Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano<i> vía</i> Un enfoque posterior transescleral
Summary
Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.
Abstract
inyecciones subretinales han utilizado con éxito en seres humanos y roedores para realizar intervenciones terapéuticas de proteínas, agentes virales, y las células a la interfotorreceptor compartimento / subretinal que tiene la exposición directa a los fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina (RPE). inyecciones subretinales de plasminógeno, así como los últimos ensayos preclínicos y clínicos han demostrado la seguridad y / o eficacia de la entrega de vectores virales y células madre de individuos con enfermedad de la retina avanzada. Los modelos de ratón de la enfermedad de la retina, distrofias retinianas hereditarias en particular, son esenciales para probar estas terapias. El procedimiento de inyección más común en los roedores es el uso de pequeñas incisiones o transcorneal transescleral con un enfoque anterior a la retina. Con este enfoque, la aguja de inyección penetra en la retina neurosensorial interrumpir el RPE subyacente y en la inserción puede fácilmente nick la lente, haciendo que la opacificación de la lente y el deterioro de Imagi no invasivang. Acceder al espacio subretiniano a través de un transescleral, abordaje posterior evita estos problemas: la aguja atraviesa la esclerótica de aproximadamente 0,5 mm desde el nervio óptico, sin penetración de la retina y evita interrumpir el vítreo. El daño colateral se limita a la asociada con el sclerotomy focal y los efectos de un transitorio, desprendimiento seroso de la retina. La simplicidad del método minimiza la lesión ocular, asegura una rápida reinserción y recuperación de la retina, y tiene una baja tasa de fracaso. El mínimo daño a la retina y RPE permite una clara evaluación de la eficacia y los efectos directos de los propios agentes terapéuticos. Este manuscrito describe una nueva técnica de inyección subretinal que se puede utilizar para dirigir los vectores virales, agentes farmacológicos, las células madre o células madre pluripotentes inducidas (iPS) al espacio subretiniano en ratones con una alta eficacia, un daño mínimo, y una recuperación rápida.
Introduction
Inyecciones subretinales son el medio principal de suministro de agentes celulares y virales para las retinas de ratones para estudiar sus efectos en los fotorreceptores y RPE subyacente 1,2. La mayoría de los protocolos de inyección subretiniana en ratones utilizan una transcorneal o un sitio de inyección transescleral anterior al ecuador (Figura 1). Este enfoque puede resultar en daño colateral inherente que incluye mellar y turbidez resultante de la lente, la alteración de la integridad del vítreo, la penetración de la retina neurosensorial y el iris, hemorragia retiniana, desprendimientos de retina sustanciales y edema subretinal duradera 3-9. Las manipulaciones experimentales deben superar estos efectos con el fin de evaluar los efectos de las intervenciones terapéuticas 3,7,10,11. Este estudio proporciona una descripción detallada y validación de un método de inyección transescleral posterior que evita estas complicaciones, minimiza el trauma y tiene una alta tasa de éxito de la focalización del subespacio de la retina.
Las inyecciones dirigidas al espacio subretiniano en ratones son a menudo muy difícil de realizar y la mayoría de los investigadores se encuentran con una alta frecuencia de intentos fallidos en el que el vector se entrega a una ubicación incorrecta o hay un daño significativo de la retina, por ejemplo, en un desprendimiento de retina completa 6. El número de ojos excluidos del análisis debido a complicaciones de inyección normalmente no se informó en los estudios del ratón, pero en nuestra propia experiencia y en colaboración con otros investigadores, el número de inyecciones fallidas puede ser tan alta como 50% y variar en función de la experiencia y capacidades del investigador que está llevando a cabo las inyecciones. El éxito de la inyección se suele evaluar mediante imágenes de fondo de ojo directa y / o la tomografía de coherencia óptica (OCT) 7,9. Un método fácil de dominar con altas tasas de éxito para inyecciones subretiniana en ratones puede acelerar la experimentación y reducir el costo de los estudios preclínicos de treatments para enfermedades de la retina que son las principales causas de ceguera en los Estados Unidos.
La posterior, técnica de inyección subretiniana transescleral descrito aquí es una adaptación de los protocolos clínicos y preclínicos 9,12. Las evaluaciones de diagnóstico no invasivas realizadas en ratones inyectados demuestran daños leves y muy localizada y carecen de lente de garantías adicionales, lesión de la retina y RPE. Por otra parte, con relativamente poca práctica, un experimentador puede lograr estos resultados con una alta tasa de éxito (80 – 90% o más), lo que reduce los costos asociados con este tipo de estudios. Este procedimiento se puede usar para realizar intervenciones terapéuticas celulares, virales, o farmacológicos a los fotorreceptores y / o RPE en estudios preclínicos y evaluar fácilmente intervenciones experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
inyecciones subretinales son el método de elección para la administración de vectores virales y el tallo terapia derivada de células para la manipulación de fotorreceptores y RPE en la investigación básica y el tratamiento clínico. En los pacientes, las inyecciones subretinal se hacen típicamente con un sclerotomy anterior en la pars plana, una vitrectomía del núcleo posterior y la penetración de la retina por la aguja con visualización directa. Como con la mayoría de procedimientos de vitrectomía, es com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.
Materials
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
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