Abstract
iniezioni sottoretinico sono stati utilizzati con successo in entrambi gli esseri umani e roditori per fornire interventi terapeutici di proteine, agenti virali, e le cellule al interphotoreceptor / vano sottoretinico che ha l'esposizione diretta ai fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). iniezioni sottoretinico di plasminogeno così come recenti studi preclinici e clinici hanno dimostrato la sicurezza e / o efficacia di erogare vettori virali e di cellule staminali per le persone con malattie della retina avanzata. modelli murini di malattie della retina, in particolare ereditaria distrofie retiniche, sono essenziali per testare queste terapie. La procedura di iniezione più comune nei roditori è utilizzare piccola transcorneal o incisioni transcleral con un approccio anteriore alla retina. Con questo approccio, l'ago per l'iniezione penetra la retina neurosensoriale interrompere il RPE sottostante e l'inserimento può facilmente nick la lente, causando opacizzazione della lente e compromissione della imagi non invasivang. Accedere allo spazio sottoretinico attraverso un transcleral, approccio posteriore evita questi problemi: l'ago attraversa la sclera circa 0,5 mm dal nervo ottico, senza penetrazione della retina ed evita interrompere il vitreo. danni collaterali è limitata a quella associata alla sclerotomie focale e gli effetti di un transitorio, sierosa distacco di retina. La semplicità del metodo minimizza lesioni oculari, assicura un rapido riattacco e recupero della retina, e ha un basso tasso di fallimento. Il minimo danno alla retina e RPE consente la chiara valutazione dell'efficacia e degli effetti diretti degli stessi agenti terapeutici. Questo manoscritto descrive una tecnica di iniezione sottoretinico romanzo che può essere utilizzato per indirizzare vettori virali, gli agenti farmacologici, le cellule staminali o cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) allo spazio sottoretinico nei topi con elevata efficacia, danni minimi, e il recupero veloce.
Introduction
Iniezioni sottoretinico sono il mezzo principale di diffondere agenti cellulari e virali per le retine di topi per studiare i loro effetti sui fotorecettori e RPE sottostante 1,2. La maggior parte dei protocolli di iniezione subretiniche nei topi utilizzano un transcorneal o di un sito di iniezione anteriore transcleral all'equatore (Figura 1). Questo approccio può causare danni collaterali intrinseca che comprende intaccare e opacità risultante della lente, rottura dell'integrità del vitreo, la penetrazione della retina neurosensoriale e iris, emorragia retinica, consistenti distacchi di retina e duratura edema sottoretinico 3-9. Manipolazioni sperimentali devono superare questi effetti al fine di valutare gli effetti degli interventi terapeutici 3,7,10,11. Questo studio fornisce una descrizione dettagliata e la validazione di un metodo di iniezione transcleral posteriore che evita queste complicazioni, riduce al minimo il trauma e ha un alto tasso di successo di mira il subspazio della retina.
Le iniezioni di targeting spazio sottoretinico nei topi sono spesso molto difficili da eseguire e la maggior parte ricercatori incontrano una alta frequenza di tentativi falliti in cui il vettore è consegnato in una posizione non corretta o non vi è significativo danni alla retina, per esempio in un distacco della retina completa 6. Il numero di occhi esclusi dall'analisi a causa di complicazioni di iniezione non è di solito indicata in studi sui topi, ma nella nostra esperienza e nella discussione con altri ricercatori, il numero di iniezioni falliti può essere alto come il 50% e variare a seconda del esperienza e capacità del ricercatore che sta eseguendo le iniezioni. Il successo della iniezione è di solito valutata mediante imaging fundus diretta e / o tomografia a coerenza ottica (OCT) 7,9. Un metodo facilmente masterizzato con alte percentuali di successo per le iniezioni sottoretiniche nei topi può accelerare la sperimentazione e ridurre il costo di studi preclinici di treatments per le malattie della retina che sono le principali cause di cecità negli Stati Uniti.
