Abstract
Subretinal injeksjoner har blitt brukt i både mennesker og gnagere å levere terapeutiske intervensjoner av proteiner, virale midler, og celler til interphotoreceptor / subretinal rommet som har direkte eksponering mot fotoreseptorer og retinal pigment epitel (RPE). Subretinal injeksjoner av plasminogen samt nyere prekliniske og kliniske studier har vist sikkerhet og / eller effekt av å levere virale vektorer og stamceller til personer med avansert retinal sykdom. Musemodeller av retinal sykdom, spesielt arvelig retinal dystrophies, er avgjørende for å teste disse terapi. Den vanligste injeksjonsprosedyren i gnagere er å bruke lite transcorneal eller transcleral snitt med en anterior tilnærming til netthinnen. Med denne tilnærmingen, kanylen penetrerer nevrohinnen forstyrre den underliggende RPE og ved innsetting kan lett nick objektivet, slik linse opasifikasjon og nedskrivning av ikke-invasiv Imaging. Tilgang til subretinal plass via et transcleral, unngår posterior tilnærming disse problemene: nålen krysser sclera ca 0,5 mm fra synsnerven, uten retinal penetrasjon og unngår å forstyrre glasslegemet. Collateral Damage er begrenset til at forbundet med midt sclerotomy og virkningene av en forbigående, serøs netthinneavløsning. Enkelheten av metoden minimerer okulær skade, sikrer rask retinal reattachment og utvinning, og har en lav strykprosent. Den minimale skader på netthinnen og RPE tillater klar vurdering av effekt og direkte virkninger av de terapeutiske midler i seg selv. Dette manuskriptet beskriver en ny subretinal injeksjonsteknikk som kan brukes til å målrette virale vektorer, farmakologiske midler, stamceller eller indusert pluripotent stammen (IPS) celler til subretinal plass i mus med høy effekt, minimal skade, og rask restitusjon.
Introduction
Subretinal injeksjoner er den viktigste måten å levere cellulære og virale midler til netthinne til mus for å studere deres virkninger på fotoreseptorene og den underliggende RPE 1,2. De fleste subretinal injeksjon protokoller i mus bruker en transcorneal eller en transcleral injeksjonsstedet anterior til ekvator (Figur 1). Denne tilnærmingen kan føre iboende collateral damage som inkluderer nicking og resulterende uklarhet i linsen, forstyrrelse av integriteten av glasslegemet, penetrering av nevronetthinnen og iris, retinal blødning, betydelige retinal avdelinger og varig subretinal ødem 3-9. Eksperimentelle manipulasjoner må overvinne disse effektene for å evaluere effekten av terapeutiske intervensjoner 3,7,10,11. Denne studien gir en detaljert beskrivelse og validering av en posterior transcleral injeksjon metode som unngår disse komplikasjonene, minimerer traumer og har en høy suksessrate på målretting mot underretinal plass.
Injeksjoner rettet mot subretinal plass i mus er ofte svært vanskelig å utføre, og de fleste etterforskere støter på en høy frekvens av mislykkede forsøk der vektoren blir levert til en feil plassering eller det er betydelig retinal skade, for eksempel i en komplett netthinneavløsning 6. Antallet øyne ekskludert fra analysen på grunn av injeksjons komplikasjoner er vanligvis ikke rapportert i musestudier, men i vår egen erfaring og i samarbeid med andre forskere, kan antallet mislykkede injeksjoner være så høyt som 50% og varierer avhengig av erfaring og egenskapene til etterforsker som utfører injeksjoner. Suksessen til injeksjon er vanligvis vurdert av direkte fundus bildebehandling og / eller optisk koherens tomografi (OCT) 7,9. En lett mestret metode med høy suksessrate for subretinal injeksjoner i mus kan fremskynde eksperimentering og redusere kostnadene for prekliniske studier av treatments for netthinnesykdommer som er viktige årsaker til blindhet i USA.
