Abstract
網膜下注射は成功し、感光体への直接曝露し、網膜色素上皮（RPE）を持つinterphotoreceptor /網膜下の区画へのタンパク質の治療的介入、ウイルス剤、および細胞を送達するために、ヒトおよびげっ歯類の両方で使用されてきました。プラスミノーゲンの網膜下注射、ならびに最近の前臨床および臨床試験は、進行網膜疾患を有する個体にウイルスベクターおよび幹細胞の送達の安全性および/または有効性を実証しています。網膜疾患、特に遺伝性網膜ジストロフィーのマウスモデルは、これらの治療を試験するために不可欠です。げっ歯類で最も一般的な注入手順は、網膜の前方アプローチで小経角膜または経強切開を使用することです。このアプローチでは、注射針は、感覚神経網膜は、基礎となるRPEを中断し、挿入時に簡単にニックレンズは、非侵襲imagiのレンズ混濁や障害を引き起こすことができます浸透しますngの。経強を経由して網膜下腔へのアクセス、後方アプローチは、これらの問題を回避：針は、網膜浸透せず、視神経から約0.5mm強膜を横断し、硝子体を破壊し回避することができます。巻き添え被害は、焦点強膜切開と過渡、漿液性網膜剥離の影響に関連したものに限定されています。この方法の簡単さは、眼の損傷を最小限に抑え、迅速な網膜再付着し、回復を確保し、低故障率を持っています。最小限の網膜の損傷およびRPEは、有効性の明確な評価と治療薬自体の直接的な効果を可能にします。この原稿は、ウイルスベクター、薬剤、高い有効性、最小限の損傷、および高速回復を有するマウスにおける網膜下腔への細胞または人工多能性幹（iPS）細胞を幹細胞を標的化するために使用することができる新規な網膜下注入技術が記載されています。
Introduction
網膜下注射は、光受容体と基礎となるRPE 1,2に及ぼす影響を研究するためにマウスの網膜に細胞およびウイルス薬剤を送達するための主要な手段です。マウスのほとんどの網膜下注入プロトコルは、経角膜や赤道に経強注射部位の前方（ 図1）を使用します。このアプローチは、レンズのニッキングし、得られた白濁、感覚神経網膜および虹彩、網膜出血、実質的な網膜剥離と永続的な網膜下浮腫3-9の硝子体、浸透の完全性の破壊を含み、固有の巻き添え被害をもたらすことができます。実験操作は、治療的介入3,7,10,11の効果を評価するために、これらの影響を克服しなければなりません。この研究では、これらの合併症を回避する後方経強注入法の詳細な説明および検証を提供し、外傷を最小限にし、サブ標的の高い成功率を有しています網膜スペース。
マウスにおいて、網膜下腔をターゲット注射は、多くの場合、実行するのが非常に困難であり、ほとんどの研究者は、ベクターが誤った場所に配信されているか、重要な網膜の損傷があり、完全な網膜剥離6で例えばこれに失敗した試行の高周波を発生します。なぜなら注入合併症の分析から除外した目の数は、典型的には、マウスの研究で報告されていませんが、私たち自身の経験にし、他の研究者との議論では、失敗した注射の数は50％もの高さと経験に依存して変化させることができ、注射を行っている研究者の能力。注射の成功は、典型的には、直接眼底イメージングおよび/または光コヒーレンストモグラフィー（OCT）7,9によって評価されます。マウスでの網膜下注射のための高い成功率で簡単に習得方法の実験を早めるとTREの前臨床試験のコストを削減することができます米国における失明の主要な原因である網膜疾患のためatments。
後部、ここで説明する経強網膜下注入技術は、臨床および前臨床プロトコル9,12から適応したものです。注射したマウスで行われ、非侵襲的診断評価は軽度と高度に局在化損傷を示し、追加担保レンズ、網膜およびRPE損傷を欠いています。それにより、このような研究に関連するコストを低減すること、 - （90％以上80）さらに、比較的少ない練習で、実験者は、高い成功率と、これらの結果を達成することができます。この手順は、細胞、ウイルス、または前臨床試験における光受容体および/またはRPEへの薬理学的治療介入を提供するために、容易に実験的介入を評価するために使用することができます。
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Protocol