Il posteriore, transcleral tecnica di iniezione sottoretinico qui descritto è un adattamento da protocolli clinici e preclinici 9,12. Le valutazioni diagnostiche non invasive effettuate in topi iniettati dimostrano i danni lievi e altamente localizzato e non hanno l'obiettivo ulteriori garanzie, lesioni della retina e RPE. Inoltre, con relativamente poco pratica, sperimentatore può conseguire questi risultati con un alto tasso di successo (80 - 90% o superiore), riducendo così i costi associati a tali studi. Questa procedura può essere utilizzata per fornire interventi terapeutici cellulari, virali o farmacologici a fotorecettori e / o RPE in studi preclinici e valutare facilmente interventi sperimentali.
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Protocol
Animali: tipo selvaggio C57Bl / 6J topi allevati presso l'Università della California a Los Angeles (UCLA). Tutti gli animali erano tra 11-17 settimane di vita, e compresi i topi maschi e femmine. Tutti i topi sono stati alloggiati in gruppo, mantenuto in un ciclo 12:12 chiaro / scuro con cibo e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della UCLA e l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology Dichiarazione per l'uso di animali in oftalmica e Vision Research.
NOTA: Tutti i farmaci e gli agenti iniettabili sono United States Pharmacopeia (USP) di grado.
1. Preparazione chirurgica
- Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg ketamina e 8 mg / kg xylazina in un mix salina. Somministrare anestesia per una profondità tale che il mouse non ha pinch punta o riflessi tattili corneali.
- Mantenere la temperatura corporea a 37,0 ° C con un pad acqua circolante.
- Dilatare gli alunni con 2,5% fenilefrina occhio dROPS e tagliare le basette per facilitare la visualizzazione. Whiskers forniscono significativi input sensoriale al mouse, quindi, basette rifilatura dovrebbe rimuovere solo la parte che blocca l'accesso chiaro ad occhio, e non alla base del baffo. Nella nostra esperienza, i topi mostrano normale recupero dopo questa procedura. Applicare occhio metilcellulosa scende a prevenire la secchezza e ridurre al minimo anestetici indotte cataratta transitorie 13.
- Sterilizzare gli strumenti prima dell'intervento chirurgico (cioè, betadine ed etanolo o perline caldi).
- Preparare fluoresceina diluita (0,01% con soluzione fisiologica 0,9%), in un ambiente sterile (cioè, armadio biosicurezza) se verrà eseguita la visualizzazione (vedere la sezione 3).
2. Preparazione del sito di iniezione
- Preparare una siringa (ad esempio, 5 microlitri siringa) con il volume appropriato di iniezione (ad esempio 0,3 fino 1.0 mL).
- Posizionare il mouse così l'occhio è rivolto verso l'alto e chiaramente visibile nella dissecting microscopio.
- pizzicare delicatamente la congiuntiva temporale con pinza sottile a punta. Effettuare una incisione circonferenziale di circa 90 gradi con le forbici Vännäs curve.
- Ripetere il passaggio 2.3 con la capsula sottostante del Tenon.
- Resecare il tessuto connettivo circostante con pinza sottile a punta durante la rotazione del globo per via nasale. Lavorare per il sito di iniezione di circa 0,5 millimetri temporale al nervo ottico. Usare molta attenzione per evitare di interrompere il seno retro-orbitale.
3. sclerotomie e sottoretinico Iniezione
NOTA: Si raccomanda che l'iniezione di 0,01% fluoresceina nel 0,9% Saline essere usato per aiutare con la visualizzazione, mentre l'apprendimento di questa procedura. La distribuzione topografica della fluoresceina può essere efficacemente documentato con immagini fundus (vedi sezione 4).
- Fai una piccola incisione sclerale al sito di iniezione graffiando leggermente l'oculare con una lama oftalmica 22,5 gradi. Questo shou incisioneLd essere abbastanza grande da permettere alla punta dell'ago di passare attraverso la sclera soltanto.
- Inserire il smussato 33 ago G (angolato. 5 - 10 ° nel sclerotomie con lo smusso rivolto e angolata parallela alla retina Iniettare volume desiderato (ad esempio, da 0,3 a 1,0 ml di 0,01% fluoresceina a fini di apprendimento).
NOTA: Mantenere sterilità della siringa accuratamente pulizia con lavaggi successivi di un adatto solvente e acqua deionizzata prima di ciascuna iniezione. - Premere il pistone lentamente (oltre ~ 3 sec) senza spostare l'ago e con una pressione uniforme.
NOTA: quando l'ago è nello spazio sottoretinico, una leggera resistenza verrà sentito mentre si preme lo stantuffo. Non ci sarà per una resistenza minima se l'ago perfora la retina, ed elevata resistenza se l'ago non penetra la sclera o RPE. - Attendere alcuni secondi prima di estrarre l'ago per ridurre al minimo il riflusso.
- Lavare l'occhio con soluzione salina tamponata sterile e garantire l'occhio hcome ruotato nella sua posizione normale.
4. Valutazione di distacco retinico da Office e Retinografia
- Eseguire l'imaging ottobre immediatamente dopo l'iniezione per valutare la qualità della iniezione e al momento opportuno punti post-iniezione come necessario per valutare la struttura della retina.
NOTA: Esempi di utilizzo dei PTOM studi simili è stata precedentemente descritta 7,14.- Regolare e allineare l'immagine di Office per indirizzare il sito di iniezione. Il sito di iniezione deve essere linea mediana e 0,5 millimetri temporale alla testa del nervo ottico. Ripetere se necessario se il distacco è fuori della cornice o meno ottimale centrata.
- Visualizza distacco della retina e tingere zona di iniezione con bagno en-face immagini fundus 7,14.
NOTA: Se un sistema di imaging il PTOM non è disponibile, l'iniezione di una piccola quantità di fluoresceina con un vettore per la pratica consentirà visualizzazione con qualsiasi telecamera fundus che esegue fluoresceina angiografia utilizzando le stesse lunghezze d'onda di eccitazione e blocco filtri. aree localizzate di iper-fluorescenza appariranno sotto il sistema vascolare e il sistema vascolare avranno confini netti e distinti se lo spazio sottoretinico si rivolge in modo corretto. Il bordo della bozza dalla iniezione sarà delimitata dalla transizione da iper a fluorescenza ipo. Diversi strumenti forniscono questa funzionalità per il mouse; la strumentazione usata qui è descritto altrove 14.
Cura 5. post-operatoria
- Applicare uno spesso strato di crema tripla oftalmica antibiotica alla superficie della cornea dell'occhio iniettato.
- Mettere i topi in gabbie pulite solitarie per il recupero. Non combinare i topi che hanno subito un intervento chirurgico fino a quando non sono completamente recuperati.
- Monitorare la respirazione e la temperatura durante il recupero l'anestesia. Monitorare gli animali fino a che non possono mantenere la decubito sternale.
- Eseguire ulteriore monitoraggio post-operatorio adeguatoe il trattamento, compresa una iniezione sottocutanea di carprofen (5 mg / kg) per la gestione del dolore post-operatorio.
6. Valutazione della funzione della retina da Elettroretinografia (ERG)
- Eseguire l'analisi ERG pre-iniezione e al momento opportuno dopo l'iniezione come necessario per valutare la funzionalità della retina. Se l'iniezione è stata fatta nello spazio sottoretinico, il distacco di retina dovrebbe risolvere entro 72 ore.
- Utilizzare le tecniche standard ERG per valutare la funzione della retina, prima e dopo l'iniezione come descritto in precedenza 14,15.
7. La ricostruzione 3D e quantificazione Bleb Volume
NOTA: OCT scansioni con alto contrasto che comprende l'intero distaccamento all'interno della cornice di vista sono ottimali per l'uso. ImageJ / Fiji 17,18 e Imaris sono stati utilizzati, ma altri software possono essere utilizzati.
- Esportare il B-scan di interesse, l'importazione di ImageJ / Fiji e delle colture (Immagine> Ritaglia) la porzione di sc ottobreuna a modellare utilizzando lo strumento di selezione rettangolare.
- Regolare il contrasto (Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto) e delineare eventuali limiti mancanti collegando due sezioni con una linea.
- Tracciare una linea retta con il (spostamento di mantenimento) strumento linea che attraversa il RPE allo strato dei fotorecettori. Misura (Analizza> Measure) la lunghezza della linea per ottenere le dimensioni di massima distacco per la fase 7.8.