Den bakre, transcleral subretinal injeksjonsteknikken som beskrives her er en tilpasning fra kliniske og prekliniske protokoller 9,12. De ikke-invasiv diagnostisk vurderingene i injisert mus demonstrere mild og svært lokaliserte skader og mangler ytterligere sikkerhet linse, netthinne og RPE skade. Videre, med relativt lite praksis, kan en eksperimentator oppnå disse resultatene med en høy suksessrate (80-90% eller bedre), og dermed redusere kostnadene forbundet med slike studier. Denne prosedyren kan brukes til å levere mobilnettet, virus, eller farmakologiske terapeutiske intervensjoner til fotoreseptorene og / eller RPE i prekliniske studier og for enkelt å evaluere eksperimentelle intervensjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr: Wild typen C57Bl / 6J mus avlet ved University of California i Los Angeles (UCLA). Alle dyrene var mellom 11-17 uker gammel, og inkludert mannlige og kvinnelige mus. Alle mus ble gruppe-huset, holdes i en 12:12 lys / mørke syklus med mat og vann ad libitum. Alle forsøkene ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer UCLA og Foreningen for forskning i Vision og Ophthalmology erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og Vision Research.
MERK: Alle legemidler og injiserbare agenter er United States Pharmacopeia (USP) karakter.
1. Kirurgisk Forberedelse
- Bedøve mus med en intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg ketamin og 8 mg / kg xylazin i en saltblanding. Administrere anestesi til en dybde slik at musen har ingen tå klype eller hornhinneberørings reflekser.
- Opprettholde kroppstemperatur ved 37,0 ° C med et sirkulerende vannpute.
- Utvid elever med 2,5% fenylefrin øye dROPS og trim værhår å lette visualisering. Whiskers gi betydelig sanseinntrykk til musen derfor whisker trimming skal fjerne bare den del som blokkerer fri tilgang til øyet, og ikke til bunnen av whisker. I vår erfaring, mus viser normal gjenoppretting etter denne prosedyren. Påfør metylcellulose øyedråper for å hindre tørrhet og minimere anestesiinduserte forbigående grå stær 13.
- Sterilisere instrumenter før kirurgi (dvs. Betadine og etanol eller varme perler).
- Forbered fortynnet fluorescein (0,01% med 0,9% saltvann) i et sterilt miljø (dvs. biosikkerhet skap) hvis visualisering vil bli utført (se punkt 3 nedenfor).
2. Injeksjon klargjøring
- Fremstille en sprøyte (f.eks, 5 mL sprøyte) med hensiktsmessig injeksjonsvolum (for eksempel 0,3 til 1,0 ul).
- Plasser musen slik øyet vender opp og klart synlig i dissecting mikroskop.
- Forsiktig klemme tinning konjunktiva med fine tippet tang. Lag en omkrets snitt på ca 90 grader ved hjelp av buede Vännäs saks.
- Gjenta trinn 2.3 med underliggende Tenon sin kapsel.
- Resect omkringliggende bindevev med fine tippet tang mens du roterer kloden nasalt. Arbeid mot injeksjonsstedet ca. 0,5 mm temp på synsnerven. Bruk stor forsiktighet for å unngå å forstyrre retro-orbital sinus.
3. Sclerotomy og subretinal Injection
MERK: Det anbefales at injeksjon av 0,01% fluorescein i 0,9% salt brukes til å bistå med visualisering mens læring denne prosedyren. Den topografiske fordelingen av fluorescein kan være effektivt dokumenteres med fundus imaging (se punkt 4 nedenfor).
- Lag en liten skleral snitt på injeksjonsstedet ved å forsiktig skrape øyemusling med en 22,5-graders oftalmisk blad. Dette snittet should bare være stor nok til å tillate spissen av kanylen for å passere gjennom senehinnen.
- Sett skrå 33 G nål (vinklet 5 -. 10 ° inn i sclerotomy med skråvendt og vinklet parallelt med retina Injiser ønsket volum (f.eks 0,3 til 1,0 mL av 0,01% Fluorescein for læringsformål).
