생성 된 물결 무늬가 관찰되지 않았다. 전분사 증착 텐트 얼굴 10월 (그림 2D, 점선), 형광 안저 촬영 (그림 2E) 간섭 단층 B-검사 (그림 3) 실내로 시각화 하였다. 마우스 망막의 약 10 %를 포함 OCT를 스캔의 시야 넘어 확장 소포의 대부분 (31 ~ 29). 큰 사출 볼륨 (표 1)과 돔 소포의 증가 주파수 이외의 여과포 형태를 통제는 없었다. 이주에 의해 해결 모든 소포 (데이터는 보이지 않음).
전체 망막 두께 (신경 섬유 층에 브루흐의 막)을 정량적으로 그리드 존재의 각 지점에서 0.3 μL (그림 3A), 0.5 μL (그림 3B) 1.0 μL (그림 3C) 주입 볼륨 사주 주사 후 평가 하였다 B-검사를 대응 (표 1). 백분율 차이 (%의 Δ) w구조적 및 기능적 메트릭 모두 사전 주입 측정치 차이 상대적으로 계산. 모든 격자 점은 모든 이미징 세션 동안 획득 한 아닙니까. 예를 들어, 3 (4) 눈의 눈은 3 또는 4 점을 가지고, 1 또는 2 개의 포인트가 있고, 눈 (23)의 모든 검사에서 5-9 점을 가졌다. 전체 망막 두께가 사전 및 사후 주사에 대한 유의 한 차이가 이후 망막 얇아 대한 전반적인 추세가 모두 (표 2) 관찰되었지만 돔형 평면 소포, 사출 볼륨은 붕괴되었다.
또한 분석은 ± 6.5 %의 작지만 유의 씨닝 나타났다 1.9 전체 (프리 = 196 ± 1, N = 31; 포스트 = 183 ± 4, N = 31, T 60 = 3.4, p = 0.001) (표 3). 망막 숱이 발생한 위치를 확인하기 위해 모든 9 격자 점에 대한 두께 측정을 포함 10 눈의 부분 집합을 분석 하였다. 모든 눈에 대한 분석과 유사하게,눈의 부분 집합은 (3.5 ± 10.3 % 사전 = 199 ± 1, N = 10; 포스트 = 179 ± 8, N = 10, T (18) = 2.4, P = 0.02) 작지만 의미있는 전체 망막 숱을 보여 주었다. 망막 박화는 주사 부위의 말초 부위에서 관찰되지 않았다 (4.0 ± 7.2 %, 사전 = 199 ± 2, N = 10; 포스트 = ± 8, N = 10 185 = 1.7 T 18, p = 11). , 주사 부위, 망막 숱이 (포스트 = 179 ± 10, N = 10, T 18 = 2.1, P = 0.04 사전 = 201 ± 2, N = 10, 11.2 %, 5.0 ±) 최대 망막 박리의 사이트에서 관찰되었다 손상없이 (13.8 ± 6.0, 사전 (201)은 1, N = 4 ± = = 173 (10), N = 4, T 6 = 2.8, p = 0.03 포스트 ±) 망막 감금과 주사 부위는 망막의 작은 영역 일 때 흉터와 주사 사이트 (26.5 % 바늘 철수시 공막을 통해 뽑아 (포스트 = 171 ± 3, N = 3, T 4 = 8.9, P = 0.001 14.1 % 1.0, 사전 = 199 ± 1, N = 3 ±) 1.6 ±, 사전 = 200 ± 3, N = 3; POSt = 147 ± 10, N = 3, T 4 = 5.1, P = 0.007). 총, incarcerations는 외부 망막 층 (그림 3E)의 절반까지의 손실 맥락막의 흉터 형성의 결과 3 그 중 14 (31) 중 주사에서 발생했습니다. 각각의 경우에, 그러나 이들은 매우 국부적 효과였다.