- Importa fotogrammi al software 3D-ricostruzione rifilate (Vedi tabella dei materiali) utilizzando il "RGB a grigio" plugin e MATLAB Compiler Runtime.
- Impostare la dimensione voxel (sotto Proprietà immagine) utilizzando i parametri di calibrazione dalla scansione OCT (x, y, z).
- Eseguire il plugin "RGB a Gray" (sotto Proprietà immagine), con uguale ponderazione di ogni canale, di creare un quarto canale. Eliminare i canali rosso-verde-blu originali.
- Invertire il canale di grigio utilizzando cambiamento contrasto. Image Store.
- Fare clic su "aggiungi unsuperficie ew "pulsante nella scheda 3D-View, e iniziare il processo guidato 4 fase di creazione della superficie.
- Impostare il livello di dettaglio della superficie (passaggio 1 di 4).
NOTA: Nella nostra esperienza 8,0-12,0 era la gamma più efficace. - Impostare la dimensione della sfera massimo (in Selezione Background) leggermente inferiore alla dimensione massima di distacco misurata in 7.1.2. Creare la superficie e annullare l'inversione del canale grigio (fase 2 di 4).
- Impostare la soglia al valore massimo per cui la superficie degli spazi negativi esterni della retina e il distacco non venga a contatto (passaggio 3 di 4).
- Impostare il tipo di filtro per il numero di voxel e isolare lo spazio negativo nel sito distaccata dimensioni. Finire la superficie (fase 4 di 4).
NOTA: Il volume della superficie di distacco si trova sotto il volume nella scheda statistiche.
- Impostare il livello di dettaglio della superficie (passaggio 1 di 4).
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Representative Results
Posteriori approccio iniezioni sottoretiniche transcleral sono state effettuate su 31 occhi sani da 16 topi wild type con iniezioni di 0,3 ml (n = 18), 0,5 ml (n = 8) e 1,0 ml (n = 5) di 0,01% fluoresceina. Un occhio è stato escluso dalla iniezione a causa di una opacità corneale pre-esistente che ha impedito l'analisi strutturale e funzionale. Tutti gli occhi iniettati è incluso in questo rapporto. Nessun distacco della retina non intenzionali, punture della retina neurosensoriale, o perdite nel vitreo sono stati rilevati né era alcuna prova di intaccare l'obiettivo, risposte infiammatorie, uveite, o infezioni post-chirurgiche in ogni occhi osservate.
Struttura retinica è stata valutata pre-iniezione, 10 min dopo l'iniezione e 4 settimane dopo l'iniezione utilizzando l'imaging OCT (figure 2 e 3). Una griglia 9 punti, con il punto centrale sovrastante il centro di distacco massimo, è stato posto sulla 10 minpost-iniezione l'esplorazione del volto (Figura 2B). Usando punti di riferimento vascolari, pre-iniezione e 4 settimane scansioni post-iniezione sono stati ruotato per essere in registro con la scansione 10 minuti dopo l'iniezione. Questo ha permesso l'identificazione di esattamente le stesse posizioni di iniezione scansioni della retina pre e post (Figura 2A, C).
Iniezioni sottoretinico provocato formazione bozza che è stato centrato lontano dal sito di iniezione, dove l'ago è entrato nello spazio sottoretinico (Figura 2B freccia), e poteva essere piatta (Figura 3A), con un distacco poco profondo che si estende su una superficie estesa o cupola (Figura 3B - D) con profondo distacco in una zona vincolata (Tabella 1). Una bozza a cupola è stata definita come qualsiasi distacco che ha superato 50 micron ortogonali al RPE. Non ci sono rosette, un disegno ondulato prodotto da stiramento degli strati retinici esterni, sono stati osservati. L'extenda di deposizione di iniezione è stato visualizzato con en face OCT (Figura 2D, linea tratteggiata), l'imaging fundus fluoresceina (Figura 2E) e OCT B-scansioni (Figura 3). La maggior parte delle vesciche (29 su 31) estesa oltre il campo di vista delle scansioni OCT, che comprendono circa il 10% della retina mouse. Non c'era alcun controllo su forma vescichetta diversa aumento della frequenza di vesciche a cupola con maggiori volumi di iniezione (Tabella 1). Tutti blebs risolti da 2 settimane (dati non riportati).