MERK: Opprettholde sterilitet av sprøyten ved grundig rengjøring med påfølgende vasker av et egnet løsemiddel og DI vann før hver injeksjon. - Trykk stempelet langsomt (i løpet av ~ 3 sek) uten å flytte nålen og med jevnt trykk.
MERK: Når nålen er i subretinal plass, vil en svak motstand merkes mens du trykker på stempelet. Det blir ingen til minimal motstand hvis nålen punkterer netthinnen, og høy motstand hvis nålen ikke trenge gjennom sclera eller RPE. - Vent i noen sekunder før kanylen trekkes ut for å minimere tilbakestrømning.
- Skyll øyet med sterilt bufret saltvann og sikre øyet hsom dreies tilbake til normal posisjon.
4. Vurdering av Netthinneavløsning av oktober og Fundus Imaging
- Utføre oktober avbildning umiddelbart etter injeksjonen for å vurdere kvaliteten av injeksjonen og ved passende tidspunkter etter injeksjon etter behov for å vurdere retinal struktur.
MERK: Eksempler på bruk av oktober i lignende studier har blitt beskrevet tidligere 7,14.- Juster og justere oktober bildet for å målrette injeksjonsstedet. Injeksjonsstedet bør være midtlinjen og 0,5 mm temp på synsnervehodet. Gjenta etter behov om avløsning er ute av rammen eller ikke optimalt sentrert.
- Visualiser netthinneavløsning og fargestoff injeksjon område med eget ansikt fundus bildebehandling 7,14.
MERK: Hvis en oktober imaging system ikke er tilgjengelig, vil injeksjon av en liten mengde av fluorescein med en vektor for praksis tillater visualisering med noen funduskamera som utfører fluorescein angiography bruker samme eksitasjonsbølgelengdene og blokkerer filtre. Lokaliserte områder av hyper-fluorescens vises under blodkar og blodkar vil ha skarpe og tydelige grenser hvis subretinal plass er rettet riktig. Kanten av bleb fra injeksjons vil bli angitt ved overgangen fra hyper hypo- fluorescens. Flere instrumenter gir denne muligheten for mus; instrumenteringen som er brukt her er beskrevet andre steder 14.
5. Postoperativ Care
- Påfør et tykt lag med trippel antibiotika oftalmisk krem til hornhinnen overflaten av den injiserte øyet.
- Plasser mus i rene ensomme bur for utvinning. Ikke kombiner mus som har gjennomgått kirurgi før de er fullt restituert.
- Overvåk åndedrett og temperatur under anestesi utvinning. Overvåk dyrene før de kan opprettholde sternal recumbency.
- Utfør ekstra passende postoperativ overvåkingog behandling, inkludert en subkutan injeksjon av karprofen (5 mg / kg) for postoperative smertekontroll.
6. Vurdering av Netthinne Funksjon av Elektroretinografi (ERG)
- Utfør ERG analyse pre-injeksjon og på passende tidspunkter etter injeksjon som nødvendig for å vurdere retinal funksjon. Hvis injeksjonen ble gjort i subretinal plass, bør netthinneavløsning løse innen 72 timer.
- Bruke standard ERG teknikker for å evaluere retinal funksjon før og etter injeksjon som beskrevet tidligere 14,15.
7. 3D Rekonstruksjon og bleb Volume Kvantifisering
MERK: oktober skanninger med høy kontrast som omfatter hele avdelingen innenfor rammen av visningen er optimal for bruk. ImageJ / Fiji 17,18 og Imaris ble brukt, men annen programvare kan brukes.
- Eksportere b-scan av interesse, import til ImageJ / Fiji og crop (Bilde> Beskjær) den delen av oktober scen å være modellert ved hjelp av den rektangulære markeringsverktøy.
- Juster kontrasten (Bilde> Juster> Lysstyrke / kontrast) og avgrense eventuelle manglende grenser ved å koble to seksjoner med en linje.
- Tegn en rett linje med linjeverktøyet (holde shift) som spenner over RPE til fotoreseptoren lag. Mål (Analyser> Measure) lengden på linjen for å få størrelsen på maksimal avløsning for trinn 7.8.
