שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54808

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Sachin Parikh¹, Andrew Le¹, Julian Davenport¹, Michael B. Gorin¹, Steven Nusinowitz¹, Anna Matynia¹

¹Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

Abstract

זריקות subretinal שימשו בהצלחה בשני בני אדם ומכרסמים לספק התערבויות טיפוליות של חלבונים, סוכנים ויראלי, ותאי לתא interphotoreceptor / subretinal כי יש חשיפה ישירה קולטני האור ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). זריקות subretinal של plasminogen וכן ניסויים פרה-קליניים וקליניים האחרונים הוכיחו בטיחות ו / או יעילות של מתן וקטורים ויראליים ותאי גזע ליחידים עם מחלת רשתית מתקדמת. מודלים עכבר של מחלת רשתית, במיוחד dystrophies רשתית תורשתי, חיוניים לבדיקת לטיפולים אלה. הליך ההזרקה הנפוץ ביותר במכרסמים הוא להשתמש transcorneal הקטן או חתכי transcleral עם גישה קדמית לרשתית. עם גישה זו, מחט הזריקה חודר הרשתית הנוירו לשבש את הרשתית הבסיסית ועל החדרת יכול בקלות ניק העדשה, גרימת עכירות העדשה וירידת ערך Imagi פולשניתng. גישה למרחב subretinal באמצעות transcleral, גישה אחורית תמנע בעיות אלה: המחט חוצה את בלובן העין כ 0.5 מ"מ מן עצב הראייה, ללא חדירת רשתית ונמנעה לשבש את הזגוגית. נזק סביבתי מוגבל כי הקשורים מוקדי sclerotomy ואת ההשפעות של חולף, היפרדות רשתית הצפק. הפשטות של השיטה ממזער פגיעה עינית, מבטיחה שחיבור רשתית מהיר והתאוששות, ויש לו שיעור כישלון נמוך. הניזק המינימאלי רשתית הרשתית מאפשר הערכה ברורה של יעילויות התרופות ותופעות ישירות של הסוכנים הטיפוליים עצמם. כתב יד זה מתאר טכניקת ההזרקה subretinal הרומן, שניתן להשתמש בהם כדי למקד וקטורים ויראליים, סוכני תרופתי, תאי גזע או גזע מושרים (iPS) תאים למרחב subretinal בעכברים עם יעילות גבוהה, נזק מינימלי, והתאוששות מהירה.

Introduction

זריקות subretinal הן האמצעי העיקרי של אספקת סוכנים הסלולר ויראלי אל הרשתית של עכברים ללמוד והשפיע על קולטני אור ואת ^1,2 שבבסיס הרשתית. רוב פרוטוקולי הזרקת subretinal בעכברים להשתמש transcorneal או קדמי זריקת transcleral לקו המשווה (איור 1). גישה זו יכולה לגרום נזק סביבתי הגלום הכולל שסחב ו ערפול כתוצאה של העדשה, שיבוש של שלמות, חדירה הזגוגית של הרשתית הנוירו ואיריס, דימום ברשתית, היפרדות רשתית משמעותי ובצקת subretinal קיימא ^3-9. מניפולציות ניסוייות חייבות להתגבר על תופעות אלה על מנת להעריך את ההשפעות של התערבויות טיפוליות ^3,7,10,11. מחקר זה מספק תיאור מפורט ואימות של שיטת הזרקה אחורית transcleral כי תמנע סיבוכים אלה, ממזער טראומה בעל שיעור הצלחה גבוה של מיקוד המשנהשטח הרשתית.

זריקות מיקוד במרחב subretinal בעכברים הן בדרך כלל מאוד קשות לביצוע רוב החוקרים נתקלים בתדירות גבוהה של ניסיונות כושלים שבו הווקטור מועבר על מיקום לא נכון או שיש פגיעה ברשתית משמעותית, למשל היפרדות רשתית מלאה ^6. מספר העיניים מחוץ ניתוח עקב סיבוכי הזרקת בדרך כלל אינו מדווח במחקרי עכבר, אבל הניסיון שלנו והן בדיון עם חוקרים אחרים, מספר זריקות נכשלו יכולה להיות גבוהים ככל 50% ולגוון תלוי הניסיון יכולות של החוקר שמבצע את הזריקות. ההצלחה של ההזרקה נבחנת בדרך כלל על ידי הדמיה הפונדוס ישירה ו / או טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) ^7,9. שיטה לשלוט בקלות עם שיעורי הצלחה גבוהים עבור זריקות subretinal בעכברים יכול לזרז ניסויים ולהפחית את העלות של מחקרים פרה של טרהatments למחלות רשתית כי הם הגורמים העיקריים לעיוורון בארצות הברית.

האחורי, טכניקת הזרקת subretinal transcleral המתוארת כאן היא עיבוד פרוטוקולים קליניים פרה-קליניים ^9,12. הערכות האבחנתיות פולשנית שבוצעו עכברים שהוזרקו להדגים ניזק עדין מאוד מקומי וחסרי עדשה בטוחה נוספת ברשתית ופגיעת רשתית. יתר על כן, עם קצת אימון יחסית, נסיין יכול להשיג את התוצאות הללו עם שיעור הצלחה גבוה (80 - 90% או יותר), ובכך להפחית את העלויות הכרוכות מחקרים כאלה. הליך זה יכול לשמש כדי לספק הסלולר, ויראלי, או התערבויות טיפוליות תרופתיות כדי קולטני אור ו / או רשתית במחקרים פרה-קליניים להעריך התערבויות ניסיוני בקלות.

Protocol

בעלי חיים: סוג Wild עכברים C57Bl / 6J bred באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (UCLA). כל בעלי החיים היו בין 11 - בן 17 שבועות, וכלל זכר עכברות. כל העכברים היו שוכן קבוצה, שמור מחזור אור / חושך 12:12 עם כרצונך מזון ומים. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של UCLA והאגודה לחקר חזון הצהרת עיניים לשימוש של בעלי חי עיניים ו Vision Research.

הערה: כל התרופות והסוכנים להזרקה הן ארצות הברית Pharmacopeia (USP) ציון.

1. הכנת כירורגים

1. להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 100 מ"ג / קילו קטמין ו xylazine 8 מ"ג / קילו תערובת מלוחה. נהל הרדמה עד לעומק כך העכבר אין קמצוץ בוהן או רפלקסים מגע קרניים.
2. לשמור על טמפרטורת הגוף על 37.0 מעלות צלזיוס עם כרית מים במחזור.
3. מתרחב תלמידים עם ד עין phenylephrine 2.5%ROPs לקצץ שפם כדי להקל להדמיה. שפם לספק קלט חושי משמעותי העכבר, ולכן, זיף זמירה צריך להסיר רק את החלק כי גישה חוסמת ברורה לעין, ולא בבסיס השערה. מניסיוננו, עכברים להראות התאוששות רגילה לאחר הליך זה. החל עין methylcellulose טיפות למניעת יובש ולמזער קטרקט חולף מושרה הרדמת ^13.
4. לעקר מכשירים לפני ניתוח (כלומר, בבטאדין ואתנול או חרוזים חמים).
5. כן והעמסה מדוללת (0.01% באמצעות מי מלח 0.9%) בסביבת סטרילית (כלומר, ארון בטיחות ביולוגי) אם להדמיה תבוצע (ראה סעיף 3 להלן).

2. הזרקת הכנת האתר

1. הכין מזרק (למשל, 5 μl מזרק) עם נפח ההזרקה המתאים (למשל, 0.3 כדי 1.0 מיקרוליטר).
2. מקם את העכבר כך העין פונה כלפי מעלה נראה בבירור dissecting מיקרוסקופ.
3. בעדינות קמצוץ הלחמית הזמני עם מלקחיים קנס היטה. לעשות חתך היקפי של כ 90 מעלות באמצעות מספרי Vannas מעוקלים.
4. חזור על שלב 2.3 עם הקפסולה של שבבסיס שֶׁגֶם.
5. לכרות את רקמת החיבור שמסביב עם מלקחיים קנס היטה תוך סיבוב הגלובוס nasally. לפעול הזריקה כ 0.5 מ"מ הזמני אל עצב הראייה. השתמש בזהירות רבה כדי למנוע שיבוש סינוס רטרו מסלולית.

הזרקת 3. Sclerotomy ו subretinal

הערה: מומלץ כי הזרקת והעמסת 0.01% ב 0.9% מלוחים לשמש כדי לסייע עם להדמיה תוך לימוד הליך זה. החלוקה הטופוגרפית של והעמסה אפשר לתעד בצורה יעילה עם הדמיה הפונדוס (ראה סעיף 4 להלן).

1. ביצוע חתך scleral קטן במקום הזרקה ידי גירוד עיינית בעדינות עם להב עיני 22.5 מעלות. שו חתך זהLD להיות גדול מספיק רק כדי לאפשר את קצה המחט לעבור דרך בלובן העין.
2. הכנס את המחט מהשופעת 33 G (זוויתי 5 -. 10 ° לתוך sclerotomy עם שפוע פונה ובמקביל זוויתי לרשתית להזריק נפח רצוי (למשל, 0.3 ל 1.0 מיקרוליטר של 0.01% והעמיסו למטרות למידה).
   הערה: לשמור על סטריליות של המזרק על ידי ניקוי יסודי עם שטיפות רצופות של ממס מתאים DI מים לפני כל זריקה.
3. לוחץ על המתג לאט (מעל ~ 3 שניות) מבלי להזיז את המחט עם הפעלת לחץ.
   הערה: כאשר המחט נמצאת במרחב subretinal, התנגדות קלה תורגש בעוד מדכא את הבוכנה. לא יהיה התנגדות מינימאלית אם מחט מפוצצת הרשתית, עמידות גבוהה אם המחט אינה חודרת בלובן העין או רשתית.
4. חכו כמה שניות לפני הוצאת המחט כדי למזער backflow.
5. יש לשטוף את העין עם בופר סטרילי ולהבטיח את h העיןכמו לסובב בחזרה למצב הרגיל שלו.