Spessore della retina totale (membrana di Bruch allo strato delle fibre nervose) è stata valutata quantitativamente 4 settimane dopo l'iniezione di 0,3 ml (Figura 3A), 0,5 ml (Figura 3B) e 1,0 ml (Figura 3C) volumi di iniezione in ciascun punto sulla griglia presente in corrispondente b-scansioni (Tabella 1). La differenza percentuale (% Δ) wcalcolato come differenza rispetto alle misurazioni pre-iniezione per entrambi i parametri strutturali e funzionali. Non tutti i punti della griglia sono stati acquisiti durante tutte le sessioni di imaging. Per esempio, 3 occhi avevano 1 o 2 punti, 4 occhi avevano 3 o 4 punti, e 23 occhi avevano 5 a 9 punti in tutte le scansioni. Cupola e blebs piatte, e di iniezione volumi sono stati crollati dal spessore retinico totale non era significativamente differente per pre e post-iniezioni, anche se una tendenza generale verso assottigliamento della retina è stato osservato per entrambi (Tabella 2).
Un'ulteriore analisi ha mostrato piccolo ma statisticamente significativo assottigliamento del 6,5% ± 1,9 complessiva (pre = 196 ± 1, n = 31; post = 183 ± 4, n = 31, T 60 = 3.4, p = 0,001) (Tabella 3). Per determinare dove si è verificato l'assottigliamento della retina, un sottoinsieme di 10 occhi che conteneva misure di spessore per tutti i 9 punti della griglia è stato analizzato. Simile all'analisi per tutti gli occhi, lasottoinsieme di occhi anche mostrato piccolo ma significativo assottigliamento della retina complessiva (10,3% ± 3,5, pre = 199 ± 1, n = 10; post = 179 ± 8, n = 10, T 18 = 2.4, p = 0,02). Nessun assottigliamento della retina è stata osservata nei siti distale al sito di iniezione (7,2% ± 4,0, pre = 199 ± 2, n = 10; post = 185 ± 8, n = 10, T 18 = 1.7, p = 11). Assottigliamento della retina è stata osservata nel sito di distacco retinico massimo (11,2% ± 5,0, pre = 201 ± 2, n = 10; post = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2.1, p = 0,04), il sito di iniezione senza danni (13.8 ± 6.0, pre = 201 ± 1, n = 4; post = 173 ± 10, n = 4, T 6 = 2.8, p = 0,03), sedi di iniezione ad incarcerazione retina quando una piccola regione della retina è tirato attraverso la sclera al momento della revoca ago (14,1% ± 1,0, pre = 199 ± 1, n = 3; post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8.9, p = 0.001) e di iniezione siti con cicatrici (26,5% ± 1.6, pre = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, T 4 = 5.1, p = 0,007). In totale, incarcerazioni si è verificato in 14 su 31 iniezioni, 3 dei quali hanno provocato la formazione di cicatrici della coroide con la perdita di circa la metà degli strati retinici esterni (Figura 3E). In ogni caso, tuttavia, questi erano effetti altamente localizzati.
Full-campo elettroretinografia è stata eseguita prima dell'iniezione e ripetuto 4 settimane dopo l'iniezione con i cambiamenti relativi valutati singolarmente per ciascun occhio per valutare alterazioni funzionali (Tabella 1). Solo adattati al buio e sono state registrate le risposte asta-mediata. Funzioni di risposta di intensità sono stati dotati di equazioni di Michaelis-Menten per derivare Vmax per entrambi i fotorecettori (a -waves) e la retina centrale (B -waves). Le risposte non sono state colpite da forme vescichetta e sono stati quindi crollati (Tabella 4). C'era un piccolo ma statisticamente significativo decremento Vmax suun -waves (F (1, 28) = 7.1, p = 0,013), ma non b -waves (F (1, 28) = 4.0, p = 0,055) dopo l'iniezione (Tabella 4). Forme d'onda rappresentative per pre e post-iniezione di 0,3 ml, 0,5 ml e 1,0 ml sono mostrati (Figura 4). C'era un effetto di volume di iniezione sia a - aeb -waves (F (2, 28) = 6.2, p = 0,006 e F (2, 28) = 8.8, p = 0,001, rispettivamente).