- Import beskjæres rammer til 3D-rekonstruksjon programvare (se tabell of Materials) ved hjelp av "RGB Gray" plugin og MATLAB Compiler Runtime.
- Sett voxel størrelse (under Bildeegenskaper) ved hjelp av kalibreringsparametrene fra oktober scan (x, y, z).
- Utfør "RGB til Gray" plugin (under Bildeegenskaper), med lik vekting på hver kanal, for å lage en fjerde kanal. Slett opprinnelige rød-grønn-blå kanal.
- Snu grå kanal med kontrast endring. Butikk Bilde.
- Klikk på "legg til enew overflaten "knappen i kategorien 3D-visning, og begynne guidet fire stegs prosess for å skape overflaten.
- Still overflatenivå detalj (trinn 1 av 4).
MERK: I vår erfaring 8,0 til 12,0 var den mest effektiv rekkevidde. - Angi maksimal sfære størrelse (under Bakgrunn Utvalg) til litt mindre enn den maksimale avløsning størrelse målt i 7.1.2. Lag overflaten og angre grå kanal inversjon (trinn 2 av 4).
- Angi at terskelen for å maksimalverdien slik at overflaten av de negative områder utenfor netthinnen og løsgjøring ikke kommer i kontakt (trinn 3 av 4).
- Angi at filtertype til antallet voksler, og isolere den negative plass i den løsgjøring området etter størrelse. Fullfør overflaten (trinn 4 av 4).
MERK: Volumet på avløsning overflaten er plassert under volum i kategorien statistikk.
- Still overflatenivå detalj (trinn 1 av 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Posterior approach transcleral subretinal injeksjoner ble utført på 31 friske øyne fra 16 villtype-mus med injeksjoner av 0,3 mL (n = 18), 0,5 mL (n = 8) og 1,0 mL (n = 5) på 0,01% fluorescein. Det ene øyet ble ekskludert fra injeksjon på grunn av en pre-eksisterende hornhinne som hindret strukturell og funksjonell analyse. Hver injisert øye er inkludert i denne rapporten. Ingen utilsiktede netthinneløsning, ble punkteringer av nevronetthinnen, eller lekkasje inn i glasslegemet oppdaget heller ikke var noen bevis på objektiv sammenpressing, inflammatoriske responser, uveitt, eller post-kirurgiske infeksjoner i noen øyne observert.
Retinal struktur ble målt pre-injeksjon, 10 min etter injeksjon og 4 uker etter injeksjon ved å bruke oktober imaging (figurene 2 og 3). En 9-punkts gitter, med senterpunktet ligger over midten av maksimal løsgjøring, ble plassert på den 10-minuttersetter injeksjon en face scan (figur 2B). Bruke vaskulære landemerker, pre-injeksjon og 4-ukers etter injeksjon skanner ble rotert for å være på linje med den 10 minutter etter injeksjonen scan. Dette tillot identifisering av nøyaktig de samme stedene i for- og etterinjeksjons netthinnescans (figur 2A, C).
Subretinal injeksjoner resulterte i bleb formasjon som var sentrert bort fra injeksjonsstedet hvor nålen gikk inn i subretinal plass (figur 2B pil), og var enten flat (figur 3A) med et grunt avløsning som strekker seg over en lengre område eller hvelvet (Figur 3B - D) med dyp løsrivelse i en presset område (tabell 1). En kuppel bleb ble definert som enhver avløsning som oversteg 50 mikrometer ortogonale til RPE. Ingen rosetter, et bølgemønster produsert av strekking av de ytre netthinnens lag, ble observert. extelt injeksjons deponering ble visualisert med en face oktober (figur 2D, stiplet linje), fluorescein fundus imaging (figur 2E) og OCT B-Scans (figur 3). Flertallet av blebs (29 av 31) utvidet utover synsfelt av de OCT skanner, som omfatter omtrent 10% av musen hinnen. Det var ingen kontroll over bleb form annen enn økt hyppighet av hvelvet blebs med større injeksjonsvolumer (tabell 1). Alle blebs løses av 2 uker (data ikke vist).