הערכה 4. של הפרדות רשתית על ידי אוקטובר ו הפונדוס הדמיה

1. בצע הדמיה אוקטובר מיד לאחר ההזרקה כדי להעריך את איכות הזריקה בשלב המתאים מצביע לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך מבנה הרשתית.
   הערה: דוגמאות לשימוש של אוקטובר במחקרים דומים תוארו בעבר ^7,14.
   1. התאם וליישר את התמונה אוקטובר למקד באתר ההזרקה. הזריקה צריכה להיות קו אמצע ו -0.5 מ"מ זמני אל ראש עצב הראייה. חזור לפי הצורך אם ההתנתקות היא מחוץ למסגרת או לא מרוכז בצורה אופטימלית.
2. דמיינו היפרדות רשתית לצבוע באזור ההזרקה עם הדמיה הפונדוס en פנים ^7,14.
   הערה: אם מערכת הדמית אוקטובר אינה זמינה, הזרקה של כמות קטנה של והעמסה עם וקטור לאימון תאפשר להדמיה עם כל מצלמת הפונדוס שמבצעת angio והעמיסgraphy באמצעות אותו אורכי גל עירור וחסימת מסננים. באזורי נקודות של קרינת Hyper יוצגו מתחת בכלי הדם ואת כלי הדם יהיו גבולות חדים וברורים ככל ששטחי subretinal הוא ממוקדים בצורה נכונה. הקצה של הבועה מן הזריקה יהיה מוגדר על ידי מעבר פיגמנטציית-יתר פלואורסצנטי הצבועה. מכשירים אחדים לספק יכולת זו העכבר; המכשור משמש כאן מתואר במקומות אחרים ^14.

טיפול 5. לאחר ניתוח

1. החל מעייל עבה של קרם עיניים אנטיביוטי משולש אל פני השטח של הקרנית של העין המוזרקת.
2. מניח עכברים בכלובים בודדים נקיים להתאוששות. אין לשלב עכברים שעברו ניתוח עד שהם החלימו לחלוטין.
3. צג נשימה וטמפרטורה במהלך התאוששות הרדמה. צג חיות עד שהם יכולים לשמור על שכיבה sternal.
4. לבצע ניטור שלאחר הניתוח מתאים נוסףוטיפול, כולל הזרקה תת-עורית של carprofen (5 מ"ג / ק"ג) לניהול כאב לאחר ניתוח.

6. הערכה של תפקוד רשתית ידי Electroretinography (ERG)

1. בצע מראש הזרקת ניתוח ERG ובזמנים המתאימים לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך תפקוד הרשתית. אם נעשתה הזריקה לחלל subretinal, הפרדות הרשתית צריכות לפתור תוך 72 שעות.
   1. השתמש בטכניקות ERG תקן לאבחון תפקוד רשתית לפני ואחרי ההזרקה כפי שתואר לעיל ^14,15.

שחזור 3D 7. וכימות נפח בועה

הערה: Oct סריקות עם ניגודיות גבוהה המקיפה את הניתוק כולו בתוך המסגרת של נוף הם אופטימליות לשימוש. ImageJ / פיג'י ^17,18 ו Imaris שימשו, אך ניתן להשתמש בתוכנה אחרת.

