Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).
Det er for tiden mange kjemiske verktøy tilgjengelig for å innføre kjemiske sonder til proteiner for å studere deres struktur og funksjon. En nyttig metode er proteinkonjugering ved genetisk å innføre en unaturlig aminosyre inneholdende et bioorthogonal funksjonell gruppe. Denne rapporten beskriver en detaljert protokoll for stedsspesifikke antistoff konjugering. Protokollen omfatter eksperimentelle detaljer for genetisk inkorporering av et azid-inneholdende aminosyre, og konjugeringsreaksjonen med strekk fremmet azid-alkyn cykloaddisjon (SPAAC). Denne stamme-fremmet reaksjonen forløper ved enkel blanding av de reagerende molekyler ved fysiologisk pH og temperatur, og krever ikke ytterligere reagenser slik som kobber (I) -ioner og kobber-chelaterende ligander. Derfor vil denne metoden være nyttig for generell proteinkonjugering og utvikling av antistoff-legemiddelkonjugater (ADCs).
Siden den genetiske inkorporering av p-metoksyfenylalanin i Escherichia coli ble rapportert, har 1 mer enn 100 unaturlige aminosyrer (UAAs) blitt innarbeidet i forskjellige proteiner. 1-3 Blant disse UAAs har de aminosyrene som inneholder bioorthogonal funksjonelle grupper blitt grundig studert og utgjør den største andelen. De bioorthogonal funksjonelle grupper anvendt i UAAs omfatter keton, 4-azid, 5 alkyn, 6 cyclooctyne, 7 tetrazine, 8 α, β-umettet amid, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 og bicyklo [6.1.0] -nonyne. 11 Selv om hver funksjonell gruppe har sine fordeler og ulemper, har azidet holdige aminosyrer blitt mest utstrakt bruk for proteinkonjugering. p -Azidophenylalanine (AF), en av de azido-inneholdende aminosyrer, er lett tilgjengelig, og dens inkorporering efficiency er utmerket. Mutante proteiner som inneholder denne aminosyren kan omsettes med alkyner med kobber-katalyserte cykloaddisjon eller med cyclooctynes ved SPAAC. 12-20
Nylig Biopharmaceuticals har vært å tiltrekke stor oppmerksomhet i den farmasøytiske industrien. Det antistoff-legemiddel-konjugatet (ADC) er en klasse av terapeutiske antistoffer som er fordelaktige på grunn av deres evne til målrettet terapi for behandling av kreft hos mennesker 21 og andre sykdommer. Mer enn 50 adjutanter er for tiden i kliniske studier, og antallet er stadig økende. Ved utvikling av ADC, mange faktorer må tas i betraktning for å maksimere effektiviteten og minimalisere bivirkningene. Blant disse faktorene, for en effektiv og stedsspesifikk konjugeringsreaksjonen dannelse av en kovalent binding mellom et antistoff og et legemiddel er kritisk. Den ønskede effektivitet og spesifisitet i konjugeringsreaksjonen kan oppnås ved konjugering med et bioorthogonal funksjonell gruppe i enunaturlig aminosyre som er spesifikt inkorporert i et antistoff. 22-26 Her rapporterer vi en protokoll til site-spesifikt innlemme AF inn i en antistoff-fragment og konjugere den muterte antistoff-fragment med en biokjemisk sonde.
Den genetiske inkorporering av unaturlige aminosyrer i proteiner har flere fordeler fremfor andre metoder som brukes for proteinmodifisering. 1-3 En av de viktigste fordelene er dens generelle anvendbarhet til noen form for protein. I prinsippet er det ingen begrensninger i valg av et målprotein og et målområde av proteinet. Imidlertid kan utskifting av et strukturelt eller funksjonelt viktig rest med en UAA resultere i endring av struktur og funksjon av målproteinet. Vanligvis er rester som er utsatt for…
The authors have nothing to disclose.
1. plasmid Construction | |||
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500g |
Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500g |
2. Culture preparation | |||
2.1) Electroporation | |||
Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1cm electrode gap, pkg. of 50 |
Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25g |
Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
Agar | SAMCHUN | 214230 | 500g |
SOC medium | Sigma | S1797 | 100ML |
3. Expression and purification of HerFab-L177AF | |||
3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1g |
L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100g |
Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500ml |
3.2 Cell lysis | |||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500g |
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1kg |
Sucrose | Sigma | S9378 | 500g |
Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1g |
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25ml |
Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1ml capacity |
Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
5. Purification of Labeled HerFab | |||
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10g |
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10ml |
MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500ml |
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12well |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |