Abstract
Subretinale Injektionen wurden bei Mensch und Nager zu liefern therapeutische Interventionen von Proteinen, viralen Mitteln und Zellen zur Interphoto / subretinalen Fach, das direkte Exposition muss Photorezeptoren und die retinalen Pigmentepithel (RPE) erfolgreich eingesetzt. Subretinale Injektionen von Plasminogen sowie die jüngsten präklinischen und klinischen Studien haben die Sicherheit nachgewiesen und / oder Wirksamkeit von mit fortgeschrittenen Netzhauterkrankungen viralen Vektoren und Stammzellen an Einzelpersonen zu liefern. Mausmodelle von Netzhauterkrankungen, insbesondere erbliche Netzhautdystrophien, sind für diese Therapien zu testen. Die häufigste Injektionsverfahren bei Nagetieren ist klein transcornealen oder transcleral Einschnitte mit einem vorderen Ansatz zur Netzhaut zu verwenden. Mit diesem Ansatz dringt die Injektionsnadel die neurosensorische Netzhaut des zugrunde liegenden RPE und beim Einsetzen stören kann leicht nick die Linse, so dass Linsentrübung und Beeinträchtigung von nicht invasiver imaging. Zugriff auf den subretinalen Raum über einen transcleral vermeidet hinteren Ansatz, diese Probleme: die Nadel durchquert die Sklera etwa 0,5 mm von der Sehnerv, ohne Netzhautpenetration und vermeidet den Glas zu stören. Kollateralschaden ist nicht auf die beschränkt, die mit der Brenn Sclerotomie zugeordnet ist, und die Auswirkungen eines vorübergehenden, seröse Netzhautablösung. Die Einfachheit des Verfahrens minimiert Augenverletzung, sorgt für eine schnelle Netzhaut Wiederanheftung und Erholung, und hat eine niedrige Ausfallrate. Die minimale Schäden an der Netzhaut und RPE ermöglicht eine klare Beurteilung der Wirksamkeit und direkten Auswirkungen der therapeutischen Mittel selbst. Diese Handschrift beschreibt eine neue subretinalen Injektionstechnik, die verwendet werden können virale Vektoren, pharmakologische Mittel zu zielen, Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) -Zellen in den subretinalen Raum in Mäusen, die mit hoher Wirksamkeit, minimale Beschädigung und schnelle Wiederherstellung.
Introduction
Subretinale Injektionen sind das wichtigste Mittel der auf der Netzhaut von Mäusen zellulären und viralen Mittel liefern ihre Auswirkungen auf die Photorezeptoren zu studieren und die zugrunde liegenden RPE 1,2. Die meisten subretinalen Injektionsprotokolle in Mäusen verwenden eine transcornealen oder eine transcleral Injektionsstelle anterioren zum Äquator (Abbildung 1). Dieser Ansatz kann in inhärenten Kollateralschäden führen , dass nicking und resultierende Trübung der Linse, Störung der Integrität des Glaskörpers, das Eindringen der neurosensorischen Netzhaut und Iris, Netzhautblutungen 3-9, erhebliche Netzhautablösungen und dauerhafte subretinalen Ödem enthält. Experimentelle Manipulationen müssen diese Effekte um 3,7,10,11 überwinden die Auswirkungen von therapeutischen Interventionen zu bewerten. Diese Studie enthält eine detaillierte Beschreibung und Validierung eines hinteren transcleral Injektionsverfahren, das diese Komplikationen vermeidet, minimiert Trauma und hat eine hohe Erfolgsquote der Unter TargetingRetina-Raum.
Einspritzungen den subretinalen Raum in Mäusen Targeting sind oft sehr schwierig durchzuführen und die meisten Forscher in denen eine hohe Frequenz von Fehlversuchen in dem der Vektor an eine falsche Stelle geliefert wird , oder es gibt signifikante Netzhautschäden, beispielsweise in einer vollständigen Netzhautablösung 6. Die Anzahl der Augen von der Analyse ausgeschlossen, da der Einspritz Komplikationen typischerweise nicht in Maus-Studien berichtet, aber in unserer eigenen Erfahrungen und in Diskussion mit anderen Forschern, kann die Anzahl von Fehleinspritzungen so hoch wie 50% und variieren abhängig von der Erfahrung und Fähigkeiten der Ermittler, die Injektionen durchführt. Der Erfolg der Injektion wird typischerweise durch direkte Fundusabbildung und / oder optische Kohärenztomographie (OCT) 7,9 beurteilt. Ein leicht zu beherrschen Verfahren mit hohen Erfolgsraten für subretinalen Injektionen in Mäuse können Experimente zu beschleunigen und die Kosten der präklinischen Studien von tre reduzierenatments für Netzhauterkrankungen, die Hauptursachen für Blindheit in den Vereinigten Staaten sind.