1. לייצא את הסריקה-ב של עניין, לייבא ImageJ / פיג'י היבול (תמונה> Crop) את החלק של SC אוקטוברלהיות המודל באמצעות כלי הבחירה המלבני.
   1. לכוונון ניגודיות (תמונה> התאם> הבהירות / ניגודיות) להתוות שום גבולות חסרים על ידי חיבור שני חלקים עם קו.
   2. לצייר קו ישר עם כלי שורה (המשמרת מחזיקה) החובק את הרשתית לשכבת קולטי האור. מדוד (לנתח> מדוד) אורך הקו כדי להשיג גודל של ניתוק מירבי צעד 7.8.
2. יבוא קצוץ מסגרות תוכנת 3D-השחזור (ראה טבלה של חומרים) באמצעות "RGB לאפור" תוסף ו MATLAB מהדר זמן ריצה.
3. הגדר את גודל voxel (תחת מאפייני תמונה) באמצעות פרמטרים כיול מן הסריקה אוקטובר (x, y, z).
4. הפעל את התוסף "RGB כדי גריי" (תחת מאפייני תמונה), עם שקלול שווה כל ערוץ, כדי ליצור ערוץ רביעי. מחק ערוצים האדום-ירוק-כחול המקורי.
5. הפוך את הערוץ האפור באמצעות שינוי הניגודיות. Image Store.
6. לחץ על "להוסיףEW שטח "כפתור על כרטיסיית 3D-View, ולהתחיל בתהליך צעד 4 מודרך יוצר את פני השטח.
   1. הגדר את הפירוט פני השטח (שלב 1 מתוך 4).
      הערה: מניסיוננו 8.0 כדי 12.0 היה הטווח היעיל ביותר.
   2. הגדר את גודל כדור המרבי (תחת בחירת רקע) כדי מעט פחות מגודל הניתוק המרבי שנמדד 7.1.2. צור את השטח ולבטל היפוך ערוץ אפור (שלב 2 מתוך 4).
   3. הגדר את סף לערך המקסימאלי כך את פני השטח של הרווחים השליליים מחוץ הרשתית ושל היחידה אינו באים במגע (שלב 3 מתוך 4).
   4. הגדרת הסוג מסנן למספר ווקסלים ולבודד את החלל השלילי באתר הניתוק לפי גודל. לסיים את פני השטח (שלב 4 מתוך 4).
      הערה: היקף שטח הניתוק ממוקם מתחת נפח בלשונית הסטטיסטיקה.

Representative Results

אחורי גישת זריקות subretinal transcleral בוצעו ב -31 עיני בריאות מ -16 עכברים פראיים סוג עם זריקות של 0.3 μl (n = 18), 0.5 μl (n = 8) ו 1.0 מיקרוליטר (n = 5) של והעמסת 0.01%. עין אחת לא נכללה הזרקה בשל אטימות קרניות קיימות שמנעו ניתוח מבני ותפקודי. כל עין מוזרקת נכללת בדוח זה. אין היפרדות רשתית לא מכוונת, דקירות של רשתית הנוירו, או דליפה לתוך הזגוגית אותרו ולא הייתה שום ראיה של nicking עדשה, תגובות דלקתיות, אובאיטיס, או לאחר ניתוח זיהומים בכל עיניים ציינו.

מבנה רשתית הוערך הזרקה מראש, 10 דקות לאחר הזרקה ו -4 שבועות לאחר הזרקה באמצעות הדמית אוקטובר (איורים 2 ו -3). רשת 9 נקודות, עם נקודת המרכז שמעל במרכז הניתוק מקסימאלי, הונחה על 10 הדק 'הזרקה-פוסט en סריקת פן (איור 2 ב). באמצעות ציונים דרך כלי דם, הזרקה מראש וסריקות לאחר הזרקה 4 שבועות היו מסובבים להיות רישום עם הסריקה לאחר ההזרקה של 10 דקות. זה אפשר זיהוי בדיוק במקומות בסריקות רשתית הזרקה לפני ואחרי (איור 2 א, ג).

זריקות subretinal הביאו להיווצרות בועה כי היה מרוכזות הרחק זריקת המקום חדירה המחט בחלל subretinal (חץ התרשים 2B), והיו גם שטוח (איור 3 א) יחד עם פלוגה רדודה המשתרעת על פני שטח מורחב או כיפה (איור 3B - D) עם ניתוק עמוק באזור מוגבל (טבלה 1). בועה כיפה הוגדרה כל ניתוק כי עלה על 50 מיקרומטר מאונכים אל הרשתית. אין רוזטות, דפוס גלי מיוצר על ידי מתיחה של שכבות הרשתית החיצונית, נצפו. לשעבראוהל בתצהיר הזרקה היה דמיין עם אן-פאס אוקטובר (איור 2 ד, קו מקווקו), הדמיה הפונדוס והעמסה (איור 2E) ואוקטובר B-הסורק (איור 3). רוב blebs (29 31) תוארך מעבר לשדה הראייה של סריקות אוקטובר, אשר מקיפים כ 10% של הרשתית העכבר. לא הייתה שום שליטה על צורת בועה מלבד שכיחות מוגברת של blebs הכיפה עם כרכי הזרקה גבוהים יותר (טבלה 1). כל blebs נפתרה על ידי 2 שבועות (מידע לא מוצג).