Infine, modellazione 3D è stato utilizzato per visualizzare la struttura di entrambe le vesciche a cupola e piatte. Un esempio di una bozza cupola (Figura 5A) mostra un distacco piena di liquido cupola contenuta all'interno dell'area di scansione. Esempi da blebs piatte (Figura 5B, C) mostrano zone poco profonde piene di liquido che si estendono oltre la regione della scansione. Quando si verifica detenzione retinica, un piccolo foro nella ricostruzione è visto (Figura 5C). confini artificiali sono mostrati ai margini di una t scansioneo consentire la ricostruzione (Figura 5C). Calcolo dei volumi vescichetta da queste iniezioni di esempio ha indicato che un minimo di 0,15 ml e 0,01 ml è stato preso di mira con successo nello spazio sottoretinico per 0,3 microlitri iniezioni conseguente blebs a cupola e piatte, rispettivamente. Il volume calcolato iniettato probabile sottostima il volume effettivo a causa della risoluzione delle immagini e ricostruzione, il riassorbimento di liquidi durante la procedura come accade in iniezioni sottoretiniche umani, e per blebs piane o cupola particolare, se l'intero distaccamento non è stato rappresentato nelle scansioni OCT.
Tabella 1. effetti funzionali e strutturali di sottoretinico iniezioni ad occhio. Metriche dei singoli occhi e dei loro risultati da iniezioni sottoretiniche. Le risposte della retina alla luce (retina centrale b -waves e fotorecettore un -waves) e spessore della retina misure (membrana di Bruch per strato delle fibre nervose) sono date. Note:
un tipo BT = Bleb, Flat (F) o cupola (D)
b #GP = numero di punti della griglia misurata
* Occhi utilizzati per la ricostruzione del volume di iniezione.
** Solo 1 punto della griglia a disposizione per la misurazione al cicatrice.
# Occhi con la formazione di cicatrici.
| Tempo | cupola Bleb | Bleb piatto | 0,3 ml | 0,5 ml | 1,0 ml | |
| (micron) | (micron) | (micron) | (micron) | (micron) | ||
| Pre-iniezione 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Post-iniezione | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Tabella 2. Effetto della sottoretinico iniezioni sul totale della retina spessore. Analisi di forma vescichetta e volume di iniezione dello spessore della retina.
| Spessore (micron) | |||||
| Luogo | n (occhi) | Pre | 4 settimane | Δ | Δ% |
| Retina (tutti i punti concordanti) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6.5 ± 1.9 |
| Retina con tutti i 9 punti della griglia * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10.3 ± 3.5 |
| Distale a iniezione * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7.2 ± 4.0 |
| Maximal distacco * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11.2 ± 5.0 |
| Iniezione senza danni * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13.8 ± 6.0 |
| Incarcerazione a iniezione * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14.1 ± 1.0 |
| Cicatrice a iniezione * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26.5 ± 1.6 |
Tabella 3. Effetto di danni sulla struttura della retina. Analisi di sito-dipendente assottigliamento della retina. Note: * Analisi a partire da 10 topi con i dati provenienti da tutti i 9 punti della griglia.
| Vmax (mV) | A cupola (n = 12) | Flat (n = 6) | 0,3 ml (n = 18) | 0,5 microlitri (n = 8) | 1,0 ml (n = 5) |
| a -waves | |||||
| Pre-iniezione | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Post-iniezione | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| B -waves | |||||
| Pre-iniezione | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Post-iniezione | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
entro-page = "1"> T in grado 4. Effetti di sottoretinico iniezioni su scotopica Rod-mediata una - e B -waves. Analisi di forma vescichetta e volume di iniezione sulle risposte della retina alla luce (retina centrale B -waves e fotorecettori a -waves).