Der hintere, transcleral subretinalen Injektion hier beschriebene Technik ist eine Adaption von klinischen und präklinischen Protokolle 9,12. Die nicht-invasive diagnostische in injizierten Mäusen Einschätzungen zeigen, mild und stark lokalisierte Schaden und es fehlt ihnen zusätzliche Sicherheiten Linse, Netzhaut und RPE Verletzung. Darüber hinaus mit relativ wenig Übung, ein Experimentator können diese Ergebnisse mit einer hohen Erfolgsquote erreichen (80 - 90% oder mehr), um dadurch die Kosten im Zusammenhang mit solchen Studien verbunden sind, reduziert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um zelluläre, viralen oder pharmakologischen therapeutischen Interventionen zu Photorezeptoren und / oder RPE in präklinischen Studien zu liefern und zu leicht experimentellen Interventionen zu bewerten.
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Protocol
Tiere: Wildtyp C57BL / 6J-Mäuse an der Universität von Kalifornien gezüchtet in Los Angeles (UCLA). Alle Tiere wurden zwischen 11 bis 17 Wochen alt, und enthalten männlichen und weiblichen Mäusen. Alle Mäuse wurden in Gruppen gehalten, im 12:12 Hell / Dunkel - Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum gehalten. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der UCLA und der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt.
HINWEIS: Alle Medikamente und injizierbare Mittel sind United States Pharmacopeia (USP) Klasse.
1. Chirurgische Vorbereitung
- Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 8 mg / kg Xylazin in einer Salzmischung. Verwalten Anästhesie bis zu einer Tiefe, so dass die Maus keinen Zeh Prise oder Hornhaut berühren Reflexe hat.
- Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 37,0 ° C mit einem zirkulierenden Wasserpolster.
- Dilate Schüler mit 2,5% Phenylephrin Auge dROPS und trimmen Whiskers Visualisierung zu erleichtern. Whiskers bieten erhebliche sensorischen Input an die Maus daher Whisker sollten nur den Teil, dass die Blöcke übersichtlichen Zugriff auf das Auge, und nicht auf der Basis des Whiskers entfernen trimmen. Unserer Erfahrung nach zeigen Mäuse normale Erholung nach diesem Verfahren. Methyl Auge Nehmen fällt Trockenheit zu verhindern und Anästhesie induzierte transiente Katarakt 13 zu minimieren.
- Sterilisieren Instrumente vor der Operation (dh betadine und Ethanol oder heißen Kügelchen).
- Bereiten Sie verdünnten Fluorescein (0,01% mit 0,9% Kochsalzlösung) in einer sterilen Umgebung (dh Biosicherheitsschrank) , wenn Visualisierung wird durchgeführt werden (siehe Abschnitt 3 unten).
2. Injektionsstelle Vorbereitung
- Vorbereitung einer Spritze (beispielsweise 5 & mgr; l - Spritze) mit dem entsprechenden Injektionsvolumen (beispielsweise 0,3 bis 1,0 & mgr; l).
- Bewegen Sie die Maus so das Auge nach oben zeigt und deutlich sichtbar in der dissecting Mikroskop.
- kneifen Sie vorsichtig die zeitliche Bindehaut mit feiner Spitze Pinzette. Machen Sie einen umlaufenden Einschnitt von etwa 90 Grad mit gekrümmten Vannas Schere.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3 mit der darunterliegenden Tenon-Kapsel.
- Resezieren das umgebende Bindegewebe mit feinen Spitzen versehenen Zange während nasal den Globus drehen. Arbeiten an einer Injektionsstelle ca. 0,5 mm temporal der Sehnerv. Verwenden Sie große Sorgfalt zu vermeiden, dass die retro-orbitalen Sinus zu stören.
3. Sclerotomie und Subretinale Injection
HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Injektion von 0.01% Fluorescein in 0,9% Kochsalzlösung verwendet werden, mit der Visualisierung zu unterstützen, während dieser Prozedur erlernen. Die topographische Verteilung von Fluorescein kann effektiv mit Fundusaufnahmen dokumentiert werden (siehe Abschnitt 4 unten).
- Machen Sie einen kleinen Skleraeinschnitt an der Injektionsstelle, indem Sie vorsichtig das Okular mit einem 22,5-Grad-ophthalmologischen Klinge kratzen. Dieser Schnitt should nur groß genug sein, die Spitze der Nadel zu ermöglichen, durch die Sklera zu passieren.
- Legen Sie die abgeschrägte 33 G - Nadel (gewinkelt . 5 - 10 ° in die Sclerotomie mit der Kegel- und abgewinkelte parallel zur Netzhaut zugewandten Inject gewünschte Volumen (zB 0,3 bis 1,0 & mgr; l von 0,01% Fluorescein für Lernzwecke).