עובי הרשתית סה"כ (הממברנה של ברוך לשכבה סיבי עצב) הוערכה כמותית 4 שבועות לאחר ההזרקה עבור 0.3 μl (איור 3 א), 0.5 μl (איור 3 ב) ו 1.0 מיקרוליטר (איור 3 ג) כרכים הזרקת בכל נקודה על ההווה הרשת מקביל ב-סורק (טבלה 1). ההבדל באחוזים (% Δ) wכפי שמחושב כמו ביחס ההבדל למדידות מראש ההזרקה לשני מדדים מבניים ותפקודיים. לא כל נקודות הרשת נרכשו במהלך כל פגישות ההדמיה. לדוגמא, 3 עיניים היו נקודות 1 או 2, 4 עיניים היו 3 או 4 נקודות, ו -23 עיניים היו 5 עד 9 נקודות בכל הסריקות. כיפה blebs שטוח, ואמצעי אחסון הזרקה היו התמוטט מאז עובי הרשתית הכולל לא היה שונה משמעותית עבור זריקות פוסט טרום, אם כי המגמה הכללית כלפי דליל רשתית נצפתה עבור שניהם (טבלה 2).

ניתוח נוסף של הנתונים הראה דליל קטן אך משמעותי מבחינה סטטיסטית של 6.5% ± 1.9 הכוללת (מראש = 196 ± 1, n = 31; פוסט = 183 ± 4, n = 31, T ₆₀ = 3.4, p = 0.001) (לוח 3). כדי לקבוע היכן דליל רשתית התרחש, קבוצת משנה של 10 עיניים שהכילו מדידות עובי 9 כל נקודות הרשת נותח. בדומה לניתוח עבור כל העיניים,משנה של עיניים גם הראה דליל רשתית כוללת קטן אך משמעותי (10.3% ± 3.5, מראש = 199 ± 1, n = 10; פוסט = 179 ± 8, n = 10, T ₁₈ = 2.4, p = 0.02). לא דליל רשתית נצפתה באתרים דיסטלי על הזריקה (7.2% ± 4.0, מראש = 199 ± 2, n = 10; פוסט = 185 ± 8, n = 10, T ₁₈ = 1.7, p = 11). דליל רשתית נצפתה באתר של היפרדות רשתית מקסימלי (11.2% ± 5.0, מראש = 201 ± 2, n = 10; פוסט = 179 ± 10, n = 10, T ₁₈ = 2.1, p = 0.04), הזריקה ללא נזק (13.8 ± 6.0, מראש = 201 ± 1, n = 4; פוסט = 173 ± 10, n = 4, T ₆ = 2.8, p = 0.03), המוזרקים עם הכליאה רשתית כאשר אזור קטן של הרשתית הוא משך דרך בלובן העין על נסיגת מחט (14.1% ± 1.0, מראש = 199 ± 1, n = 3; פוסט = 171 ± 3, n = 3, T ₄ = 8.9, p = 0.001) הזרקת אתרים עם הצטלקות (26.5% ± 1.6, מראש = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, T ₄ = 5.1, p = 0.007). בסך הכל, מאסרים התרחשו 14 מתוך 31 זריקות, 3 מתוכם הביא להיווצרות צלקת של דמית עם הפסד של עד מחצית שכבות הרשתית החיצונית (איור 3E). בכל מקרה, עם זאת, אלה היו השפעות מקומיות מאוד.

Electroretinography מלא השדה בוצע לפני הזריקה וחזר 4 שבועות לאחר הזרקה עם שינויים ביחס העריכו בנפרד לכל עין כדי להעריך שינויים פונקציונליים (טבלה 1). רק כהה מותאם ותגובות בתיווך מוט נרשמו. עצמת פונקציות תגובה צוידו משוואות מיכאליס-מנטן לגזור Vmax הוא קולטני אור (א -waves) לבין הרשתית באמצע (-waves ב). תגובות לא הושפעו צורת בועה והיו ולכן הוא התמוטט (לוח 4). חלה ירידה קטנה אך מובהקת סטטיסטית Vmax על-waves (F (1, 28) = 7.1, p = 0.013), אך לא -waves ב (F (1, 28) = 4.0, p = 0.055) לאחר ההזרקה (לוח 4). גל נציג עבור טרום לאחר ההזרקה של 0.3 μl, 0.5 μl ו 1.0 מיקרוליטר מוצגים (איור 4). היה אפקט של נפח הזרקה משני א - -waves ו- B (F (2, 28) = 6.2, p = 0.006 ו- F (2, 28) = 8.8, p = 0.001, בהתאמה).

לבסוף, מודלים 3D שימש כדי להמחיש את המבנה של שני blebs כיפה ושטוח. דוגמא בועה כיפה (איור 5 א) מראה ניתוק כיפה מלא נוזל שנמצא בתוך אזור הסריקה. דוגמאות מן blebs השטוח (איור 5 ב, ג) להראות באזורים רדודים מלא נוזל מרחיבים מעבר לאזור של הסריקה. כאשר כליאת רשתית מתרחשת, חור קטן בשחזור נתפס (5C איור). גבולות מלאכותיים מוצגים בקצה חולצת סריקהo לאפשר את שיקומה (איור 5 ג). חישוב כמויות בועה זריקות מדגם אלה עולה כי מינימום של 0.15 μl 0.01 μl היה ממוקד בהצלחה לחלל subretinal עבור 0.3 זריקות μl וכתוצאה מכך blebs כיפה ושטוח, בהתאמה. ההיקף המחושב מוזרק סביר מזלזלת הנפח בפועל בשל רזולוציה של הדמיה ושחזור, ספיגת נוזלים במהלך ההליך כפי שקורה זריקות subretinal אנושיות, ועל blebs שטוח או כיפה במיוחד, אם הניתוק כולה לא היה מיוצג סריקות OCT.