Total retinal tykkelse (Bruch membran til nerve fiberlaget) ble kvantitativt vurdert 4 uker etter injeksjon av 0,3 mL (figur 3A), 0,5 pl (figur 3B) og 1,0 pl (figur 3C) injeksjonsvolumer på hvert punkt på gitteret til stede i tilsvarende b-Scans (tabell 1). Den prosentvise forskjellen (% Δ) wsom beregnes som differansen i forhold til pre-injeksjon målinger for både strukturelle og funksjonelle beregninger. Ikke alle gitterpunkter ble kjøpt i alle avbildnings økter. For eksempel 3 øyne hadde 1 eller 2 poeng, 4 øyne hadde 3 eller 4 poeng, og 23 øyne hadde 5 til 9 poeng i alle skanninger. Hvelvet og flate blemmer, og injeksjonsvolumer ble kollapset siden total netthinnetykkelse var ikke signifikant forskjellig for før og etter injeksjoner, men en generell trend mot retinal tynning ble observert for begge (tabell 2).
Videre analyser viste liten, men statistisk signifikant fortynning av 6,5% ± 1,9 samlet (pre = 196 ± 1, n = 31; post = 183 ± 4, n = 31, T 60 = 3,4, p = 0,001) (tabell 3). For å finne ut hvor retinal tynning skjedde, var en undergruppe av 10 øyne som inneholdt tykkelsesmålinger for alle 9 gitterpunkter analysert. I likhet med analysen for alle øyne, iundergruppe av øyne viste også liten, men signifikant samlet retinal tynning (10,3% ± 3,5, pre = 199 ± 1, n = 10; post = 179 ± 8, n = 10, T 18 = 2,4, p = 0,02). Ingen retinal tynning ble observert på steder fjernt fra injeksjonsstedet (7,2% ± 4,0, pre = 199 ± 2, n = 10; post = 185 ± 8, n = 10, T 18 = 1,7, p = 11). Retinal tynning ble observert på stedet for maksimal netthinneavløsning (11,2% ± 5,0, pre = 201 ± 2, n = 10; post = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2,1, p = 0,04), injeksjonsstedet uten å ta skade (13,8 ± 6,0, pre = 201 ± 1, n = 4; post = 173 ± 10, n = 4, T 6 = 2,8, p = 0,03), injeksjonsstedene med retinal innesperring når et lite område av netthinnen er trekkes gjennom sklera på nålen uttak (14.1% ± 1.0, pre = 199 ± 1, n = 3; post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8,9, p = 0,001) og injeksjonsstedene med arrdannelse (26,5% ± 1,6, pre = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, T 4 = 5,1, p = 0,007). Totalt incarcerations skjedde i 14 av 31 injeksjoner, tre av som resulterte i arrdannelse av årehinnen med tap av opptil halvparten av de ytre netthinnens lag (Figur 3E). I hvert tilfelle, men disse var sterkt lokaliserte effekter.
Full-felt elektroretinografi ble utført før injeksjon og gjentatt 4 uker etter injeksjon med relative endringer vurderes individuelt for hvert øye for å vurdere funksjonelle forandringer (Tabell 1). Kun mørk-tilpasset og stang-mediert respons ble registrert. Intensitet responsfunksjoner ble utstyrt med Michaelis-Menten ligninger for å utlede Vmax for både fotoreseptorer (a -waves) og midt hinnen (b -waves). Responser ble ikke påvirket av bleb form og ble derfor sammen (tabell 4). Det var en liten, men statistisk signifikant reduksjon i Vmax påen -waves (F (1, 28) = 7,1, p = 0,013), men ikke b -waves (F (1, 28) = 4,0, p = 0,055) etter injeksjon (tabell 4). Representative bølgeformer for pre- og post-injeksjon på 0,3 mL, 0,5 mL og 1,0 mL blir vist (figur 4). Det var en effekt av injeksjonsvolum på begge a - og b -waves (F (2, 28) = 6,2, p = 0,006 og F (2, 28) = 8,8, p = 0,001, respektivt).