HINWEIS: Sterilität der Spritze beizubehalten, indem gründlich mit aufeinanderfolgenden Waschungen mit einem geeigneten Lösungsmittel und DI-Wasser vor jeder Injektion reinigen. - Drücken Sie den Kolben langsam (über ~ 3 Sekunden), ohne die Nadel zu bewegen und mit gleichmäßigem Druck.
HINWEIS: Wenn die Nadel in den subretinalen Raum ist, wird ein leichter Widerstand zu spüren sein, während der Kolben niedergedrückt. Es wird keine auf minimalen Widerstand, wenn die Nadel in die Netzhaut durchbohrt, und eine hohe Beständigkeit, wenn die Nadel nicht die Sklera oder RPE eindringt. - Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel herausgezogen Rückfluss zu minimieren.
- Spülen Sie das Auge mit steriler gepufferter Salzlösung und sorgen für die Augen hals zurück in seine normale Position gedreht wird.
4. Bewertung der Amotio OCT und Fundusimaging
- Führen OCT-Bildgebung unmittelbar nach der Injektion, die Qualität der Injektion und zu geeigneten Zeitpunkten nach der Injektion zu bewerten, wie Netzhautstruktur zu bewerten benötigt.
Hinweis: Beispiele für die Verwendung der OCT in ähnlichen Studien bisher 7,14 beschrieben wurde.- Justieren und Ausrichten der OCT-Bild der Injektionsstelle zu richten. Die Injektionsstelle sollte der Mittellinie und 0,5 mm temporal der Sehnervenkopf sein. Bei Bedarf wiederholen, wenn die Ablösung aus dem Rahmen oder nicht optimal zentriert ist.
- Visualisieren Netzhautablösung und Farbstoffinjektionsbereich mit en-face Fundus Imaging 7,14.
HINWEIS: Wenn ein OCT-Abbildungssystem nicht verfügbar ist, Einspritzen einer kleinen Menge von Fluorescein mit einem Vektor für die Praxis wird Visualisierung mit jeder Funduskamera ermöglichen, die Fluorescein angio führtgrafie die gleichen Anregungswellenlängen und Sperrfilter verwenden. Lokalisierte Bereiche der hyper-Fluoreszenz wird unter dem Gefäßsystem erscheinen und die Gefäße werden scharfe und deutliche Grenzen, wenn der subretinalen Raum richtig ausgerichtet ist. Der Rand des Bleb von der Injektion wird durch den Übergang von Hyper- zu Hypo- Fluoreszenz abgegrenzt werden. Mehrere Instrumente bieten diese Möglichkeit für die Maus; die Instrumentierung verwendet hier wird an anderer Stelle 14 beschrieben.
5. postoperative Pflege
- Tragen Sie eine dicke Schicht von Triple-antibiotische Augencreme auf der Hornhautoberfläche des injizierten Auge.
- Platzieren Sie Mäuse in einem sauberen Einzelkäfigen für Erholung. Kombinieren Sie nicht Mäuse, die Operation unterzogen haben, bis sie vollständig wiederhergestellt werden.
- Überwachen der Atmung und Temperatur während der Narkose Erholung. Überwachen Tiere, bis sie Brustlage halten können.
- Führen Sie zusätzliche geeignete postoperative Überwachungund Behandlung, einschließlich einer subkutanen Injektion von Carprofen (5 mg / kg) für die postoperative Schmerztherapie.
6. Bewertung der Retinal-Funktion durch Elektroretinogramm (ERG)
- Führen ERG Analyse vor der Injektion und zu geeigneten Zeitpunkten nach der Injektion als Funktion der Retina zu bewerten benötigt. Wenn die Injektion in den subretinalen Raum gemacht wurde, sollte die Netzhautablösung innerhalb von 72 Stunden gelöst.
- Verwenden Sie Standard - ERG Techniken Netzhautfunktion vor und nach der Injektion zu bewerten , wie zuvor beschrieben 14,15.
7. 3D-Rekonstruktion und Bleb Volume Quantifizierung
HINWEIS: Oktober-Scans mit hohem Kontrast sind für den Einsatz optimal die gesamte Distanz im Rahmen der Ansicht umfasst. ImageJ / Fiji 17,18 und Imaris wurden verwendet, aber auch andere Software verwendet werden kann.
- Exportieren Sie die b-Scan von Interesse, die Einfuhr zu ImageJ / Fidschi und Ernte (Bild> Crop) den Teil des OCT-scein zu modellierenden den rechteckigen Auswahlwerkzeug.
- Kontrast einstellen (Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast) und beschreiben die fehlenden Grenzen, indem zwei Abschnitte mit einer Linie.