動物：カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）で飼育野生型C57BL / 6Jマウス。 17週齢、雄と雌のマウスが含まれて - 全ての動物は、11の間でした。全てのマウスは、グループに収容され、食物および水を自由に摂取して12：12明/暗サイクルで維持しました。全ての実験は、眼科及び視覚研究における動物の使用のためのUCLAとビジョンでの研究のための協会と眼科文の機関のガイドラインに従って行われました。
注：すべての薬や注射用薬剤は、米国薬局方（USP）グレードです。
1.外科の準備
- 100mg / kgのケタミンおよび生理食塩水の混合物中に8mg / kgのキシラジンの腹腔内注射でマウスを麻酔。マウスは全くつま先のピンチや角膜タッチ反射を持っていないような深さに麻酔を管理します。
- 循環水パッドと37.0℃の体温を維持。
- 2.5％フェニレフリンアイdの生徒を拡張ROPSと可視化を容易にするために、ウィスカーをトリミング。ひげは、マウスに重大な感覚入力を提供し、したがって、ウィスカートリミングは、眼へのブロック明確なアクセスものではなく、ウィスカのベースに一部のみを削除する必要があります。我々の経験では、マウスは、この手順の後に通常の回復を示しています。メチルセルロースの目が乾燥を防ぎ、麻酔誘発される一過性白内障13を最小限に抑えるために低下し適用します。
- 手術前に器具を滅菌する（ すなわち、ベタジンおよびエタノールまたはホットビーズ）。
- 可視化が実行される場合（下記のセクション3を参照）を無菌環境（ すなわち 、安全キャビネット）に（0.9％生理食塩水を使用して0.01％）で希釈フルオレセインを準備します。
2.インジェクションサイトの準備
- 適切な注入量（ 例えば 、0.3から1.0マイクロリットル）を有するシリンジ（ 例えば 、5μlのシリンジ）を準備します。
- 目が上向きおよびジではっきりと見えるようにマウスを置き顕微鏡をssecting。
- 優しく細かい傾いてピンセットで時間的結膜を挟ま。湾曲したVannasはさみを用いて、約90度の周方向の切開を行います。
- 根底にあるテノン嚢と繰り返し手順2.3。
- 経鼻的に地球を回転させながら、微細な先端鉗子で周囲の結合組織を切除。視神経への一時的な注射部位約0.5ミリメートルに取り組みます。眼窩の中断を避けるために細心の注意を使用してください。
3.強膜切開および網膜下注射
注：この手順を学習しながら、0.9％の生理食塩水で0.01％のフルオレセインの注入は、可視化を支援するために使用することをお勧めします。フルオレセインの地形分布が効果的に眼底イメージング（以下のセクション4を参照）で文書化することができます。
- 優しく22.5度眼科刃でアイカップを掻くことにより、注射部位での小強膜切開を行います。この切開ショウ唯一の針の先端は、強膜を通過することを可能にするのに十分な大きさで、LD。
- 面取り33 G針を挿入します（5角度を付ける-ベベルの対面と網膜に傾斜した平行な強膜切開に10°を所望の容積（目的を学習するための0.01％フルオレセインの例えば、0.3〜1.0μl）を注入します。
注：完全に各注射の前に、連続した適切な溶媒の洗浄およびDI水で洗浄することにより、注射器の無菌性を維持します。 - 針を動かすことなく、さらには圧力でゆっくりと（〜3秒以上）プランジャーを押し下げます。
注：針が網膜下腔にあるとき、プランジャを押しながら、わずかな抵抗が感じられるだろう。針が強膜またはRPEに浸透していない場合は、針が網膜、および高抵抗を穿刺する場合、最小の抵抗に全く存在しないであろう。 - 逆流を最小限に抑えるために、針を引き抜く前に、数秒待ってください。
- 滅菌緩衝生理食塩水で目を洗浄し、目の時間を確保します通常の位置に戻って回転させました。
10月と眼底イメージングによって網膜剥離の4評価
- 注射の質を評価するために、注射直後OCT撮像を行うと網膜の構造を評価するために、必要に応じて適切なタイミングでポスト噴射を指します。
注：同様の研究において、OCTの使用の例は先に7,14に記載されています。- 調整し、注射部位を標的とするためにOCT画像の位置を合わせます。注射部位は正中線と視神経乳頭への一時的な0.5ミリメートルでなければなりません。必要に応じて剥離がフレーム外であるか、最適に中央にない場合は繰り返します。