טבלת 1. פונקציונלי מבני אפקטים של זריקות subretinal ידי עין. מדדי עיני פרט ועל תוצאותיהן זריקות subretinal. תגובות רשתית לאור (-waves ב הרשתית בינונית קולטי אור -waveים) ומדידות עובי הרשתית (הממברנה של ברוך לשכבה סיבי עצב) מקבלים. הערות:
BT = בועה סוג, שטוח (F) או כיפתי (D)
^ב #gp = מספר נקודות הרשת נמדד
* עיניים העוסקות בשחזור של עוצמת זריקה.
** רק 1 רשת נקודות זמינות למדידת צלקת.
עיניים # עם היווצרות צלקת.

זְמַן	כיפתי בועה	בועה שטוחה		0.3 μl	0.5 μl	1.0 מיקרוליטר
	(מיקרומטר)	(מיקרומטר)		(מיקרומטר)	(מיקרומטר)	(מיקרומטר)
טרום הזרקה 194 ± 2	197 ± 3		195 ± 1	197 ± 1	197 ± 3
לאחר ההזרקה	176 ± 8	188 ± 3		180 ± 6	184 ± 5	192 ± 5

טבלה 2. השפעת זריקות subretinal על עובי רשתית סה"כ. ניתוח של צורת בועה ואת עוצמת זריקה על עובי רשתית.

		עובי (מיקרומטר)
אֲתַר	n (עיניים)	מִרֹאשׁ	4 wk	Δ	% Δ
הרשתית (כל נקודות התואמות)	31	196 ± 1	183 ± 4	-13 ± 4	-6.5 ± 1.9
רשתית עם כל נקודות הרשת 9 *	10	199 ± 1	179 ± 8	-20 ± 7	-10.3 ± 3.5
דיסטלי הזרקה *	10	199 ± 2	185 ± 8	-14 ± 7	-7.2 ± 4.0
מקסימאלי ניתוק *	10	201 ± 2	179 ± 10	-22 ± 9	-11.2 ± 5.0
הזרקת ללא נזק *	4	201 ± 1	173 ± 10	-28 ± 12	-13.8 ± 6.0
כליאה בבית הזרקה *	3	199 ± 1	171 ± 3	-28 ± 2	-14.1 ± 1.0
צלקת על הזרקה *	3	201 ± 3	147 ± 10	-53 ± 10	-26.5 ± 1.6

לוח 3. השפעת נזק על מבנה הרשתית. ניתוח הרזית רשתית אתר תלוי. הערות: * ניתוח מ 10 עכברים עם נתונים מכל נקודות הרשת 9.

Vmax (מיקרו-וולט)	כיפתי (n = 12)	שטוח (n = 6)	0.3 μl (n = 18)	0.5 μl (n = 8)	1.0 מיקרוליטר (n = 5)
-waves					>
טרום הזרקה	-338 ± 13	-351 ± 13	-347 ± 9	-334 ± 16	-425 ± 15
לאחר ההזרקה	-311 ± 8	-321 ± 16	-318 ± 11	-318 ± 18	-355 ± 29
-waves ב
טרום הזרקה	604 ± 30	578 ± 11	595 ± 20	542 ± 26	708 ± 21
לאחר ההזרקה	537 ± 35	551 ± 15	542 ± 24	538 ± 31	612 ± 45

בתוך-page = "1"> T מסוגל 4. השפעת זריקות subretinal על scotopic רוד בתיווך א - ו ב -waves. ניתוח של צורת בועה ואת עוצמת זריקה על תגובות רשתית לאור (-waves ב הרשתית בינונית קולטי אור -waves).