- Zeichnen einer geraden Linie mit dem Zeilenwerkzeug (Halteverschiebung), die das RPE auf die Photorezeptorschicht erstreckt. Measure (Analysieren> Measure) die Länge der Liniengröße von maximal Ablösung für 7,8 Schritt zu erhalten.
- Import abgeschnitten Rahmen zum 3D-Rekonstruktionssoftware (Siehe Tabelle der Materialien), um die "RGB Gray" Plugin verwendet und MATLAB Compiler Runtime.
- Stellen Sie die Voxelgröße (unter Image-Eigenschaften) unter Verwendung der Kalibrierungsparameter aus dem OCT-Scan (x, y, z).
- Führen Sie den "RGB Gray" Plugin (unter Image-Eigenschaften), mit gleicher Gewichtung für jeden Kanal, einen vierten Kanal zu erstellen. Original löschen Rot-Grün-Blau-Kanäle.
- Kehren Sie die grauen Kanal mit Kontraständerung. Shop Bild.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen einew Oberfläche "in der 3D-Registerkarte Ansicht, und damit beginnen, die geführte 4 Schritt-Verfahren die Oberfläche zu schaffen.
- Stellen Sie die Oberfläche Detailebene (Schritt 1 von 4).
HINWEIS: Nach unserer Erfahrung 8,0-12,0 war die effektive Reichweite. - Legen Sie die maximale Kugelgröße (unter Hintergrund Auswahl) auf etwas weniger als die maximale Distanz Größe in 7.1.2 gemessen. Erstellen Sie die Oberfläche und rückgängig gemacht werden grau Kanalinversion (Schritt 2 von 4).
- Stellen Sie den Schwellenwert auf den Maximalwert, so dass die Oberfläche der negativen Räume außerhalb der Netzhaut und der Ablösung nicht in Kontakt (Schritt 3 von 4) kommen.
- Stellen Sie den Filtertyp auf die Anzahl der Voxel und den negativen Raum in der Ablösung Ort durch Größe zu isolieren. Beenden Sie die Oberfläche (Schritt 4 von 4).
HINWEIS: Das Volumen der Ablösung Oberfläche ist in der Statistik unter der Registerkarte Volumen befindet.
- Stellen Sie die Oberfläche Detailebene (Schritt 1 von 4).
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Representative Results
Posterioren Ansatz transcleral subretinalen Injektionen wurden auf 31 gesunde Augen von 16 Wildtyp-Mäusen, die mit Injektionen von 0,3 & mgr; l (n = 18), 0,5 ul (n = 8) und 1,0 ul (n = 5) von 0,01% Fluorescein. Ein Auge war von der Injektion ausgeschlossen aufgrund einer vorbestehenden Hornhauttrübung, die strukturelle und funktionelle Analyse verhindert. Jedes injizierten Auge wird in diesem Bericht enthalten. Keine unbeabsichtigte Netzhautablösungen, Einstiche der neurosensorischen Netzhaut oder Leckage in den Glaskörper nachgewiesen und es wurde keine Beweise für Linse nicking, Entzündungsreaktionen, Uveitis oder postoperative Infektionen in allen Augen beobachtet.
Wurde Retinal Struktur Voreinspritzung, 10 min nach der Injektion und 4 Wochen nach der Injektion unter Verwendung von OCT - Bildgebung (2 und 3) untersucht. Ein 9-Punkt-Raster, mit dem Punkt Zentrum das Zentrum der maximalen Distanz liegt, wurde der 10-min platziertNacheinspritzung en face - Scan (2B). bei der Registrierung zu sein, mit dem 10-Minuten-Nacheinspritzung Scan Anhand von Gefäß Sehenswürdigkeiten wurden Voreinspritzung und 4 Wochen nach der Injektion Scans gedreht. Dies ermöglichte die Identifizierung von genau den gleichen Stellen in der Vor- und Nacheinspritzung Retinascans (2A, C).
Subretinale Injektionen führten zu Bleb Formation , die von der Injektionsstelle zentriert wurde entfernt , wo die Nadel in den subretinalen Raum (2B Pfeil) eingegeben, und waren entweder flach (3A) mit einem flachen Ablösung erstreckt sich über einen ausgedehnten Bereich oder gewölbt (3B - D) mit tiefen Ablösung in einem eingeschränkten Bereich (Tabelle 1). Ein gewölbtes Bleb wurde als jede Ablösung definiert, die 50 & mgr; m senkrecht zur RPE überschritten. Keine Rosetten, ein Wellenmuster durch Verstrecken der äußeren Schichten der Netzhaut erzeugt wird, beobachtet. Die ExZelt der Injektion Abscheidung wurde mit en face OCT (2D, gestrichelte Linie), Fluorescein Fundus Imaging (Abbildung 2E) und Oktober B-Scans (Abbildung 3) sichtbar gemacht . Die Mehrheit der blebs (29 von 31) über das Sichtfeld der OCT verlängert, der etwa 10% der Netzhaut der Maus umfassen. Es gab keine Kontrolle über Bleb andere Form als die erhöhte Häufigkeit von gewölbten blebs mit größerer Injektionsvolumina (Tabelle 1). Alle von 2 Wochen gelöst blebs (Daten nicht gezeigt).