- 網膜剥離を視覚化し、専用の顔眼底イメージング7,14に注入領域を染めます。
注：OCT撮像システムが利用できない場合は、練習用ベクターとフルオレセインの少量の注入は、フルオレセイン血管を行う任意の眼底カメラと可視化を可能にします同じ励起波長ブロッキングフィルタを使用グラフィー。ハイパー蛍光の局所領域は、血管系の下に表示され、網膜下腔が正確に標的された場合、血管系は、シャープと明確な境界を持っています。注射からブレブのエッジはハイポ蛍光へのハイパーからの移行で区画されます。いくつかの機器は、マウスのためのこの機能を提供します。ここで使用される機器は他の場所14に記載されています。
5.術後ケア
- 注入された眼の角膜表面に三重の抗生物質眼科クリームの厚いコートを適用します。
- 回復のためのクリーンな孤独なケージにマウスを置きます。彼らは完全に回復されるまで、手術を受けたマウスを結合しないでください。
- 麻酔回復時の呼吸と温度を監視します。彼らは胸骨横臥位を維持することができるまで、動物を監視します。
- 追加の適切な術後の監視を行いますそして術後疼痛管理のためのカルプロフェンの皮下注射（5ミリグラム/ kg）を含む治療。
電図による網膜機能の6.アセスメント（ERG）
- ERG分析プレ噴射を実行し、適切な時間に網膜機能を評価するために、必要に応じてポスト噴射。注射は網膜下腔に行われた場合、網膜剥離は、72時間以内に解決する必要があります。
- 以前に14,15を説明したように、注射の前と後の網膜機能を評価するための標準的なERG技術を使用してください。
7. 3D復興胞ボリューム定量化
注：ビューの枠内全体剥離を網羅する高コントラストの10月スキャンが使用するために最適です。 ImageJの/フィジー17,18とIMARIS使用したが、他のソフトウェアを使用することができます。
- 関心のBスキャンをエクスポートし、ImageJを/フィジーと作物（イメージ>クロップ）10月SCの部分へのインポート長方形の選択ツールを使用してモデル化します。
- コントラスト調整（イメージ>>明るさ/コントラストを調整）し、ラインを持つ2つのセクションを接続することにより、欠落している境界線を描きます。
- 感光層へのRPEにまたがるラインツール（保持シフト）の直線を描画します。メジャー（測定>分析）ラインの長さは、ステップ7.8の最大剥離のサイズを取得します。
- インポートは、「RGBグレーに「プラグインとのMATLAB Compiler Runtimeを使用して（材料の表を参照してください）3D-再構築ソフトウェアにフレームをクロップ。
- OCTスキャン（X、Y、Z）から較正パラメータを用いて、（画像のプロパティの下）のボクセルサイズを設定します。
- 第4流路を作成するために、各チャネルに等しい重みで、（画像のプロパティの下）「RGBグレーに「プラグインを実行します。オリジナルの赤 - 緑 - 青のチャンネルを削除します。
- コントラスト変化を使用して、灰色のチャネルを反転。店舗イメージ。
- "[追加]をクリックします3Dビュー]タブでEW面」ボタン、および表面を作成するためのガイド付きの4段階のプロセスを開始します。
- 表面レベルの詳細（ステップ4の1）を設定します。
注：我々の経験では12.0から8.0が最も効果的な範囲でした。 - 7.1.2で測定された最大剥離のサイズよりやや少ないに（背景の選択の下で）最大球サイズを設定します。灰色のチャネル反転（ステップ4の2）の表面を作成し、元に戻します。
- 網膜の外側に負のスペースと剥離の表面が接触（4のステップ3）で来ることはありませんので、最大値にしきい値を設定します。
- ボクセルの数にフィルタタイプを設定し、サイズによって剥離サイト内の負の空間を分離します。表面（ステップ4の4）を終了します。
注：剥離面のボリュームが統計]タブにボリュームの下に位置しています。
- 表面レベルの詳細（ステップ4の1）を設定します。
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Representative Results
アプローチの後方経強網膜下注射は（N = 8）、1.0μL（n = 5）を、0.01％のフルオレセイン0.5μL、0.3μL（N = 18）の注射で16野生型マウスからの31の健康な眼に対して行いました。一つ目は、原因の構造と機能解析を防止し、既存の角膜混濁に注入から除外されました。すべての注入された目は、このレポートに含まれています。意図しない網膜剥離は、硝子体への神経感覚網膜、または漏れの穿刺は検出されなかったにも観察された任意の目のレンズニッキング、炎症反応、ブドウ膜炎、または手術後の感染の証拠がありました。
網膜の構造は、注入前、10分の注射後4週間のOCTイメージングを用いて、注射後（ 図2及び3）を評価しました。 9点の格子は、最大剥離の中心の上に位置する中心点で、10分間に置きました顔スキャン（ 図2B） エンポスト噴射。血管のランドマーク、プレ噴射と4週間注射後スキャンを使用すると10分の注射後スキャンの登録になるように回転させました。これは、前後の注射網膜スキャン（ 図2A、C）で正確に同じ位置の同定を可能にしました。
-網膜下注射は離れて針が浅い剥離拡張領域にわたって伸張またはドーム（ 図3Bと（ 図3A）、フラットのいずれかの網膜下腔（ 図2Bの矢印）を入力し、した注射部位からの中心であったブレブ形成をもたらしました拘束されたエリア内の深い剥離（ 表1）とD）。ドーム型ブレブはRPEに直交する50ミクロンを超えた任意の剥離と定義しました。いいえロゼット、外側の網膜層の延伸によって生産波状パターンは、観察されませんでした。元注射付着の10トンは、 顔 10月（ 図2D、破線）、フルオレセイン眼底イメージング（ 図2E）と10月B-スキャン（ 図3） エンで可視化しました。マウス網膜の約10％を含むのOCTスキャンの視野を越えて拡張ブレブの大部分（31の29）。大きな注入量（ 表1）とドーム型ブレブの頻度の増加以外のブレブ形状に対する制御はありませんでした。 2週間で解決全ブレブ（データは示さず）。
総網膜の厚さ（神経線維層にブルッフ膜）が定量的にグリッド存在上の各点で0.3μlの（ 図3A）のための注射後4週間、0.5μlの（ 図3B）および1.0μlの（ 図3C）注入量を評価しました対応するBスキャン（ 表1）。パーセント差（％Δ）ワット構造的および機能的な指標の両方のための注入前の測定の差として計算します。全ての格子点は、全てのイメージングセッション中に取得しました。たとえば、3目は1または2点を持っていた、4目は3または4点を持っていた、と23の目はすべてのスキャンに5〜9点を持っていました。網膜の菲薄化に向けた全体的な傾向は（ 表2）の両方のために認められたものの、全体の網膜の厚さは、前後の注射のための有意な差はなかったので、ドーム型とフラットブレブ、および注射容量は崩壊しました。
さらなる分析は、±6.5％の小さいが統計的に有意な間伐を示した1.9全体的な（事前= 196±1、N = 31;ポスト= 183±4、N = 31、T 60 = 3.4、P = 0.001）（ 表3）。網膜の菲薄化が発生した場所を判断するには、すべての9格子点についての厚さの測定値を含んでいた10目のサブセットを分析しました。すべての目のための分析と同様、目のサブセットは、（3.5±10.3％プレ= 199±1、N = 10;ポスト= 179±8、N = 10、T 18 = 2.4、P = 0.02）小さいが重要な全体的な網膜の菲薄化を示しました。網膜間伐ない注射部位から遠位の部位で観察されたいいえ（プレ= 199±2、4.0±7.2％、N = 10;ポスト= 185±8、N = 10、T 18 = 1.7、P = 11）。 、注射部位;網膜間伐は（ポスト= 179±10、N = 10、T 18 = 2.1、P = 0.04プレ= 201±2、N = 10、11.2％5.0±）最大網膜剥離のサイトで観察されました損傷なし;網膜監禁と（13.8±6.0、プレ= 201±1、n = 4のポスト= 173±10、n = 4の、T 6 = 2.8、P = 0.03）、注射部位の網膜の小さな領域がある場合針の撤退時に強膜を通して引っ張ら（1.0±14.1パーセント、前= 199±1、n = 3で、ポスト= 171±3、N = 3、T 4 = 8.9、P = 0.001）および瘢痕化と注射部位（26.5％ 1.6±、前= 200±3、n = 3で、POST = 147±10、N = 3、T 4 = 5.1、P = 0.007）。合計では、incarcerationsは外側の網膜層（ 図3E）の半分までの損失を伴う脈絡膜の瘢痕形成をもたらし3そのうちの14 31のうち注射で発生しました。各例では、しかしながら、これらは非常に局所的な効果でした。
フルフィールド電図は、注射の前に行われ、4週間の機能的変化（ 表1）を評価するために、各眼のために個別に評価相対的な変化を注射後に繰り返しました。唯一の暗順応と桿体媒介応答を記録しました。強度応答関数は、両方の光受容体（-waves）及び中央網膜（Bの -waves）がVmaxに導出するミカエリス-メンテン式を用いて適合させました。レスポンスはブレブ形状によって影響を受けなかったので、（ 表4）を崩壊させました。 Vmaxの上にある小さいが統計的に有意な減少がありました-waves（F（1、28）= 7.1、P = 0.013）ではないが、注射（ 表4）の後にB -waves（F（1、28）= 4.0、P = 0.055）。前および0.3μlと注射後、0.5μlの1.0μlのための代表的な波形は（ 図4）が示されています。 aとb -waves（F（2、28）= 6.2、P = 0.006およびF（2、28）= 8.8、それぞれP = 0.001、） -の両方に注射量の効果がありました。
最後に、3Dモデリングの両方ドーム及び平坦ブレブの構造を視覚化するために使用されました。ドーム型ブレブ（ 図5A）の例では、スキャン領域内に含まれるドーム状の液体で満たされた剥離を示しています。フラットブレブ（ 図5B、C）からは、例えば、スキャンの領域を超えて延びる浅い液体で満たされた領域を示しています。網膜の監禁が発生した場合、再構成中に小さな穴が（ 図5C）に見られます。人工境界は、スキャントンの端に示されていますO復興（ 図5C）ことができます。これらのサンプル注入からブレブボリュームの計算は、0.15μlの0.01μlと最小値が正常にそれぞれ、ドーム型とフラットブレブの結果0.3μlの注射のために網膜下腔に標的化されたことを示しました。全体の剥離が10月スキャンで表現されていなかった場合は可能性が注入された計算された量は、特にヒト網膜下注射で起こるよう手続き中の流体の吸収、によるイメージング・復興の解像度に実際のボリュームを過小評価し、平面またはドーム状のブレブのため。
表目で網膜下注射の1.機能と構造の影響。個々の目や網膜下注射からその成果の測定基準。光（中央網膜のb -wavesと感光体への網膜応答-wave単数または複数）および網膜の厚さの測定（神経線維層のブルッフ膜）が挙げられます。脚注：
BT =胞タイプ、フラット（F）またはドーム（D）
bは #GP =格子点の数を測定します
*注入量の再構成に使用アイズ。
**傷跡での測定のために利用可能な唯一の1格子点。
瘢痕形成を伴う＃目。
| 時間 | ドーム型ブレブ | フラット胞 | 0.3μlの | 0.5μlの | 1.0μlの | |
| （ミクロン） | （ミクロン） | （ミクロン） | （ミクロン） | （ミクロン） | ||
| プレ噴射 194±2 | 197±3 | 195±1 | 197±1 | 197±3 | ||
| ポスト噴射 | 176±8 | 188±3 | 180±6 | 184±5 | 192±5 |
総網膜の厚さに網膜下注射の表2の影響。ブレブ形状や網膜の厚さに注入量の分析。
| 厚み（μm） | |||||
| サイト | n個（目） | プレ | 4週間 | Δ | ％Δ |
| 網膜（すべての一致点） | 31 | 196±1 | 183±4 | -13±4 | -6.5±1.9 |
| 全9格子点と網膜* | 10 | 199±1 | 179±8 | -20±7 | -10.3±3.5 |
| インジェクションに対して遠位* | 10 | 199±2 | 185±8 | -14±7 | -7.2±4.0 |
| 最大剥離* | 10 | 201±2 | 179±10 | -22±9 | -11.2±5.0 |
| ダメージのないインジェクション* | 4 | 201±1 | 173±10 | -28±12 | -13.8±6.0 |
| 注射での拘禁* | 3 | 199±1 | 171±3 | -28±2 | -14.1±1.0 |
| インジェクションでスカー* | 3 | 201±3 | 147±10 | -53±10 | -26.5±1.6 |
網膜構造上の損傷の表3の影響。サイト依存の網膜間伐の分析。脚注：*全9格子点からのデータと10匹のマウスから分析。