Til slutt, ble 3D-modellering anvendt for å visualisere strukturen av både kuppelformede og flate blebs. Et eksempel på et kuppelformet bleb (figur 5A) viser et kuppelformet væskefylt løsgjøring inneholdt i skanneområdet. Eksempler fra blebs flate (figur 5B, C) viser grunt væskefylte områder som strekker seg forbi det området av skanningen. Når retinal fengsling skjer, er et lite hull i gjenoppbyggingen sett (figur 5C). Kunstige grenser vises på kanten av en skanning to tillate gjenoppbygging (figur 5C). Beregning av bleb volumer fra disse eksempel injeksjoner indikerte at et minimum på 0,15 mL og 0,01 mL ble vellykket rettet mot subretinal plass til 0,3 mL injeksjoner som resulterer i hvelvet og flate blebs, henholdsvis. Den beregnede volumet injisert trolig undervurderer det faktiske volumet på grunn av oppløsning av bildebehandling og gjenoppbygging, resorpsjon av væske under prosedyren som oppstår i menneskelige subretinal injeksjoner, og for flat eller hvelvet blebs spesielt hvis hele avdelingen ikke var representert i OCT skanninger.
Tabell 1. Funksjonelle og strukturelle effekter av subretinal injeksjoner av Eye. Beregninger av individuelle øyne og deres resultater fra subretinal injeksjoner. Retinal respons på lys (midten netthinnen b -waves og fotoreseptoren en -waves) og retinal tykkelse målinger (Bruch membran til nerve fiber lag) er gitt. Fotnoter:
en BT = bleb Type, Flat (F) eller kuppel (D)
b #gp = antall gitterpunkter målt
* Eyes brukes til rekonstruksjon av injeksjonsvolum.
** Kun en gitterpunkt tilgjengelig for måling på arret.
# Eyes med arrdannelse.
| Tid | domed bleb | flat bleb | 0,3 mL | 0,5 ul | 1,0 mL | |
| (mikrometer) | (mikrometer) | (mikrometer) | (mikrometer) | (mikrometer) | ||
| Pre-injeksjon 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Post-injeksjon | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Tabell 2. Effekt av subretinal injeksjoner på Total netthinnetykkelse. Analyse av bleb form og injeksjonsvolum på netthinnetykkelse.
| Tykkelse (mikrometer) | |||||
| Side | N (øyne) | pre | 4 wk | Δ | % Δ |
| Retina (alle samstemmige poeng) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6,5 ± 1,9 |
| Retina med alle 9 gitterpunkter * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10,3 ± 3,5 |
| Distal til Injection * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7,2 ± 4,0 |
| Maximal Detachment * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11,2 ± 5,0 |
| Injeksjon uten Damage * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13,8 ± 6,0 |
| Fengsling på Injection * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14,1 ± 1,0 |
| Scar på Injection * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26,5 ± 1,6 |
Tabell 3. Effekt av Skade på Retinal struktur. Analyse av nettstedet avhengige retinal tynning. Fotnote: * Analyse fra 10 mus med data fra alle 9 gitterpunkter.
| Vmax (uV) | Hvelvet (n = 12) | Flat (n = 6) | 0,3 mL (n = 18) | 0,5 mL (n = 8) | 1,0 mL (n = 5) |
| a -waves | |||||
| Pre-injeksjon | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Post-injeksjon | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| b -waves | |||||
| Pre-injeksjon | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Post-injeksjon | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
innen-page = "1"> T stand 4. Effekt av subretinal injeksjoner på Scotopic Rod-mediert a - og b -waves. Analyse av bleb form og injeksjonsvolum på retinal respons på lys (midten retina b -waves og fotoreseptoren en -waves).