Figura 1. Rappresentazione schematica di sottoretinico iniezione. A schematica dall'alto di un occhio mouse nella presa mostra l'approccio iniezioni tradizionali sottoretiniche, utilizzando un transcorneal (freccia a) o transcleral (freccia b) al sito di iniezione nei pressi della pars plana. Questo metodo utilizza un approccio transcleral vicino al polo posteriore (freccia C), ottenuta ruotando l'occhio nasale per esporre il polo posteriore.les / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Registrazione di immagini OCT consente di individuare siti retina per l'analisi di spessore. AC, volto immagine ottobre di topo 1ÖS in orientamento originale en. A) Immagine di retina pre-iniezione con griglia di registrazione fuso. B) L'immagine della retina 10 min dopo l'iniezione. Una griglia 9-punto è stato posizionato con il punto centrale nel sito di massima distacco di retina. sito di iniezione è visibile (freccia). C) L'immagine della retina 4 settimane dopo l'iniezione con griglia di registrazione fuso. DE, immagini di topo 9OS. D) volto ottobre immagine di retina 4 settimane dopo l'iniezione che mostra estendere di distacco sottoretinico En. E)Sovrapposizione di fondo (verde) e en face immagini OCT di retina 10 min dopo l'iniezione. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. sottoretinico Iniezioni causa provvisoria della retina Distaccamenti con il minimo della retina diradamento. Rappresentante OCT B-scansioni al sito di massimo distacco della retina sono mostrati per la pre-iniezione, 10 min dopo l'iniezione e 4 settimane dopo l'iniezione. A) La formazione e la risoluzione di una bozza piatta da una iniezione di 0,3 ml. B) La formazione e la risoluzione di una bozza a cupola da una iniezione di 0,5 ml. C) la formazione e la risoluzione di una bozza a cupola da una iniezione di 1,0 ml. D) Esempio di grave chocicatrici roidal e assottigliamento della retina al sito di iniezione. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. retine Conservare normale di funzionamento dopo Bleb risoluzione. Le forme d'onda per le risposte asta-mediata scotopica sono mostrati per la pre-iniezione (linea nera) e 4 settimane post-iniezione (linea rossa tratteggiata) per A) 0.3 ml, B) 0.5 ml e C) iniezioni di 1,0 microlitri a 9 intensità di illuminazione che variano da 4.37 x 10 -6 a 0,51 cd / m 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. ricostruzione 3D di vesciche. A) Software-generated ricostruzioni 3D di un rappresentante) a cupola e B, C) blebs piatti da iniezioni di 0,3 microlitri. Nervature è un artefatto di software di ricostruzione. confini artificiali sono stati collocati in C di consentire la ricostruzione. Barra di scala = 150 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
iniezioni sottoretiniche sono il metodo di scelta per la fornitura di vettori virali e terapia con cellule staminali di derivazione per manipolare fotorecettori e RPE sia nella ricerca di base e trattamento clinico. Nei pazienti, le iniezioni sottoretiniche sono in genere fatto con un sclerotomie anteriore alla pars plana, una vitrectomia nucleo posteriore e la penetrazione della retina per l'ago con visualizzazione diretta. Come con la maggior parte delle procedure vitrectomia, è comune per la formazione di cataratta a verificarsi prematuramente a meno che l'occhio è già pseudofachico. Nei topi, iniezioni sottoretiniche sono tradizionalmente realizzate con anteriore sclerotomie alla retina, un metodo frequentemente associata sia intaccare della lente, che occupa la maggior parte della cavità posteriore dell'occhio, e la penetrazione Transretinal che può portare ad intrappolamento vitreo e completa distacchi di retina. Usando una tecnica postero-approccio nei topi riduce queste conseguenze indesiderate e migliora la capacità di interpretare efdifetti della manipolazione previsto.
I vantaggi della tecnica di iniezione sottoretinico riportato qui includono effetti strutturali o funzionali minimi e ridotta danni collaterali (ad esempio, opacità da intaccare l'obiettivo, perdite del vitreo o infiammazione), che consente una più facile valutazione dei risultati sperimentali e tempi di recupero più rapidi. Questa tecnica richiede maggiore manipolazione dell'occhio per raggiungere il polo posteriore, ma può essere completata in circa 10 - 15 minuti per occhio con un alto tasso di successo senza occhi sono respinti dall'analisi. Nella maggior parte delle iniezioni, normale struttura e funzione della retina è stata osservata entro 4 settimane. In confronto, gli studi precedenti riportano 5 - 8 settimane per il recupero della struttura e della funzione o non riportano un tempo di recupero 6,7. Di conseguenza, gli esperimenti possono essere completati in meno tempo con un minor numero di animali.