Gesamtnetzhautdicke (Bruch-Membran zu der Schicht Nervenfaser) wurde quantitativ beurteilt 4 Wochen nach der Injektion für 0,3 & mgr; l (3A), 0,5 & mgr; l (3B) und 1,0 ul (3C) Injektionsvolumen an jedem Punkt auf dem Gitter in entsprechenden b-Scans (Tabelle 1). Die prozentuale Differenz (% Δ) wals als die Differenz gegenüber den Voreinspritzung Messungen berechnet für sowohl strukturelle als auch funktionelle Metriken. Nicht alle Gitterpunkte wurden bei allen Imaging-Sitzungen erworben. Zum Beispiel hatte 3 Augen 1 oder 2 Punkte, 4 Augen hatte 3 oder 4 Punkte und 23 Augen hatten 5 bis 9 Punkte in allen Scans. Gewölbte und flache blebs und Injektionsvolumina waren zusammengebrochen , da insgesamt die Netzhautdicke für Pre- und Post-Injektionen nicht signifikant verschieden war, obwohl ein Trend zu retinalen Ausdünnung beobachtet wurde für beide (Tabelle 2).
Weitere Analysen zeigten , kleine , aber statistisch signifikante Verdünnung von 6,5% ± 1,9 Gesamt (pre = 196 ± 1, n = 31; post = 183 ± 4, n = 31, T 60 = 3,4, p = 0,001) (Tabelle 3). Um festzustellen, wo der Netzhaut Ausdünnung aufgetreten ist, eine Teilmenge von 10 Augen, die für alle neun Gitterpunkte Dickenmessungen enthielt, wurde analysiert. Ähnlich wie bei der Analyse für alle Augen,Untergruppe von Augen zeigten auch kleine , aber signifikante Gesamt retinalen Ausdünnung (10,3% ± 3,5, pre = 199 ± 1, n = 10; post = 179 ± 8, n = 10, 18 T = 2,4, p = 0,02). Keine Netzhautverdünnung wurde an Stellen distal zu der Injektionsstelle (; post = 185 ± 8, n = 10, T 18 = 1,7, p = 11 7,2% ± 4,0, pre = 199 ± 2, n = 10) beobachtet. Retinal Verdünnung wurde an der Stelle der maximalen Netzhautablösung (11,2% ± 5,0, pre = 201 ± 2, n = 10; post = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2,1, p = 0,04) beobachtet, die Injektionsstelle ohne Schaden (13,8 ± 6,0, pre = 201 ± 1, n = 4; post = 173 ± 10, n = 4, T 6 = 2,8, p = 0,03), Injektionsstellen mit retinalen Einsperrung , wenn ein kleiner Bereich der Retina durch die Sklera auf Nadel Rückzug gezogen (14,1% ± 1,0, pre = 199 ± 1, n = 3; post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8,9, p = 0,001) und die Injektionsstellen mit Vernarbung (26,5% ± 1,6, pre = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, T 4 = 5,1, p = 0,007). Insgesamt traten Inhaftierungen in 14 von 31 Injektionen, von denen 3 in der Narbenbildung der Choroidea führte mit einem Verlust von bis zu die Hälfte der äußeren Netzhautschichten (Abbildung 3E). In jedem Fall wurden diese jedoch stark lokalisierte Effekte.
Vollfeld Elektroretinographie wurde vor der Injektion durchgeführt und wiederholt , 4 Wochen nach der Injektion mit relativen Veränderungen beurteilt individuell für jedes Auge funktionellen Veränderungen zu beurteilen (Tabelle 1). Nur dunkeladaptierten und Stab-vermittelten Reaktionen wurden aufgezeichnet. Intensity - Antwort - Funktionen wurden mit Michaelis-Menten Gleichungen ausgestattet Vmax abzuleiten für beide Photorezeptoren (ein -Wellen) und der mittleren Netzhaut (b -Wellen). Die Antworten wurden nicht von Bleb Form betroffen und wurden deshalb zusammengebrochen (Tabelle 4). Es gab eine kleine, aber statistisch signifikante Abnahme der Vmax aufa -Wellen (F (1, 28) = 7,1, p = 0,013) , aber nicht b -Wellen (F (1, 28) = 4,0, p = 0,055) nach der Injektion (Tabelle 4). Repräsentative Wellenformen für prä- und post-Injektion von 0,3 & mgr; l, 0,5 & mgr; l und 1,0 & mgr; l dargestellt (Abbildung 4). Es war eine Wirkung der Injektionsvolumen sowohl auf - und b -Wellen (F (2, 28) = 6,2, p = 0,006 und F (2, 28) = 8,8, p = 0,001).