Figur 1. Skjematisk fremstilling av subretinal Injection. En top-down skjematisk av en mus øye på sokkelen viser tilnærming i tradisjonelle subretinal injeksjoner, ved hjelp av en transcorneal (pil a) eller transcleral (pil b) injeksjonsstedet nær pars plana. Denne metoden benytter en transcleral tilnærming nær den bakre stang (pil c), oppnås ved å dreie øyet nasalt for å eksponere den bakre pol.les / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Registrering av OCT Images Lar Identifikasjon av Retinal nettsteder for tykkelse Analysis. AC, en face oktober bilde av mus 1OS i originalretningen. A) Bilde av retina pre-injeksjon med smeltet registrering rutenett. B) Bilde av retina 10 min etter injeksjonen. En 9-punkts rutenett ble plassert med senterpunktet på stedet av maksimal netthinneavløsning. Injeksjonsstedet er synlig (pil). C) Bilde av netthinnen 4 uker etter injeksjon med smeltet registrering rutenett. DE, bilder av mus 9OS. D) En face oktober bilde av netthinnen 4 uker etter injeksjon viser forlengelse av subretinal avløsning. E)Overlegg av fundus (grønn) og en face OCT bilder av retina 10 min etter injeksjonen. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. subretinal injeksjoner forårsake midlertidig netthinneløsning med Minimal Retinal Tynning. Representative OCT B-skanninger på stedet av maksimal netthinneavløsning er vist for pre-injeksjon, 10 min etter injeksjon og 4 uker etter injeksjonen. A) Dannelse og oppløsning av en flat bleb fra en 0,3 mL injeksjon. B) Dannelse og oppløsning av et kuppelformet bleb fra en 0,5 mL injeksjon. C) Dannelse og oppløsning av et kuppelformet bleb fra en 1,0 mL injeksjon. D) Eksempel på alvorlig choroidal arrdannelse og retinal tynning på injeksjonsstedet. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. netthinne Beholde Normal funksjon Etter bleb oppløsning. Bølgeformer for scotopic stang-mediert svar er vist for pre-injeksjon (svart linje) og 4 uker etter injeksjon (rød stiplet linje) for A) 0,3 gl, B) 0,5 mL og C) 1,0 mL injeksjoner ved 9 belysning intensiteter som strekker seg fra 4,37 x 10 -6 til 0,51 cd / m 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. 3D rekonstruksjon av blemmer. A) Programvare-genererte 3D rekonstruksjoner av representative A) hvelvet og B, C) flate blebs fra 0,3 mL injeksjoner. Ribbing er en gjenstand for rekonstruksjon programvare. Kunstige grenser ble plassert i C for å tillate rekonstruksjon. Scale bar = 150 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal injeksjoner er metoden for valg for levering av virale vektorer og stamcelle-avledet terapi for å manipulere fotoreseptorene og RPE i både grunnforskning og klinisk behandling. Hos pasienter, er subretinal injeksjoner vanligvis gjort med en anterior sclerotomy på Pars plana, en bakre kjerne vitrectomy og penetrasjon av netthinnen av nålen med direkte visualisering. Som med de fleste vitrektomi prosedyrer, er det vanlig for katarakt å oppstå for tidlig, med mindre øyet er allerede pseudo. I mus, er subretinal injeksjoner tradisjonelt gjort med sclerotomy anterior til netthinnen, en metode som ofte assosiert med både sammenpressing av linsen, som opptar størstedelen av bakre hulrom i øyet, og transretinal gjennomtrengning som kan føre til glasslegemet klem og full netthinneløsning. Ved hjelp av en bakre tilnærming-teknikk i mus reduserer disse uønskede konsekvenser, og forbedrer evnen til å tolke effects av den tiltenkte manipulasjon.
Fordeler med subretinal injeksjonsteknikken rapportert her inkluderer minimale strukturelle eller funksjonelle effekter og redusert collateral damage (f.eks clouding fra objektivet sammenpressing, glasslegemet lekker eller betennelse) som gjør lettere vurdering av eksperimentelle resultater og raskere utvinning ganger. Denne teknikken krever større manipulering av øyet for å nå bakre pol, men kan være ferdig i ca 10 - 15 min per øye med en høy suksessrate som ingen øyne ble avvist fra analyse. I de fleste injeksjoner, ble normal retinal struktur og funksjon observert i løpet av 4 uker. Til sammenligning tidligere studier rapporterer 5 - 8 uker for utvinning av struktur og funksjon eller ikke rapporterer en restitusjonstid 6,7. Følgelig kan eksperimenter gjennomføres på mindre tid med færre dyr.