전체 필드 전위도 전에 주입 수행 사주 기능 변경 (표 1)을 평가하기 위해 각각의 눈에 대해 개별적으로 평가 기준 변경 주사 후 반복 하였다. 만 어두운 적응로드 매개 반응은 기록되었다. 강도 응답 기능을 모두 광 수용체 (A -waves)와 중앙 망막 (ㄴ -waves)에 대한 VMAX를 유도하기 위해 미카엘리스 - 멘텐 식으로 장착되었다. 응답은 소포 형태에 의해 영향을받지 않았다 때문에 (표 4) 붕괴되었다. VMAX에서 작지만 통계적으로 유의 한 감소에 있었다-waves (F (1, 28) = 7.1, P = 0.013)하지만 나 -waves (F (1, 28) = 4.0, P = 0.055) 주사 후 (표 4). 사전 및 0.3 μL, 0.5 μL, 1.0 μL의 후 분사에 대한 대표적인 파형은 (그림 4) 표시됩니다. 및 b -waves (F (2, 28) = 6.2, p = 0.006 및 F (2, 28) = 8.8, 각각 p = 0.001) - 모두에 주입량의 효과가 있었다.
마지막으로, 3 차원 모델링을 모두 평평한 돔형 소포 구조를 시각화하는데 사용되었다. 돔 여과포 (그림 5A)의 예는 스캔 영역 내에 포함 된 돔형 유체로 채워진 분리를 보여줍니다. 평면 소포 (그림 5B, C)의 예는 검사의 영역을 넘어 확장 얕은 유체로 채워진 영역을 보여줍니다. 망막 감금이 발생하면, 재구성의 작은 구멍 (도 5C)을 볼 수있다. 인공 경계 스캔 t의 가장자리에 도시오 재구성 (그림 5C)를 할 수 있습니다. 이러한 샘플 주사에서 소포 볼륨의 계산은 0.15 μl의 0.01 μL의 최소가 성공적으로 각각 돔형 평면 소포의 결과로 0.3 μl를 주입의 망막 하 공간을 대상으로 한 것으로 나타났다. 가능성이 주입 계산 된 부피는 인간의 망막 주사 발생으로 인한 절차를 수행하는 동안 이미징 및 재건, 유체의 흡수의 해상도로 실제 볼륨을 과소 평가하고, 평면 또는 돔 소포 특히, 전체 분리가 OCT를 스캔에 표시되지 않은 경우.
표 눈에 의해 망막 주사 1. 기능 및 구조 효과. 개인의 눈의 지표 및 망막 주사에서 자신의 결과. 망막 빛에 대한 반응 (중간 망막 ㄴ -waves와 - 파를 광 수용체S) 및 망막 두께 측정치 (신경 섬유층으로 부르크 막)이 주어진다. 각주 :
BT는 = 여과포 유형, 플랫 (F) 또는 돔형 (D)
ㄴ #gp = 격자 점의 개수를 측정
* 주입량의 재구성에 사용되는 눈.
** 흉터에서 측정 할 수 만 1 격자 점.
흉터 형성 # 눈.
| 시각 | 돔형 여과포 | 플랫 여과포 | 0.3 μL | 0.5 μL | 1.0 μL | |
| (μm의) | (μm의) | (μm의) | (μm의) | (μm의) | ||
| 사전 주입 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| 포스트 분사 | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
전체 망막 두께에 망막 주사 표 2. 효과. 여과포 형상 망막 두께 주입량 분석.
| 두께 (μm의) | |||||
| 대지 | N (안) | 사전 | 4 주령 | Δ | % Δ |
| 망막 (모든 조화 된 포인트) | (31) | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6.5 ± 1.9 |
| 모든 9 격자 점과 망막 * | (10) | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10.3 ± 3.5 |
| 주입에 원위 * | (10) | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7.2 ± 4.0 |
| 최대 박리 * | (10) | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11.2 ± 5.0 |
| 손상없이 주입 * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13.8 ± 6.0 |
| 주입에 감금 * | 삼 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14.1 ± 1.0 |
| 주입에 흉터 * | 삼 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26.5 ± 1.6 |
표 망막 구조에 손상 3. 효과. 사이트에 의존하는 망막 숱 분석. 각주 : * 모든 9 격자 점의 데이터를 10 마우스의 분석.
| VMAX (μV) | 돔형 (N = 12) | 플랫 (N = 6) | 0.3 μL (N = 18) | 0.5 μL (N = 8) | 1.0 μL (N = 5) |
| -waves | |||||
| 사전 주입 | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| 포스트 분사 | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| ㄴ -waves | |||||
| 사전 주입 | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| 포스트 분사 | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
및 b -waves - 내 페이지 = "1"> T 암순응에 망막 주사의 수 4. 효과을로드는 중재. 물집 모양과 빛에 대한 망막 반응에 주입량 (중간 망막 ㄴ -waves 및 광 수용체 -waves)의 분석.
망막 사출 그림 1. 도식 표현. 소켓에 마우스 눈의 하향식 개략적으로는 접근 방식을 보여줍니다 망막 전통적인 주사는 transcorneal을 이용하여 유리체 근처 또는 transcleral (화살표 b) 주사 부위 (A 화살표). 이 방법은 극부을 노출 비강, 눈의 회전에 의해 달성되는 극부 (화살표 c) 근처 transcleral 접근법을 사용한다.레 / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
간섭 단층 이미지 그림 2. 등록 두께 분석을위한 망막 사이트의 식별을 할 수 있습니다. AC, 원래의 방향으로 마우스 1OS의 얼굴 간섭 단층 이미지를 갖추고 있습니다. 융합 등록 격자 망막 사전 주입 A) 이미지. 망막 10 분 후 분사의 B) 이미지. 9- 포인트 그리드 최대 망막 박리 부위의 중심점 위치시켰다. 주사 부위가 표시 (화살표)입니다. 망막 사주 융합 등록 그리드와 포스트 분사의 C) 이미지. DE, 마우스 9OS의 이미지. 망막 박리의 확장 보여주는 주입 후 망막 4 주 얼굴 10월 이미지 욕실 D). E)안저 (녹색)과 망막 10 분 후 분사의 얼굴 간섭 단층 이미지 엉 오버레이. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 망막 주사 최소한의 망막 엷게와 임시 망막 박리의 원인이됩니다. 최대 망막 박리의 사이트에있는 대표 10월 B-검사는 사전 주입, 10 분 후 주사 4 주 후 주입 표시됩니다. A) 형성과 0.3 ㎕를 주입에서 평면 여과포의 해상도입니다. B) 형성과 0.5 μl를 주입에서 돔 여과포의 해상도입니다. 1.0 μl를 주입에서 C) 형성과 돔형 여과포의 해상도입니다. 심한 쵸 D) 예roidal 흉터 및 주사 부위에서 망막 숱. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 망막은 여과포 해결 한 후 정상 기능을 유지. 암순응로드 매개 응답 파형 사전 주입 (검은 선)과 A의 사주 포스트 분사 (빨간 점선)) 0.3 μL, B) 0.5 μL 및 C)에 이르기까지 9 조명 강도에 1.0 μL 주사에 대해 표시됩니다 4.37 × 10 -6 0.51 CD / m 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 소포의 3D 재구성. A) 소프트웨어에서 생성 된 대표 (A)의 3D 재구성)을 돔형 0.3 ㎕를 주사에서 B, C) 평면 소포. 늑골은 재건 소프트웨어의 유물이다. 인공 경계 재구성을 허용 C에 넣었다. 스케일 바 = 150 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
망막 주사 바이러스 벡터의 전달을위한 선택의 방법이며, 감광체와 기초 연구 및 임상 치료 모두에서 RPE를 조작하기위한 세포 유래 줄기 치료. 환자에서 망막 주사는 일반적으로 직접 시각화 바늘함으로써, 유리체에서 전방 공막과 망막의 뒤쪽 코어 유리체 절제술 및 침투를 수행하고 있습니다. 눈 수정체 이미 않는 백내장 형성 일찍 발생하는 가장 절제술 절차와 마찬가지로 일반적이다. 마우스에서, 망막 하 주사 전통적 유리체 포착 전체로 이어질 수 공막 망막 앞쪽 자주 눈의 후방 공간의 대부분을 차지하는 렌즈 모두 칼자국과 관련된 방법 및 transretinal 침투 완료 망막 박리. 마우스에서의 사후 - 접근 기술은 원치 않는 결과를 줄이고 EF를 해석 할 수있는 능력을 향상하여의도 된 조작의 fects.