| VMAX（μV） | ドーム型（N = 12） | フラット（N = 6） | 0.3μL（N = 18） | 0.5μlの（N = 8） | 1.0μlの（N = 5） |
| -waves | |||||
| プレ噴射 | -338±13 | -351±13 | -347±9 | -334±16 | -425±15 |
| ポスト噴射 | -311±8 | -321±16 | -318±11 | -318±18 | -355±29 |
| bは -waves | |||||
| プレ噴射 | 604±30 | 578±11 | 595±20 | 542±26 | 708±21 |
| ポスト噴射 | 537±35 | 551±15 | 542±24 | 538±31 | 612±45 |
ページ内= "1"> T 暗所視ロッド媒介に網膜下注射のできる4.効果 - 及び b -waves。ブレブ形状と光に対する網膜の応答上の注入量（中央網膜のb -wavesと感光体-waves）の分析。
網膜下注射の 図1. 略図 。ソケットでのマウスの眼のトップダウン概略図がでアプローチを示しています 伝統的な網膜下注射は、経角膜を使用して、扁平部付近または経強（矢印b）注射部位（矢印します）。この方法は、後極を露出するために経鼻目を回転させることによって達成後極（矢印c）、近く経強アプローチを使用しています。レ/ ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
OCT画像の 図2. 登録は厚分析のための網膜部位の同定を可能にします。 AC、元の位置でのマウス1OSの顔 OCT画像専用 。溶融登録グリッドと網膜プレ噴射のA）画像。網膜10分注射後のB）画像。 9点のグリッドは最大網膜剥離部位での中心点に配置しました。注射部位は、目に見える（矢印）です。溶融登録グリッドと網膜のC）画像4週間後に注射。 DE、マウス9OSの画像。ポスト噴射は、網膜下剥離の拡張を示す網膜4週間の顔 OCT画像エン D）。 E）眼底のオーバーレイ（緑）、網膜10分の注射後の顔 OCT画像専用 。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 網膜下注射は、最小限の網膜間伐で一時的な網膜剥離の原因となります。最大網膜剥離部位での代表のOCT B-スキャンは注入前、10分後に注射し、4週間後、注射のために示されています。 A）形成と0.3μlの注入からフラット胞の解像度。 B）形成と0.5μlの注入からドーム型ブレブの解像度。 1.0μlの注入からC）形成とドーム型ブレブの解像度。 D）重度の町の例注射部位のroidal瘢痕および網膜間伐。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. 網膜をブレブ決議後に正常な機能を保持します。暗順応桿体媒介応答の波形は、注入前（黒線）とAの4週間後、注射（赤点線））0.3μlを、B）0.5μlのとC）の範囲の9照度で1.0μlの注射のために示されています4.37×10 -6〜0.51 CD / m 2です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.ブレブの3D再構成。 A）ソフトウェア生成の代表Aの3D再構成）をドーム型と0.3μlの注射からB、C）フラットブレブ。リブは、再構築ソフトウェアの成果物です。人工的な境界は、再構成を可能にするためにCに入れました。スケールバー=150μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
網膜下注射は、ウイルスベクターの送達のための選択の方法であり、光受容体と基礎研究と臨床治療の両方でRPEを操作するための幹細胞を利用した治療法。患者では、網膜下注射は一般的に、直接可視化と針で、扁平部で前部強膜切開と網膜の後部コア硝子体切除術と浸透を行っています。目が偽すでにある場合を除き白内障形成が途中で発生するための最も硝子体切除手順と同じように、それが一般的です。マウスでは、網膜下注射は伝統的に、網膜への強膜切開の前方で頻繁に眼の後部空洞の大部分を占めるレンズのニッキング、および硝子体捕捉し、フルにつながることができ経網膜浸透の両方に関連した方法を行っています網膜剥離。マウスにおける後方接近法を使用すると、これらの望ましくない影響を低減し、EFを解釈する能力を向上させます意図された操作のfects。