Komplikasjoner av denne subretinal injeksjonsteknikk inkludert arrdannelse og tap avfotoreseptorene i ca 10% av injeksjoner, med bare tre tilfeller av betydelige strukturelle og funksjonelle underskudd. Netthinnen beholdt normale reaksjoner på lys med bare den største arret avtagende funksjon til 80% av fotoreseptoren respons og 77% av indre retinal respons i forhold til pre-injeksjon. Retinal incarcerations kan reduseres med bruk av en ny nål for hver injeksjon, selv om dette ikke ble evaluert i denne studien. Alternativt kan de forekomme på grunn av undertrykk og således være uunngåelig. Incarcerations er svært vanlig i humane subretinal injeksjoner, men på grunn av den store størrelsen på øyet, incarcerations utgjør mindre skade på den totale netthinnen. Følgelig, hvis et terapeutisk middel var blitt injisert, 90% av injisert øyne ville være tilgjengelig for evaluering av virkningene av at inngrep.
Variasjonen i netthinnens tykkelse målinger før og etter subretinal injeksjon reflekterer reproduserbarhet av tHan oktober instrument på mus, presisjonen av samkjøre retinal steder over bilder og retinal endringer fra injeksjon av fysiologisk saltvann med en lav dose fluorescein fargestoff. Disse målingene kan tjene til å lede søkerne i kraftberegninger for antall øyne og retinal steder som er nødvendige for å detektere statistisk gyldige endrer seg som et resultat av subretinal injeksjoner hvorvidt eller ikke et terapeutisk middel er til stede. I de 10 tilfellene som var det 9 gitterpunkter i alle retinal skanninger, variasjonen av retinal tykkelse utenfor injeksjonsstedet (5 - 8 poeng per øye) var 7,2% ± 4,0%, selv i fravær av en giftig eller terapeutisk middel eller en arvelig retinal dystrofi. Slike variasjoner er en vurdering for å sette kriterier for sammenligning av kliniske resultater ved hjelp av musemodeller for subretinal behandlinger, og tyder på at nødvendige kontroller omfatter subretinal injeksjon av kjøretøy i stedet for en injiserte øye tre. Til slutt, oppfordrer vi investigators å gjøre mange OCT skanninger av flere retinal regioner før injeksjon for å øke dekningen av injeksjonsstedet i alle skanninger.
Terapeutisk effekt vil sannsynligvis bli oppnådd når forsøksmidler blir levert til en større flate av netthinnen. I disse tilfellene, større volumer er ideelt, men kan ikke være nødvendig da 0,3 mL injeksjoner ofte dannet flate blemmer som dekket en stor retinal areal. Den bleb Formen var ikke kontrollerbar, men større injeksjonsvolumer produsert mer hvelvet blemmer. Opp til en fil kan injiseres uten negative resultater, men det er mulig at hvelvet blebs blitt så utvidet at netthinnen innslag og fester seg til bakre kapsel av objektivet, spesielt i ung mus med lave glasslegemet volumer. Til tross for volum levert fra sprøyten, er den faktiske volumet rettet mot subretinal plass beregnet til å være mindre. Dette kan reflektere volum som ikke er kjøpt i OCT skanner, særlig for hvelvet eller fLat blemmer, eller en gjenstand av oktober skanning og påfølgende gjenoppbygging, men kan gjenspeile volumtap fra tilbakestrømning ved uttak av nålen.
I sammendraget, ved hjelp av en posterior tilnærming for subretinal injeksjoner har færre komplikasjoner og økt utvinning, noe som resulterer i en høy suksessrate på målretting og lav sats av eksklusjon. Denne teknikken er ideell for viral, farmakologiske, og cellulære manipulasjoner av gnager netthinne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