여기에보고 된 망막 주입 기술의 장점은 최소한의 구조적 또는 기능적 효과 감소 부수적 인 피해를 포함 (예를 들어, 렌즈 칼자국을내는, 유리체 누출 또는 염증 흐리게) 실험 결과와 빠른 복구 시간을 쉽게 평가 할 수 있습니다. 이 기술은 극부 도달하는 눈의 큰 조작을 필요로하지만, 약 10 년에 완료 될 수있다 - 더 눈이 분석에서 거부되지 않음으로 높은 성공률 눈 당 15 분. 주사제의 대부분에서, 정상 망막의 구조와 기능을 4 주 이내에 관찰되었다. 구조와 기능의 회복 8 주 또는 복구 시간 6,7를보고하지 않습니다 - 비교함으로써, 이전의 연구 (5)를보고합니다. 그 결과, 실험은 적은 수의 동물들과 함께 짧은 시간에 완료 할 수 있습니다.
이 망막 주입 기법 합병증 흉터 형성 및 소실을 포함중요한 구조적 및 기능적 결손의 삼가지 경우와 주사 약 10 %의 광 수용체. 망막은 단지 큰 흉터 사전 주입에 비해 시각 응답의 80 % 및 내측 망막 반응의 77 %로 감소시키는 기능을 가진 광에 정상적인 반응을 유지 하였다. 이것은 현재의 연구에서 평가되지 않았더라도 망막 incarcerations은, 모든 주입을위한 새로운 바늘의 사용으로 감소 될 수 있습니다. 대안 적으로, 그들은 의한 부압 발생함으로써 피할 수. 눈의 크기가 큰, incarcerations는 전체 망막에 덜 손상을 나타내므로 Incarcerations 그러나, 인간의 망막 주사 매우 일반적이다. 치료제가 주입 된 경우 결과적으로, 주입 눈의 90 %는 간섭의 영향의 평가에 사용할 수있다.
이전과 망막 주사 후 망막 두께 측정의 변동성은 t의 재현성을 반영그는 10월 마우스에 악기, 이미지를 통해 망막 위치를 정렬의 정밀도 및 저용량 형광 염료와 생리 식염수의 주입에서 망막 변경됩니다. 이러한 측정은 치료제가 존재하는지의 여부 망막 주사의 결과로 통계적으로 유효한 변화를 검출 할 필요가 눈 망막 위치의 수에 대한 전력 계산에 연구자을 안내하는 역할을 할 수있다. 10의 경우에있는 9 그리드 지점 모든 망막 스캔에 있었다, 주사 부위의 외부 망막 두께의 변동 (5 - 아이 당 8 점)에도 독성이없는 경우 4.0 % ± 7.2 %이었다 또는 치료제 또는 유전성 망막 영양 장애. 이러한 변동은 망막 트리트먼트의 마우스 모델을 이용하여 임상 적 결과의 비교를위한 기준을 설정하기위한 배려이다 강하게 적절한 제어가 차량의 망막 주입보다는 uninjected 눈 (3)을 포함 할 것을 제안한다. 마지막으로, 우리는 investig을 장려의 ators 모든 검사에서 주사 부위의 범위를 개선하기 위해 주입 전에 여러 망막 지역의 많은 간섭 단층 검사를 할 수 있습니다.
실험 에이전트가 망막의 큰 창공에 전달 될 때 치료 효과 가능성이 달성됩니다. 이 경우, 더 큰 볼륨이 적합하지만, 0.3 μL 주사는 종종 큰 망막 표면 영역을 커버 평면 소포를 형성으로 필요하지 않을 수도있다. 큰 주입 볼륨이 더 돔 소포를 생산 있지만 여과포 형태는, 제어되지 않았습니다. 1 μL까지 그러나, 돔 소포가되도록 망막의 접촉을 확대하고, 특히 낮은 유리체 볼륨 젊은 쥐에서, 렌즈의 후방 캡슐에 부착 될 가능성이있다, 부정적인 결과없이 주입 할 수있다. 주사기로부터 전달 된 양에도 불구하고, 망막 하 공간을 대상으로하는 실제 부피 이하로 산출된다. 특히 돔형 또는 F에 대한 OCT를 스캔에서 획득되지 않은 볼륨을 반영 할 수있다위도 소포, 또는 OCT를 스캔 이후 재건의 유물,하지만 바늘의 철수에 따라 역류에서 볼륨 손실을 반영 할 수있다.
요약하면, 망막 주사에 대한 후방 접근법을 사용하여 타겟팅과 배제의 낮은 속도의 높은 성공률 결과, 적은 합병증 개선 복구가 있습니다. 이 기술은 설치류 망막의 바이러스 성 약물, 및 세포 조작에 이상적이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