ייצוג באיור 1. סכמטי של הזרקת subretinal. סכימטי מלמעלה למטה של ​​עין עכבר בתוך השקע מציג את הגישה זריקות subretinal מסורתיות, באמצעות transcorneal (חץ א) או transcleral (ב חץ) הזרקת ליד plana pars. שיטה זו עושה שימוש בגישה transcleral ליד הקוטב האחורי (ג חץ), מושגת על ידי החלפה של העין nasally לחשוף בקוטב האחורי.les / ftp_upload / 54,808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

רישום איור 2. תמונות אוקטובר מאפשר זיהוי של רשתית אתרים עבור ניתוח עובי. AC, אן-פאס תמונת אוקטובר של העכבר 1OS באורינטציה מקורית. א) תמונה של טרום הזרקת רשתית עם רשת התאמה התמזגה. תמונת B) של 10 רשתית דקות לאחר הזרקה. רשת 9 נקודות הוצבה עם נקודת המרכז באתר של היפרדות רשתית מקסימלי. מקום ההזרקה גלוי (חץ). תמונת C) של 4 שבועות רשתית לאחר הזרקה עם רשת התאמה התמזגה. DE, תמונות של העכבר 9OS. D) אן-פאס אוקטובר תמונה של הרשתית 4 שבועות לאחר ההזרקה מראה להאריך התלישות subretinal. E)כיסוי של הפונדוס (ירוק) אן-פאס אוקטובר תמונות של 10 רשתית לאחר הזרקה דקה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. subretinal זריקות לגרום זמניים רשתית פלוגות עם מינימל רשתית דליל. אוקטובר B-סריקות נציג באתר של היפרדות רשתית מקסימלי מוצגות עבור הזרקה מראש, 10 דקות לאחר הזרקה ו -4 שבועות לאחר הזרקה. א) גיבוש ברזולוציה של בועה שטוחה מתוך הזרקת 0.3 μl. B) גיבוש ופתרון של בועה כיפה מתוך הזרקת 0.5 μl. ג) גיבוש ופתרון של בועה כיפה מתוך הזרקת 1.0 מיקרוליטר. ד) דוגמא cho החמורה הצטלקות roidal ודילול הרשתית במקום ההזרקה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

רשתיות איור 4. שמור פונקציה רגילה לאחר החלטת הבועה. Waveforms לתגובות scotopic בתיווך מוט מוצגים עבור הזרקת מראש (קו שחור) ו -4 שבועות לאחר ההזרקה (קו מקווקו אדום) עבור A) 0.3 μl, B) 0.5 μl ו- C) 1.0 זריקות μl בשעה 9 עוצמות תאורה החל 4.37 x 10 ^-6 ל 0.51 cd / m ^2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

-together.within-page = "1">
איור 5. ושחזור blebs 3D. א) תוכנה שנוצר 3D שחזורים של נציג) כיפה ו- B, C) blebs שטוח מ -0.3 זריקות μl. התגודדות היא פועל יוצא של תוכנת שחזור. גבולות מלאכותיים הונחו C כדי לאפשר שחזור. סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

זריקות subretinal הן את שיטת בחירה עבור המשלוח של וקטורים ויראליים גזע טיפול תאים שמקורם מניפולציה קולטני אור ואת הרשתית הוא במחקר בסיסי טיפול מרפאתי. בחולים, זריקות subretinal נעשים בדרך כלל עם sclerotomy הקדמי ליד פלאנה Pars, vitrectomy הליבה האחורי וחדירה של הרשתית על ידי מחט עם להדמיה ישירה. כמו במרבית ההליכים vitrectomy, זה נפוץ היווצרות קטרקט להתרחש בטרם עת, אלא אם העין היא כבר pseudophakic. בעכברים, זריקות subretinal נעשות באופן מסורתי עם קדמי sclerotomy לרשתית, שיטה קשורה לעתים קרובות עם שני nicking של העדשה, אשר תופסת את רוב החלל האחורי של העין, וחדירת Transretinal שיכול להוביל מלכוד זגוגי ומלא היפרדות רשתית. באמצעות טכניקה בגישה אחורית בעכברים מפחיתים השלכות לא רצויות אלה ומשפרת את היכולת לפרש EFfects של המניפולציה המיועדת.

היתרונות של טכניקת ההזרקה subretinal דיווחו כאן כוללות השפעות מבניות מינימלי או פונקציונלי נזק סביבתי מופחת (למשל, ערפול מן nicking העדשה, דולף זגוגי או דלקת) המאפשר הערכה קלה של תוצאות הניסוי וזמני התאוששות מהירה יותר. טכניקה זו דורשת מניפולציה גדולה יותר של העין להגיע בקוטב האחורי אך ניתן להשלים כ 10 - 15 דקות לכל עין עם שיעור הצלחה גבוה ככל אין עיניים נדחו מניתוח. ברוב המכריע של זריקות, מבנה רשתית רגיל ותפקוד נצפו בתוך 4 שבועות. לשם השוואה, מחקרים קודמים דיווחו 5 - 8 שבועות להתאוששות של מבנה ותפקוד או לא לדווח על זמן ההחלמה ^6,7. כתוצאה מכך, ניסויים יכולים להסתיים בתוך פחות זמן עם פחות בעלי חיים.