Schließlich wurde die 3D-Modellierung verwendet, um die Struktur der beiden gewölbten und flachen blebs sichtbar zu machen. Ein Beispiel für eine gewölbte Bläschen (5A) zeigt eine gewölbte fluidgefüllten Ablösung im Scannbereich enthalten. Beispiele von flachen blebs (5B, C) zeigen flache fluidgefüllten Bereiche , die über den Bereich der Abtastung verlängern. Wenn retinalen Einkerkerung auftritt, wird ein kleines Loch in der Rekonstruktion zu sehen (Abbildung 5C). Künstliche Grenzen sind am Rand eines Scans t gezeigto erlauben die Rekonstruktion (5C). Die Berechnung der Bleb Volumen dieser Probeninjektionen zeigten, dass ein Minimum von 0,15 & mgr; l und 0,01 ul erfolgreich in den subretinalen Raum für 0,3 & mgr; l-Injektionen wurde gezielt in gebogene und flache blebs resultierende sind. Das berechnete Volumen injiziert Ländern dürfte das tatsächliche Volumen aufgrund Auflösung der Bildgebung und der Rekonstruktion, die Resorption von Flüssigkeit während des Verfahrens, wie in menschlichen subretinalen Injektionen auftritt, und für flache oder gewölbte blebs besonders, wenn die gesamte Ablösung wurde nicht in den Oktober-Scans dargestellt.
Tabelle 1 : Funktionelle und strukturelle Effekte von Subretinale Injections von Eye. Metrics einzelner Augen und ihre Ergebnisse von subretinalen Injektionen. Retinal Reaktionen auf Licht (Mitte Retina b -Wellen und einen -Welle Photorezeptors) und Netzhautdickenmessungen (Bruch-Membran der Nervenfaserschicht) gegeben sind. Fußnoten:
ein BT = Bleb Typ, Wohnung (F) oder gewölbtem (D)
b #gp = Anzahl von Gitterpunkten gemessen
* Augen für den Wiederaufbau der Injektionsvolumen verwendet.
** Nur 1 Gitterpunkt für Messung bei Narbe.
# Augen mit Narbenbildung.
| Zeit | Gewölbte Bleb | Wohnung Bleb | 0,3 ul | 0,5 ul | 1,0 ul | |
| (um) | (um) | (um) | (um) | (um) | ||
| Die Voreinspritzung 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Post-Injektion | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Tabelle 2. Wirkung von Subretinale Injections auf Gesamt Retinal Dicke. Analyse von Bleb Form und Injektionsvolumen auf der Netzhautdicke.
| Dicke (um) | |||||
| Standort | n (Augen) | Vor | 4 wk | Δ | % Δ |
| Retina (alle concordant Punkte) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6.5 ± 1,9 |
| Retina mit allen 9 Gitterpunkte * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10,3 ± 3,5 |
| Distal Injection * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7,2 ± 4,0 |
| Maximal Detachment * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11,2 ± 5,0 |
| Injection ohne Schaden * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13,8 ± 6,0 |
| Einkerkerung bei Injection * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14,1 ± 1,0 |
| Scar bei Injection * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26,5 ± 1,6 |
Tabelle 3. Wirkung der Schaden auf Retinal Struktur. Analyse von ortsabhängigen Netzhautverdünnung. Fußnoten: * Analyse von 10 Mäusen , die mit Daten aus allen neun Gitterpunkten.
| Vmax ( & mgr ; V) | Gewölbte (n = 12) | Wohnung (n = 6) | 0,3 & mgr; l (n = 18) | 0,5 & mgr; l (n = 8) | 1,0 & mgr; l (n = 5) |
| ein -Wellen | |||||
| Die Voreinspritzung | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Post-Injektion | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| b -Wellen | |||||
| Die Voreinspritzung | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Post-Injektion | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
innerhalb-page = "1"> T Lage 4. Wirkung von Subretinale Injections auf Skotopische Rod-vermittelte ein - und b -Wellen. Analyse von Bleb Form und Injektionsvolumen auf die retinale Reaktionen auf Licht (Mitte Retina b -Wellen und Photorezeptor mit einer -Wellen).