Le complicanze di questa tecnica di iniezione sottoretinico inclusi formazione di cicatrici e la perdita difotorecettori a circa il 10% delle iniezioni, con solo tre casi di deficit strutturali e funzionali significativi. La retina mantenuto risposte normali alla luce con solo la più grande cicatrice funzione decrescente al 80% della risposta dei fotorecettori e il 77% della risposta retinica interna rispetto al pre-iniezione. incarcerazioni retiniche potrebbero essere ridotti con l'uso di un ago nuovo per ogni iniezione, anche se questo non è stato valutato in questo studio. In alternativa, possono verificarsi a causa della pressione negativa e quindi inevitabile. Incarcerazioni sono molto comuni in iniezioni sottoretiniche umani, tuttavia, a causa delle grandi dimensioni dell'occhio, incarcerazioni rappresentano meno danni alla retina totale. Di conseguenza, se un agente terapeutico era stato iniettato, il 90% degli occhi iniettati sarebbe disponibile per la valutazione degli effetti di tale intervento.
La variabilità nelle misurazioni dello spessore della retina prima e dopo l'iniezione sottoretinico riflette la riproducibilità di tha OCT strumento topi, la precisione di allineamento posizioni retiniche attraverso immagini e alterazioni retiniche da iniezione di soluzione salina fisiologica a basso dosaggio fluoresceina. Queste misure possono servire a guidare gli investigatori in calcoli di potenza per il numero di occhi e posizioni retiniche necessarie per rilevare cambiamenti statisticamente validi a causa di iniezioni sottoretiniche se non è presente un agente terapeutico. In 10 casi per i quali non sono stati 9 punti della griglia in tutte le scansioni della retina, la variabilità dello spessore retinico di fuori del sito di iniezione (5 - 8 punti per occhio) era del 7,2% ± 4,0%, anche in assenza di un tossica o agente terapeutico o di una distrofia retinica ereditaria. Tale variabilità è una considerazione per la definizione di criteri per il confronto dei risultati clinici utilizzando modelli murini per i trattamenti subretiniche, e suggerisce fortemente che i controlli appropriati includono iniezione sottoretinico del veicolo, piuttosto che un occhio uninjected 3. Infine, incoraggiamo investigratori di fare numerose scansioni OCT di più regioni della retina prima dell'iniezione per migliorare la copertura del sito di iniezione in tutte le scansioni.
L'efficacia terapeutica sarà probabilmente raggiunto quando gli agenti sperimentali vengono consegnati ad una maggiore distesa della retina. In questi casi, i volumi più grandi sono l'ideale, ma potrebbe non essere necessario in quanto 0,3 microlitri iniezioni spesso si formano vesciche piatti che hanno coperto una grande superficie della retina. La forma vescichetta non era controllabile, anche se i volumi di iniezione più grandi prodotte vesciche più a cupola. Fino a 1 microlitri può essere iniettata senza risultati negativi, tuttavia, è possibile che blebs cupola diventano così estese che i tocchi retina e aderisce alla capsula posteriore della lente, in particolare in topi giovani con bassi volumi vetrose. Nonostante il volume erogato dalla siringa, il volume effettivo mirato allo spazio sottoretinico è calcolato per essere meno. Questo può riflettere volume che non si acquisisce nelle scansioni OCT, in particolare per cupola o Fblebs lat o un artefatto della scansione di Office e successiva ricostruzione, ma possono riflettere la perdita di volume dal riflusso al momento della revoca dell'ago.
In sintesi, utilizzando un approccio posteriore per preparazioni iniettabili sottoretiniche ha minor numero di complicanze e miglioramenti di recupero, con un conseguente alto tasso di successo di targeting e basso tasso di esclusione. Questa tecnica è ideale per le manipolazioni virali, farmacologiche e cellulari di retine roditori.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
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