סיבוכים של טכניקת הזרקת subretinal זו כללו היווצרות צלקת ואובדןקולטני אור ב כ 10% של זריקות, עם רק שלושה מקרים של גירעונות מבניים ותפקודיים משמעותיים. הרשתית שמרה תגובות נורמליות אור עם רק הצלקת הגדולה יורדת פונקציה עד 80% של תגובת קולטי אור ו -77% של תגובה ברשתית פנימית לעומת הזרקה מראש. מאסרי רשתית עשויים להצטמצם עם שימוש מחט חדשה לכל הזרקה, אם כי זה לא הוערך במחקר הנוכחי. לחלופין, הם יכולים לנבוע מלחץ שלילי ובכך להיות בלתי נמנע. מאסרים נפוצים מאוד זריקות subretinal האדם, לעומת זאת, בגלל גודלו של העין, מאסרים מייצגים פחות נזק לרשתית הכולל. כתוצאה מכך, אם סוכן טיפולי היה מוזרק, 90% מעיניים מוזרקות יהיו זמינים עבור הערכה של ההשפעות של ההתערבות.

ההשתנות במדידות עובי רשתית לפני ואחרי הזרקת subretinal משקפות את השחזור של tהוא אוקטובר מכשיר על עכברים, הדיוק של יישור במקומות רשתית פני תמונות, ושינויים רשתית מ הזרקת מי מלח פיזיולוגיים עם צבע פלואורסצנטי במינון נמוך. מדידות אלה יכולים לשמש כדי להנחות חוקרים בחישובי כוח עבור מספר העיניים ובמקומות רשתית צורך לזהות שינויים תקפים סטטיסט כתוצאת זריקות subretinal אם סוכן טיפולי קיים. ב -10 מקרים בהם היו 9 נקודות הרשת בכל סריקות רשתית, ההשתנות של עובי הרשתית מחוץ הזריקה (5 - 8 נקודות לכל עין) היה 7.2% ± 4.0%, גם בהיעדר של רעילים או חומר תרופתי או ניוון רשתית תורשתי. השתנות כזו היא שיקול לקביעת קריטריונים להשוואה של תוצאות קליניות באמצעות מודלי עכבר לטיפולי subretinal, ו מצביעה בבירור על בקרות מתאימות כוללות הזרקת subretinal של רכב ולא עין uninjected ^3. לבסוף, אנו ממליצים investigators לעשות סריקות אוקטובר רבות של אזורי רשתית מרובים לפני ההזרקה כדי לשפר את הכיסוי של הזריקה בכל הסריקות.

יעילות טיפולית תושג סבירה כאשר סוכני ניסיוני מועברים מרחב גדול יותר של הרשתית. במקרים אלה, כמויות גדולות יותר הם אידיאליים אבל ייתכן שלא יהיה צורך כמו 0.3 זריקות μl לעתים קרובות נוצר blebs שטוח שכיסה שטח פנים רשתית גדול. צורת הבועה לא הייתה ניתן לשליטה, למרות כרכי הזרקה גדולים היוצר blebs כיפה יותר. עד 1 μl ניתן להזריק ללא תוצאות שליליות, אולם, יתכן כי blebs כיפה הופך מורחב כך נגיעות הרשתית שומר על בקפסולה האחורית של העדשה, במיוחד בעכברים צעירים עם כרכים זגוגי נמוכים. למרות הנפח נמסר מן המזרק, ההיקף בפועל ממוקד למרחב subretinal מחושב להיות פחות. זה עשוי לשקף נפח שאינו הנרכש סריקות אוקטובר, במיוחד עבור כיפה או fblebs lat, או חפץ של הסריקה אוקטובר ושחזור שלאחר מכן, אבל עשוי לשקף אובדן נפח מ backflow על משיכת המחט.

לסיכום, באמצעות גישה אחורית זריקות subretinal יש פחות סיבוכים והתאוששות משופרת, וכתוצאה מכך שיעור הצלחה גבוה של מיקוד וקצב נמוך של דרה. טכניקה זו היא אידיאלית עבור ויראלי, תרופתיות, ומניפולציות הסלולר של רשתית מכרסמת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Vannas Curved Scissors	Ted Pella, INC.	1347	5 mm Blade
22.5 Degree Microsurgery Knife	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamine
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazine
Fluorescein 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0.9% Saline USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0.9% NaCl
Antibiotic Ointment	Akorn	NDC 17478-235-35	Ophthalmic
Water Circulating Pump	Gaymar	TP-500 T/Pump	P/N 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Commercial
Fundus Camera	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Tweezers Type 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% Phenylephrine	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Ophthalmic
IMARIS8	Bitplane		Version 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose 2.5%	Goniovisc	AX0401	Methylcellulose
Eye Drops (Rinse)	Bausch & Lomb		Saline Solution
Microscope	Zeiss	Stemi 2000	Microscope
Light source	Fostec	P/N 20520	Light source