Abbildung 1. Schematische Darstellung der subretinalen Injektion. Ein Top-down-Schema einer Maus Auge in der Fassung zeigt den Ansatz in traditionelle subretinalen Injektionen, eine transcornealen (Pfeil A) oder transcleral (Pfeil b) Injektionsstelle in der Nähe des Pars plana verwenden. Dieses Verfahren verwendet ein transcleral Ansatz in der Nähe des hinteren Pol (Pfeil c), erreicht durch das Auge rotierenden nasal den hinteren Pol zu belichten.les / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Registrierung von OCT - Bildern ermöglicht die Identifizierung von Retinal Seiten für Stärkenanalyse. AC, en face OCT - Bild der Maus 1os in ursprünglichen Ausrichtung. A) Bild von Retina Voreinspritzung mit verschmolzenen Registrierungsraster. B) Bild von Retina 10 min nach der Injektion. Ein 9-Punkt-Gitter wurde mit dem Mittelpunkt an der Stelle der maximalen Netzhautablösung positioniert. Injektionsstelle sichtbar ist (Pfeil). C) Bild von Retina 4 Wochen nach der Injektion mit verschmolzenen Registrierungsraster. DE, Bilder von Maus 9OS. D) En face OCT - Bild von Retina 4 Wochen nach der Injektion verlängern subretinaler Ablösung zeigt. E)Overlay von Fundus (grün) und en face OCT - Bilder der Netzhaut 10 min nach der Injektion. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Subretinale Injections Ursache Temporary Ablationes mit Minimal Retinal Ausdünnung. Repräsentative Oktober B-Scans an der Stelle der maximalen Netzhautablösung für Voreinspritzung, 10 min nach der Injektion und 4 Wochen nach der Injektion gezeigt. A) Die Bildung und Auflösung eines flachen Bleb von einer 0,3 & mgr; l - Injektion. B) Die Bildung und Auflösung von einem gewölbten Bleb von einer 0,5 & mgr; l - Injektion. C) Die Bildung und Auflösung von einem gewölbten Bleb aus einem 1,0 & mgr; l - Injektion. D) Beispiel für schwere choRoidal Narben und retinale Ausdünnung an der Injektionsstelle. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Retinae beibehalten Normale Funktion Nach Bleb Auflösung. Die Wellenformen für scotopic Stab-vermittelten Reaktionen sind für die Voreinspritzung (schwarze Linie) und 4 Wochen nach der Injektion (rote gestrichelte Linie) für A) 0,3 ul, B) 0,5 ul und C) 1,0 ul - Injektionen bei 9 Beleuchtungsstärken im Bereich gezeigt von 4,37 x 10 -6 bis 0,51 cd / m 2. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. 3D - Rekonstruktion von blebs. A) Software-generierte 3D - Rekonstruktionen von repräsentativen A) gewölbt und B, C) flach blebs von 0,3 & mgr; l - Injektionen. Ribbing ist ein Artefakt der Rekonstruktionssoftware. Künstliche Grenzen wurden in C platziert Wiederaufbau zu ermöglichen. Maßstabsbalken = 150 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Subretinale Injektionen sind die Methode der Wahl für die Lieferung von viralen Vektoren und Stammzell-abgeleiteten Therapie für Photorezeptoren und den RPE in der Grundlagenforschung und der klinischen Behandlung zu manipulieren. Bei Patienten werden subretinalen Injektionen typischerweise mit einem vorderen Sclerotomie an der Pars plana, einen hinteren Kern Vitrektomie und das Eindringen der Netzhaut durch die Nadel mit direkter Visualisierung erfolgen. Wie bei den meisten Vitrektomie Verfahren ist es üblich, für die Kataraktbildung vorzeitig auftreten, es sei denn das Auge bereits pseudophaken ist. Bei Mäusen sind subretinalen Injektionen traditionell mit der Sklerotomie ventral der Netzhaut durchgeführt, ein Verfahren häufig mit beiden Nicking der Linse zugeordnet ist, die den Großteil der hinteren Hohlraum des Auges einnimmt und transretinal Penetration, die glasigen Einklemmung führen kann und voller Netzhautablösungen. Mit einem posterior-Ansatz Technik bei Mäusen reduziert diese unerwünschten Folgen und verbessert die Fähigkeit, ef zu interpretierenfekte der beabsichtigten Manipulation.
Die Vorteile der subretinalen Injektionstechnik hier berichtet wurden, gehören minimale strukturelle oder funktionelle Effekte und reduziert Kollateralschäden (zB von Linse nicking, glasigen undichte oder Entzündung Trübung) , die leichter Beurteilung der experimentellen Ergebnisse und schnellere Wiederherstellungszeiten ermöglicht. Diese Technik erfordert eine größere Manipulation des Auges den hinteren Pol zu erreichen, kann aber in etwa 10 abgeschlossen werden - 15 Minuten pro Auge mit einer hohen Erfolgsquote, da keine Augen von der Analyse wurden abgelehnt. In der Mehrzahl der Injektionen normalen retinalen Struktur und Funktion wurde innerhalb von 4 Wochen beobachtet. Im Vergleich dazu berichten frühere Studien 5 bis 8 Wochen für die Wiederherstellung der Struktur und Funktion oder keine Recovery - Zeit 6,7 melden. Folglich können Versuche mit weniger Tiere in kurzer Zeit abgeschlossen werden.