ここで報告網膜下注入技術の利点は、最小限の構造的または機能的効果と減少巻き添え被害を含む（ 例えば、レンズニッキング、硝子体漏れや炎症から曇り）実験の結果およびより速い回復時間のより容易な評価を可能にします。この技術は後極に到達するために、目の大きい操作を必要とするが、約10で完了することができる - 何の目は分析から除外されなかったとして、高い成功率で目あたり15分。注射の大部分では、正常な網膜構造および機能は、4週間以内に観察されました。構造と機能の回復のために8週間または回復時間6,7を報告しません-比較すると、以前の研究では、5を報告します。従って、実験は、より少ない動物と短い時間で完了することができます。
この網膜下注入法の合併症は、瘢痕形成との損失が含まれていました重要な構造的および機能障害の唯一の3例と注射の約10％で光受容体、。網膜は唯一の最大の傷跡は、注射前に比べて、感光体応答の80％と内網膜応答の77％に減少関数で光に正常な応答を保持していました。これは、現在の研究で評価されなかったものの、網膜incarcerationsは、すべての注入のための新しい針を使用して減少している可能性があります。あるいは、それらは、原因負圧を発生することがあり、したがって、避けられません。目のサイズが大きい、incarcerationsは総網膜へのダメージが少ないを表すため、Incarcerationsは、しかし、人間の網膜下注射で非常に一般的です。治療剤が注入された場合その結果、注射した眼の90％が、その介入の効果の評価のために利用可能です。
網膜下注射の前と後の網膜の厚さ測定値のばらつきは、トンの再現性を反映しています彼は10月、マウス上の楽器、画像全体で網膜の位置を揃えるの精度、および低用量のフルオレセイン色素と生理食塩水の注入から網膜変化。これらの測定値は、治療薬が存在するか否かを網膜下注射の結果、統計的に有効な変化を検出するのに必要な目の網膜の位置の数のパワーの計算で研究者を導くために役立つことができます。 9格子点は、すべての網膜スキャンであった対象の10例では、注射部位の外側の網膜の厚さのばらつき（5 - 目あたり8点）があっても、毒性または非存在下では、4.0％±7.2％でした治療剤または遺伝性網膜ジストロフィー。このような変動は、網膜下の治療のためのマウスモデルを用いた臨床転帰を比較するための基準を設定するための配慮である、と強く適切なコントロールは、車両の網膜下注射ではなく、注射していない目3が含まれていることを示唆しています。最後に、我々はinvestigを奨励しますすべてのスキャンにおける注射部位のカバレッジを改善するために、注射の前に、複数の網膜の領域の多数のOCTスキャンを行うにはators。
実験薬が網膜の大きな広がりに配信されたときに治療効果は、おそらく達成されるであろう。これらのケースでは、より大きなボリュームが理想的であるが、0.3μlの注射はしばしば大きな網膜表面積をカバーフラットブレブを形成されるような必要はないかもしれません。より大きな注入量は、より多くのドーム型ブレブを生産しているが、ブレブの形状は、制御可能ではありませんでした。 1μLまでしかし、ドーム型ブレブのように、網膜のタッチを拡張し、特に低い硝子体体積の若いマウスでは、レンズの後嚢に付着してしまう可能性がある、負の結果なしに注入することができます。注射器から送達量にもかかわらず、網膜下腔に標的化実際の容積は小さくなるように算出されます。これは、特にドーム型またはfのため、10月のスキャンで取得されていないボリュームを反映することができます緯度ブレブ、または10月のスキャンとその後の復興のアーティファクトが、針の撤退時に逆流から体積減少を反映している可能性があります。
要約すると、網膜下注射用後方アプローチを使用して標的と除外の低レートの高い成功率が得られ、より少ない合併症、および改善された回収率を有しています。この技術は、げっ歯類の網膜の、ウイルス薬理学的および細胞操作のために理想的です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
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