Komplikationen dieser subretinalen Injektionstechnik inklusive Narbenbildung und VerlustPhotorezeptoren, in etwa 10% der Injektionen mit nur drei Fälle von signifikanten strukturellen und funktionellen Defiziten. Die Netzhaut zurückgehalten normale Reaktionen auf Licht mit nur der größte Narbe zu 80% der Photorezeptorantwort und 77% der inneren Netzhautreaktion gegenüber Voreinspritzung abnehmende Funktion. Retinal Einkerkerungen könnte mit der Verwendung einer neuen Nadel für jede Einspritzung reduziert werden, obwohl dies nicht in der aktuellen Studie wurde bewertet. Alternativ können sie durch Unterdruck auftreten, und somit unvermeidbar. Einkerkerungen sind in menschlichen subretinalen Injektionen sehr häufig, jedoch wegen der großen Größe des Auges, Einkerkerungen weniger Schäden an der gesamten Netzhaut darstellen. Wenn folglich ein therapeutisches Mittel injiziert worden war, 90% der injizierten Augen würde zur Auswertung der Wirkungen dieser Intervention zur Verfügung.
Die Variabilität in retinalen Dickenmessung vor und nach der subretinalen Injektion spiegelt die Reproduzierbarkeit von ter Oktober Instrument an Mäusen, die Präzision der Ausrichtung retinalen Orten in Bildern und Veränderungen der Netzhaut von der Injektion von physiologischer Kochsalzlösung mit niedriger Dosis Fluoreszeinfarbstoff. Diese Messungen können dazu dienen, die Ermittler in Leistungsberechnungen für die Anzahl der Augen und der Netzhautstellen zu führen notwendig zu erkennen, statistisch gültige Änderungen als Folge der subretinalen Injektionen, ob ein therapeutisches Mittel vorhanden ist. In den 10 Fällen, in denen 9 Gitterpunkte dort in allen Netzhautscans waren, die Variabilität der Netzhautdicke außerhalb der Injektionsstelle (5 - 8 Punkte pro Auge) betrug 7,2% ± 4,0%, selbst in Abwesenheit eines toxischen oder therapeutisches Mittel oder eine erbliche Netzhautdystrophie. Eine solche Variabilität ist eine Gegenleistung für die Kriterien für den Vergleich der klinischen Ergebnisse mit Mausmodellen für subretinalen Behandlungen Einstellung und legt nahe, dass entsprechende Kontrollen subretinalen Injektion von Fahrzeug , anstatt einen injizierten Auge 3 umfassen. Schließlich fördern wir Beobachtungsators zahlreiche OCT von mehreren retinalen Regionen vor der Injektion zur Verbesserung der Berichterstattung über die Injektionsstelle in allen Scans zu tun.
Die therapeutische Wirksamkeit wird wahrscheinlich erreicht werden, wenn experimentelle Mittel zu einer größeren Fläche der Netzhaut geliefert werden. In diesen Fällen sind größere Mengen ideal, aber nicht notwendig sein wie 0,3 & mgr; l-Injektionen oft flache blebs gebildet, die einen großen retinalen Oberfläche bedeckt. Die Bleb Form war nicht steuerbar, obwohl größere Injektionsvolumina mehr gewölbt blebs produziert. Bis zu 1 & mgr; l können ohne negative Ergebnisse injiziert werden, jedoch ist es möglich, dass gewölbte blebs, so dass die Netzhaut berührt verlängert werden und hält sich an die hintere Kapsel der Linse, vor allem bei jungen Mäusen, die mit geringen glasigen Volumina. Trotz des Volumens aus der Spritze geliefert, das tatsächliche Volumen in den subretinalen Raum ausgerichtet ist, berechnet weniger. Dies kann Volumen widerspiegeln, die nicht in den OCT erworben wird, besonders für gewölbte oder flat blebs oder ein Artefakt des OCT-Scans und die anschließende Rekonstruktion, kann aber einen Volumenverlust von Rückstau beim Zurückziehen der Nadel zu reflektieren.
weniger Komplikationen und eine verbesserte Erholung, was zu einer hohen Erfolgsquote von Targeting und niedrige Rate von Ausgrenzung Zusammengefasst hat einen hinteren Zugang für subretinalen Injektionen. Diese Technik ist ideal für die virale, pharmakologischen und zelluläre Manipulationen von Nagetier Netzhäuten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
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